CN110317892A - 不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，包括以下步骤：构建针对不同种属待检球虫的TaqMan实时荧光定量PCR分析方法；采集临床测试球虫样品，并分离出球虫卵囊；进行抗球虫药物临床试验；通过分析药物试验前后样品球虫种群的组成及其所占比例的变化，获得不同种属待测球虫对药物的敏感性结果。本发明的快速检测方法，可以避免传统方法中需要数月才能完成的分离单个球虫的繁琐步骤，仅需几天时间，就能直接获得不同种属球虫的药物敏感性和抗药性试验结果，大大节省工作时间和人力物力，有利于临床球虫病的更好防控。

Description

不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种不同种属球虫对不同抗球虫药物敏感性的快速检测方法及试剂盒。
背景技术
球虫病是由一种或多种球虫寄生于动物肠道等不同部位所引起的，以生长发育迟缓和肠黏膜等严重损伤为特征的寄生虫病。其中，鸡球虫病是由顶复门寄生虫中的艾美耳球虫(Eimeria)引起的一种或数种单细胞寄生原虫寄生于鸡肠道上皮细胞内所引起的疾病，是我国集约化养鸡场最常见的疾病，也是6-10％肉鸡死亡的主要原因，凡是养鸡的地方，就有鸡球虫的存在，每年全世界因鸡球虫造成的经济损失超过30亿美元，我国每年有该病所致的经济损失在50亿人民币以上。
鸡球虫为胞内专性寄生虫，其种类较多，目前大家所公认且最为常见的有7种鸡艾美耳球虫，分别是柔嫩(Eimeria tenella)、毒害(E.necatrix)、和缓(E.mitis)、布氏(E.brunetti)、堆型(E.acervulina)、巨型(E.maxima)和早熟艾美耳球虫(E.praecox)。不同种鸡艾美耳球虫在体内寄生部位、裂殖代数、卵囊形态、致病力和潜伏期等方面都不尽相同，通常E.tenella寄生于鸡盲肠中，E.acervulina和E.maxima主要寄生于十二指肠和小肠前段，E.necatrix寄生于小肠中断，E.mitis和E.praecox分别寄生于小肠前段和十二指肠及小肠前段。而就致病性来说，高致病性的有E.tenella和E.necatrix，中等致病性主要是E.acervulina和E.maxima，而E.brunetti、E.mitis和E.praecox的致病力相对较弱。鸡球虫病的防治主要依赖于饲料中的化学药物的添加，因此也导致了临床耐药虫株的普遍出现和兽药残留的危害风险，据报道，我国养禽业用于防治鸡球虫的费用约占总的禽病防治费用的三分之一。
兔球虫病由寄生于筋道和胆管上皮细胞的艾美耳属球虫引发,主要包括小型艾美耳球虫(E.exigua)、中型艾美耳球虫(E.media)、黄艾美耳球虫(E.flavescens)、大型艾美耳球虫(E.magna),盲肠艾美耳球虫(E.coecicola)、斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)等等，其中斯氏艾美耳球虫呈世界性流行,在我国的感染率和死亡率较高，造成了养兔业的的巨大经济损失。
抗球虫药物主要分为化学合成类和聚醚离子载体类，化学合成类主要有地克珠利Diclazuril、妥曲珠利Toltrazuril、二硝托胺、氯羟吡啶、癸氧喹酯、丁氧喹啉、尼卡巴嗪、氯苯胍、磺胺氯吡嗪、磺胺喹恶啉、氨丙啉、常山酮等。聚醚离子载体类主要有盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、马杜霉素、拉沙罗菌素等。不同的抗球虫药物对不同种属的球虫其本身具有不同的敏感性，如二硝托胺对柔嫩、毒害艾美耳球虫作用较强,对堆型艾美耳球虫的作用较弱，而氨丙林只对柔嫩艾美耳球虫有效等等，同时，球虫的抗药性产生也同样有种属的差异。
临床的球虫感染绝大部分是两种以上不同种属的混合感染，对临床样品进行的抗球虫药物有效性和敏感性试验，其结果通常只是针对混合感染而言，而不能了解对具体不同感染种属球虫的有效性和敏感性。当需要了解药物对具体某一特定球虫种属的抗药性和敏感性时，传统方法必须耗费大量人力物力首先进行球虫种属的分离和鉴定，继而采用分离后的虫种进行感染和相应的药物试验，以确定特定种属球虫的药物有效性和敏感性。该传统方法中，繁琐的球虫单卵囊分离技术，耗时耗力，至少需要数月时间才能完成分离鉴定工作，而且必须一个个虫种进行药物试验，工作量巨大。
发明内容
本发明要解决目前临床检测不同种属球虫对各类药物敏感性的方法步骤繁琐、工作量大的技术问题，提供一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，该方法简单方便，使工作时间和人力物力大为缩减。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，包括以下步骤：
构建针对不同种属待检球虫的TaqMan实时荧光定量PCR分析方法；
采集临床测试球虫样品，并分离出球虫卵囊；
进行抗球虫药物临床试验，设感染用药组、感染不用药组和不感染不用药的健康对照组，感染试验组每个实验动物口服接种所述分离的待测样品的孢子化球虫卵囊，感染用药组饲喂添加抗球虫药的饲料，感染不用药组饲喂无药物添加饲料；
分别收集感染后排卵期间的各组实验动物粪便，并分离收集卵囊和提取基因组，采用所述构建的方法进行相应的荧光定量PCR检测，通过分析药物试验前后样品球虫种群的组成及其所占比例的变化，获得不同种属待测球虫对药物的敏感性结果。
优选的，所述构建TaqMan实时荧光定量PCR分析方法包括以下步骤：
针对不同种属球虫的特异基因设计荧光定量PCR引物对和TaqMan探针；
分别提取不同种属的纯种球虫的基因组，用所述引物对分别扩增出对应球虫的目的基因片段，将该目的基因片段连接到空载体中，形成标准重组质粒；
将分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒，用无核酸酶的水进行10倍倍比稀释，质粒的稀释浓度范围为1×101～1×109质粒拷贝数，然后选出拷贝数是1×102～1×108的8个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应；
