KR20130095593A - 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 이를 이용한 스쿠티카충 검출방법 - Google Patents

스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 이를 이용한 스쿠티카충 검출방법 Download PDF

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제주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 스쿠티카섬모충의 cox1 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 이를 이용한 스쿠티카섬모충 검출방법과 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하는 경우 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 동시에 검출할 수 있어서 스쿠티카증 감염여부 및 감염 종을 신속하게 파악할 수 있다.

Description

스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 이를 이용한 스쿠티카충 검출방법{A PRIMER FOR SCUTICOCILIATE AND A METHOD FOR DETECTING SCUTICOCILIATE USING THE SAME}
본 발명은 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 미생물 검출방법에 관한 것이다.
스쿠티카섬모충(scuticociliate)은 원생동물의 섬모류에 속하는 채찍섬모충 목(scuticociliatida order)의 섬모충을 말하며, 스쿠티카충이라고도 한다. 상기 스쿠티카섬모충은 덴마크의 저명한 동물연구가 오토 뮐러에 의하여 1773년에 발견되었다. 그 이후로 스쿠티카섬모충과에 속하는 미생물이 300 종 이상이 확인되었다. 서식지의 넓은 범위를 차지하고 있고, 다양한 구조, 행동 및 생물학적 특성을 가지고 있다. 그들 중에서 일부는 세계적인 양식 산업에서 심각한 기생 위험이 있는 것으로 여겨진다. 스쿠티카섬모충은 감염대상(host)이 되는 해양생물의 내부 기관에 빠르게 침입해서 군체를 형성하여 전체적으로 심각한 감염을 일으켜서, 넙치(Paralichthys olivaceus), 남방 참다랑어(Thunnus maccoyii), 가자미(Scophthalmus maximus), 농어(Dicentrachus labrax) 및 병어(Pampus argenteus)와 같은 어류의 집단 폐사를 야기한다.
넙치(P. olivaceus) 및 볼락(Sebastes schlegelii)은 한국에서 바다 양식 전체 생산량의 70% 이상을 차지하는 것으로 산업적으로 중요한 어종이다. 1990년대 초반에 처음으로 발견된 스쿠티카증(Scuticociliatosis)은 넙치나 볼락 양식에서 중요하고 지속적인 위험 대상으로 대표된다. 상기 스쿠티카증의 원인이 되는 매개체를 분리해서 동정하는데는 수 년이 소요됐다. 상기 스쿠티카증과 연관된 충으로는 유로네마 마리넘(Uronema marinum), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus(syn. Philasterides dicentrarchi)) 등이 보고되어 있다. 또한, 이전의 연구에서 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)가 스쿠티카증에 걸린 볼락(S. schlegelii)에서 동정되었다.
스쿠티카섬모충과 같은 해양 병원성 종은 화학요법제(chemotherapeutant)를 사용하면 빨리 제거할 수도 있으나, 일단 감염대상(host) 에 침입하면 전체적인 감염을 일으키는데, 이를 치료할 수 있는 효과적인 화학요법제가 아직까지는 없다. 또한, 스쿠티카섬모충의 종류에 따라 그 피해 정도가 상이한 특징이 있으므로, 어종에 감염된 원인충을 구별하기 위한 신속한 방법이 요구되나, 아직까지 개발된 것이 없다. 따라서, 상기 스쿠티카증을 효과적으로 방지할 수 있는 일반적이고 더 신속한 방법의 개발이 양식업에서 요구되고 있다.
이러한 요구를 해결하기 위한 첫 번째 단계는 넙치와 볼락에서 스쿠티카증을 유발하는 섬모충의 종을 정확하게 동정하는 것이다. 지금까지 스쿠티카섬모충에서 가장 일반적인 종인 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 동정하는데 형태학적 특성 분석과 리보솜 소단위체 DNA(small subunit ribosomal DNA, SSU rDNA) 분석 방법이 사용되었다. 상기 섬모충의 형태학적 분석이 스쿠티카섬모충을 동정하기 위한 유용한 방법이기는 하지만, 많은 시간과 노력이 소요되고, 특성을 분석하는데 있어서 염색기술에 따라서 미묘한 차이가 잘 보이지 않게 되어 착오를 일으킬 수 있는 단점이 있다. 반면에, SSU rDNA 염기서열 분석 접근은 광범위하게 적용할 수 있는 기술이긴 하나, 연관관계가 가까운 종을 구별하는데 한계가 있다.
상기한 바와 같이, 스쿠티카섬모충은 감염 후 시일이 오래 지나면 치료가 어렵기 때문에, 스쿠티카증에 효과적으로 대응하기 위해서는 스쿠티카섬모충의 감염여부가 신속하게 검출되어야 한다. 특히 스쿠티카섬모충 중에서도 종에 따라 피해 정도가 상이해 지므로, 어느 스쿠티카섬모충에 감염되었는지 종 구분을 신속하게 확인하는 것이 중요하고, 따라서 감염된 스쿠티카섬모충의 종 구분을 신속하고 정확하게 수행할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 검출 키트나 검출방법의 개발에 대한 요구가 증대되고 있다.
KR 10-0846511 B KR 10-0920971 B
이에 본 발명은 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용한 스쿠티카섬모충 검출방법 및 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 실시예에 따른 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머를 제공한다.
상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 것 일 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충은 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum), 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 바람직하게는 상기 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 상기 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 프라이머는 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus) 검출용 프라이머일 수 있고, 상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 바람직하게는 상기 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 상기 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 검출용 프라이머일 수 있으며, 상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 바람직하게는 상기 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 상기 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 검출용 프라이머 일 수 있고, 상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 바람직하게는 상기 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 상기 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 검출용 프라이머 일 수 있다.