反应结束，得到每个拷贝数对应的CT值，计算标准曲线。
更优选的，所述引物对和探针包括下述任意一组或两组以上组合：
引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；
引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；
引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；
引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；
引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；
引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；
引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。
在本发明的另一方面，还提供了一种快速检测不同种属球虫对药物敏感性的试剂盒，所述试剂盒包括：针对不同种属球虫的特异基因设计的荧光定量PCR引物对和TaqMan探针，该引物对和探针包含下述任意一组或两组以上组合：
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所述试剂盒还包括：分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒。优选的，所述标准重组质粒的空载体为pEASY-T1载体。
所述试剂盒还包括：荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。
所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于快速检测不同种属球虫对药物敏感性的引物对和探针组合，包含下述任意一组或两组以上组合：
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在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备快速检测不同种属球虫对药物敏感性的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述引物对和探针组合在制备快速检测不同种属球虫对药物敏感性的产品中的应用。
本发明不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，通过在混合球虫样品的药物有效性和敏感性临床试验过程中，引入待测球虫的荧光定量PCR检测方法，在试验过程中对不同组别的样品进行种群的鉴定和构成比例的定量分析，可以避免传统方法中繁琐分离单个球虫的试验步骤，只需几天时间，就可直接获得不同种属球虫的药物敏感性和抗药性试验结果，与传统方法至少需要数月时间才能完成检测工作相比，大大节省工作时间和人力物力。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明检测方法的流程示意图；
图2是本发明实施例2的E.mitis、E.brunetti和E.praecox重组质粒qPCR扩增曲线图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
球虫的临床感染通常是二种以上不同种属的混合感染，球虫病防治药物的有效性和抗药性是其防治成败的关键性因素，不同种属球虫抗药性的存在，需要方便的实验室临床监测方法进行分析，然而，目前传统方法必须依赖繁琐的病原分离鉴定技术，继而对分离鉴定的虫种进行相关的检测，因此，开发相对简便的实验室检测方法具有实际意义。
本发明运用TaqMan探针荧光定量PCR技术，分别构建针对不同种属球虫的定性定量分析方法，并在传统的抗球虫药物临床有效性和敏感性试验的过程中，对试验前后不同病源的种属组成和相应的数量进行监测和分析，可以在不分离病原的前提下，获得不同种属病原和整体的抗球虫药物有效性和敏感性结果，有利于不同药物有效性和敏感性的科学评估，有利于临床球虫病的更好防控。
实施例1构建针对不同种属待检球虫的定性定量分析方法
一、基因组DNA的提取方法如下：
1、将所需提取基因组的卵囊进行离心(10000rpm，3min)去除重铬酸钾溶液，卵囊沉淀加入适量PBS溶液(PH＝7.4)，离心洗涤3次(3600rpm，5min)；
2、卵囊沉淀中加入等体积的425-600μm玻璃珠和250μL卵囊裂解液，置于高通量组织破碎仪上振荡破壁(60Hz，30s)，待90％以上的卵囊破裂后，再加入250μL卵囊裂解液于离心管中；
3、再向离心管中加入蛋白酶K(20mg/mL)至终质量浓度为100μg/mL，混匀后置于50℃水浴锅中温育3h，并不时旋转混匀；
4、裂解完毕后加入RNaseA(10mg/mL)15μL，于37℃水浴30min；
5、将上述溶液冷却至室温，加入等体积的PCA溶液。轻柔摇动混合两相，使其形成乳浊液，室温下以6000rpm离心15min，小心将上层水相转移到另一新的离心管中，注意不要吸到中间的白色层，或可再次加入等体积的PCA溶液再次抽提；
6、在新的离心管中，加入0.2倍体积的10mol/L醋酸钠及2倍体积的冰冷的无水乙醇，旋转颠倒离心管混匀。在-20℃作用30min以上，然后12000rpm离心管10min，弃去上清；
7、用70％的乙醇洗涤DNA沉淀2次，于37℃或室温干燥，直至乙醇挥发完，加入适量的缓冲液溶解DNA沉淀；提取后的基因组用微量分光光度计进行浓度和质量测定。
二、目的基因扩增：
设计并合成表1所示的荧光定量PCR引物和探针。
提取不同纯种艾美耳球虫基因组，然后根据荧光定量引物探针表和纯种球虫基因组扩增目的基因片段。PCR扩增反应体系(共25μL)为：2×PCR Master Mix 12.5μL；上、下游引物(10μM)1μL；模板(<1μg)2μL；ddH2O 10.5μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，60℃(55℃～)退火30s，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，将扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，用sigma凝胶回收试剂盒纯化回收扩增片段。
表1荧光定量PCR引物和特异性探针表
三、七种鸡艾美耳球虫目的基因重组质粒的构建
将纯化的七种目的基因连接到pEASY-T1Sample Cloning载体上，即将4μL回收的目的片段加到含有1μL载体中，37℃反应5min。然后将连接产物加入到100μL DH5α感受态大肠杆菌(Escherichia coli)中，经过冰浴30min、42℃热激90s、冰浴3min后，再加入不含氨苄的LB培养基，37℃200rpm/min，摇床复苏培养45min。然后将菌液涂布在含氨苄的固体LB培养基上，过夜培养后挑取单菌落，加入50mL含氨苄的LB液体培养基37℃200rpm/min扩大培养。最后使用天根质粒提取试剂盒(Mini Kit)提取质粒，并将部分提取质粒送公司进行测序鉴定。将鉴定正确的阳性质粒，并用紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度并保存于-20℃备用。
四、七种艾美耳球虫重组质粒标准曲线的建立
用微量核酸测定仪测定七种虫株的重组质粒的浓度和纯度后，根据如下公式计算质粒的拷贝数。
质粒拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023((copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)
将构建好的7种艾美耳球虫的重组质粒，分别用无核酸酶的水进行10倍的倍比稀释，质粒的稀释浓度范围为1×101到1×109copies/μL共10个梯度，然后分别选出拷贝数是1×102～1×108的8个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应，每个梯度做3个重复，同时做三个空白对照。反应在ABI7500 fast system PCR仪上进行。
采用20μL荧光定量PCR反应体系即：2×Ace U+ Probe Master Mix(Vazymebiotech)10μL；上、下游引物(10μmol/L)0.4μL；模板2μL；TaqMan探针0.2μL；ROX ReferenceDye 0.4μL；ddH2O 6.6μL。
反应程序为：37℃消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。反应结束后，得到每个拷贝数所对应的CT值。试验结果使用Applied-Biosystem SDS软件处理，然后用EXCEL计算标准曲线，结果如下表2。
表2七种艾美耳球虫重组质粒的标准曲线结果
由表2七种艾美耳球虫重组质粒的标准曲线结果显示，所有标准曲线回归方程的斜率均在3.1～3.5范围内，并且其扩增效率均在90％以上，所有重组质粒标准曲线的R2均在0.99以上，说明定量PCR反应中各种球虫重组质粒稀释模板的对数值与CT值之间呈现良好的线性关系，从表2中可以看出本试验中设置的每个虫种每个梯度的三个重复CT值的SD都小于0.2，进一步说明了荧光定量PCR试验方法的重复性良好，可用于样品中球虫的检测。选用E.mitis、E.brunetti和E.praecox的重组质粒进行验证标准曲线的敏感性，结果发现三个重组质粒标曲的最低检测限均能达到10拷贝(见图2)，相当于一个孢子化的卵囊。
实施例2临床测试样品采集分离
养鸡场中用一次性手套分点采集3-5份新鲜粪便(＞100g)，装于洁净的塑料样品盒中，作标记后带回实验室检查，常规方法检查和分离球虫卵囊，操作如下：
1、取采集的阳性粪便样品以1：9的比例加水充分混匀；
2、先用80目的筛子过滤，再用200目的筛子进行二次过滤，收集滤液；
3、将滤液静置3h，小心将上层液体弃去，留下沉淀；
4、将所得到的沉淀离心(1000g，5min)，弃掉上清；
5、用饱和食盐水按体积比1：5的比例将沉淀充分重悬混匀，然后再次离心(1000g，5min)，此次保留上清，重复该步骤一遍；
6、将多次离心收集的上清液集合，以1：5比例加入自来水，离心(1000g，5min)后弃去上清夜，沉淀即为卵囊；
7、将沉淀重悬于2.5％的重铬酸钾溶液中至卵囊浓度不超过1×106个/ml，置于恒温振荡培养箱(28℃，100-150rpm)中培养，卵囊孢子化需要48-72h；
8、孢子化完毕后镜检观察孢子化情况，收集的卵囊置于2-8℃保存，即为待检临床混合株。
实施例3地克珠利的临床有效性和敏感性检测
地克珠利抗球虫药物的临床有效性和敏感性临床试验，参照农业部抗球虫药物临床试验指南的要求，选用试验鸡为14日龄左右健康鸡，空腹逐只称重，根据体重离散度随机分组，每组10只，试验设感染用药地克珠利组、感染不用药组和不感染不用药组。各感染试验组每只鸡口服接种1.5×105个临床分离的待检样品孢子化卵囊，并按照地克珠利药物的使用说明，将地克珠利1ppm添加于饲料中连续饲喂给药，不用药组饲喂无药物添加饲料，计算抗球虫药物地克珠利的临床有效性评价指标。分别收集感染第6、7、8天的各组小鸡粪便，并按传统方法收集卵囊和提取基因组，采用以上构建的方法进行相应的荧光定量PCR反应，对样品中不同种属的虫株分别进行定性和定量测定。
试验结果见下表3，临床待检样品荧光定量PCR方法发现其含有七种艾美耳球虫，分别是E.necatrix(46.91％)、E.tenella(26.21％)、E.maxima(8.11％)、E.acervulina(11.23％)、E.mitis(3.41％)、E.praecox(2.71％)、E.brunetti(1.42％)。临床药物试验地克珠利1ppm添加于饲料中连续给药，分别检测给药组和感染不给药组的粪便球虫数量和种群的变化，发现其整体的耐药性评判为重度耐药，给药后整体的粪便卵囊大幅度的下降，相对卵囊减少率为35.1％，不给药组的种群比例分别为，E.necatrix(40.11％)、E.tenella(29.28％)、E.maxima(10.02％)、E.acervulina(8.32％)、E.mitis(5.41％)、E.praecox(4.11％)、E.brunetti(2.75％)。给药组种群分别是E.necatrix(5.19％)、E.tenella(32.52％)、E.maxima(12.18％)、E.acervulina(28.33％)、E.mitis(13.24％)、E.praecox(8.54％)、E.brunetti(未检出)，其种群比例发生了明显的变化。由此可知，临床样品所含的混合虫种在鸡体的扩繁过程中变化不明显，但其种群在药物治疗后发生明显的变化，E.brunetti未检出可能是药物相对敏感的结果，此外，从比例变化中可以发现，地克珠利对该样品中的E.necatrix相对敏感，而对于其他的虫种相对不敏感，特别是对高致病性的E.tenella不敏感，可能是表现为重度耐药的主要原因。
表3荧光定量PCR检测受试样品球虫的种群和比例的变化
实施例4聚醚离子类马度米星的临床有效性和敏感性检测
参照农业部抗球虫药物临床试验指南的要求，选用14日龄左右健康鸡，逐只称重标记,随机分组，每组10只，试验设感染用药马度米星组、感染不用药组和不感染不用药组，感染试验组每只鸡口服接种15万临床分离的待检样品孢子化卵囊，马度米星按照使用说明，添加剂量为鸡混饲5mg/kg全价饲料，不用药组饲喂无任何药物添加的全价饲料，计算抗球虫药物临床有效性评价的指标，同时分别收集感染第6、7、8天各组粪便，按传统方法分离收集卵囊，按以上方法分别提取基因组，采用以上构建的方法进行相应的荧光定量PCR反应，对样品中不同种属的虫株分别进行定性和定量测定。
马度米星对临床待检球虫的整体有效性，按指南的评价方法获取，结果见下表4和5。
表4马度米星对临床待检球虫的敏感性和抗药性试验结果
表5试验前后以及药物影响球虫种群的比例变化
临床待检球虫中不同种属对药物马度米星的敏感性，通过对试验过程中不同组别粪便中球虫的进一步荧光定量PCR定性定量分析，结果见上表4和5,从中可以明显看出，球虫的种群和比例在试验前后的变化不明显，但在药物马度米星作用下，给药组的种群比例相对于不给药组的种群比例发生明显的变化，其中E.tenella的平均占比从38.47％下降到6.2％，说明对药物的敏感性高抗药性不明显，E.necatrix平均占比从45.73％下降到38.07％，也有一定程度的下降，说明对药物存在一定敏感性，同时也存在有相当的抗药性，是总体中度以上耐药的原因之一，而E.acervulina的数量相对增高，说明其对药物已经无效，是总体中度以上耐药的主要原因。
通过本实施例可见，通过在药物抗药性敏感性试验过程中引入荧光定量PCR方法对不同待测样品的种群比例分析，能够在获得总体药物抗药性的同时，方便的得知具体的球虫种群组成和不同虫种对药物的敏感性结果，整个实验过程方便快捷，且可以避免虫种分离和不同虫种单独药物临床有效性试验的繁重工作。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法及试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gcagtccgat gaaaggtatt tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gaagcgaaat gttaggccat ct 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
acagtccccg ctgatggtgt aacg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
agcgtgtaat ctgcttttgg aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
tggtcgcaga cgtatattag gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
caaccgcagc aagcgaagtt ga 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
tcgttgcatt cgacagattc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
tagcgactgc tcaagggttt 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
attgtccagc caaggttccc ttcg 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
caaggggatg catggaatat aa 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
caagacgaat ggaatcaatc tg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
cccgcgaggg tttcagttga tg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
aacgccggta tgcctcgtcg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
gtactggtgc caacggaga 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
ccgtagcata gctcaggcag ccac 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
cacatccaat gcgatatagg g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
acagaaaaac gcaaagagca a 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
agcagcagct gcctctcatt gacc 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
tcgtctttgg ctggctattc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
cagagagtcg ccgtcacagt 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
ctggaaagcg tctccttcaa tgcg 24

Claims (10)

1.一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，包括以下步骤：
构建针对不同种属待检球虫的TaqMan实时荧光定量PCR分析方法；
采集临床测试球虫样品，并分离出球虫卵囊；
进行抗球虫药物临床试验，设感染用药组、感染不用药组和不感染不用药的健康对照组，感染试验组每个实验动物口服接种所述分离的待测样品的孢子化球虫卵囊，感染用药组饲喂添加抗球虫药的饲料，感染不用药组饲喂无药物添加饲料；
分别收集感染后的各组试验动物粪便，并分离收集卵囊和提取基因组，采用所述构建的方法进行相应的荧光定量PCR检测，通过分析药物试验前后，样品中球虫种群的组成及其所占比例的变化，获得不同种属待测球虫对药物的敏感性结果。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述构建TaqMan实时荧光定量PCR分析方法包括以下步骤：
针对不同种属球虫的特异基因设计荧光定量PCR引物对和TaqMan探针；
分别提取不同种属的纯种球虫的基因组，用所述引物对分别扩增出对应球虫的目的基因片段，将该目的基因片段连接到空载体中，形成标准重组质粒；
将分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒，用无核酸酶的水进行10倍倍比稀释，质粒的稀释浓度范围为1×101～1×109质粒拷贝数，然后选出拷贝数是1×102～1×108的8个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应；
反应结束，得到每个拷贝数对应的CT值，计算标准曲线。
3.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，所述引物对和探针包括下述任意一组或两组以上组合：
引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；
引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；
引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；
引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；
引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；
引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；
引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述感染试验组每个实验动物口服接种5～20万分离的待测样品孢子化球虫卵囊。
5.一种快速检测不同种属球虫对药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：针对不同种属球虫的特异基因设计的荧光定量PCR引物对和TaqMan探针，该引物对和探针包含下述任意一组或两组以上组合：
引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；
引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；
引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；
引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；
引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；
引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；
引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标准重组质粒的空载体为pEASY-T1载体。
8.一种用于快速检测不同种属球虫对药物敏感性的引物对和探针组合，包含下述任意一组或两组以上组合：
引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；
引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；
引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；
引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；
引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；
引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；
引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。
9.权利要求5至7中任一项所述试剂盒在制备快速检测不同种属球虫对药物敏感性的产品中的应用。
10.权利要求8所述的引物对和探针组合在制备快速检测不同种属球虫对药物敏感性的产品中的应用。
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