또한, 본 발명의 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 것으로 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 동시에 검출할 수 있는 프라이머일 수 있다. 상기 슈도코니렘버스 론지세터스, 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 동시에 검출할 수 있는 프라이머는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 다른 일 실시예에 따라 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 포함하는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출 방법을 제공한다.
상기 스쿠티카섬모충 검출 방법은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 상기 슈도코니렘버스 론지세터스, 슈도코니렘버스 퍼살리너스, 유로네마 마리넘 및 미아미엔시스 아비더스를 동시에 검출할 수 있는 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하는 것일 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충 검출 방법은 상기 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 일 실시예에 따라 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 스쿠티카섬모충을 검출하는 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출키트를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 스쿠티카섬모충의 피해를 줄이기 위하여, 신속하고 간편하게 감염 스쿠티카섬모충을 검출 할 수 있는 방법에 대하여 연구를 수행하여, 동시에 4개 종의 스쿠티카섬모충을 검출 할 수 있는 프라이머 셋트를 발명하였고, 실험을 통하여 동시에 4개의 미생물을 종을 구분하여 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성 하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 스쿠티카섬모충(scuticociliate)을 검출할 수 있는 프라이머에 관한 것이다.
상기 스쿠티카섬모충은 스쿠티카증의 원인이 되는 채찍섬모충 목(scuticociliatida order)에 속하는 섬모충 일 수 있고, 바람직하게는 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum), 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)는 길고 가는 선단과 둥근 후부를 갖고, 서로 평행한 두 개의 막판(membranelle)과 지그재그형의 구연막(paroral membrane, PM)이 구강부에 위치하고 있으며, 9개의 섬모열(kinety), 3번과 4번 섬모열에 두 개의 수축포(contractile vacuole pore, CVP)를 가지고, 한 개의 대핵과 소핵이 세포의 중앙에 위치하는 형태학적 특성을 갖는다.
상기 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)는 둥근 후부를 갖고 있는 방추형이고, 3개의 막판(membranelle, M1, M2 및 M3)과 구연막(PM)이 구강부에 위치하고 있으며, M1과 M2는 서로 평행하고, M3는 PM의 중간에 위치하고 있다. 10개의 섬모열과 한 개의 수축포가 제2 섬모열 후단부에 존재하는 형태학적 특성을 갖는다.
상기 유로네마 마리넘(Uronema marinum)은 뭉툭하고 점차 작아지는 선단과 둥근 후부를 갖고, 3개의 막판(membranelle, M1, M2 및 M3)과 구연막(PM)이 신장의 가운데에 구부기관을 형성하고 있으며, PM이 M2의 중간부까지 신장되어 있고, 섬모열은 11 내지 12개를 가지고, 수축포가 제2 섬모열의 후단부에 위치하고 있으며 한 개의 대핵과 소핵이 세포의 중간에 위치하는 형태학적 특성을 갖는다.
상기 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)는 뽀족한 선단과 둥근 후부를 갖는 두터운 난형으로 3개의 막판(membranelle, M1, M2 및 M3)과 두 개로 나뉘어진 구연막(PM1, PM2)이 구강부에 위치하고 평균적으로 13개의 섬모열을 가지며, 한 개의 수축포가 제2 섬포열 후단부에 위치하는 형태학적 특성을 갖는다.
상기 프라이머(primer)는 사전적으로 특정 유전자 서열에 대하여 상보적인 짧은 단선의 유전자 서열로, DNA 중합효소에 의해 상보적인 유전자 서열이 합성될 때 전체 유전자 서열 중에서 상기 프라이머에서부터 합성이 시작되는 기시점을 의미 할 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 상기 프라이머 쌍을 2개 이상 포함하는 프라이머 세트를 포함한다.
상기 프라이머는 바람직하게는 스쿠티카섬모충의 특이 유전자를 탐지하여 스쿠티카섬모충을 검출할 수 있는 프라이머 쌍 일 수 있고, 상기 특이 유전자는 바람직하게는 스쿠티카섬모충의 cox1 유전자일 수 있다.
상기 프라이머의 더욱 바람직한 형태는 2 종 이상의 스쿠티카섬모충의 검출을 위한 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트 일 수 있고, 바람직하게는 4 종의 스쿠티카섬모충의 cox1 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트 일 수 있다.
상기 4 종의 스쿠티카섬모충은 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum)및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 일 수 있다.
상기 cox1 유전자는 미토콘드리아 시토크롬 c 산화효소 1 유전자(mitochondrial cytochrome c oxidase 1 gene, cox1)를 의미한다. 상기 cox1 유전자의 초가변 영역은 상기 프라이머를 디자인 하는데 이용될 수 있다.
구체적으로 상기 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것 일 수 있다. 상기 서열번호 5 내지 서열번호 12의 프라이머의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
미생물 위치 서열
번호		 명칭 염기서열 (5'- 3') 크기(bp)
P. longisetus 255 5 OX09-148 AAATCAAATCATAGAAATAATAGAGAATTTTTAAATG 341
595 6 OX09-149 GCTCCAACACCAGTATATTTAATG
P. persalinus 254 7 OX09-146 TAAATCTAATCATCGTAATAATAGAGAATTGTTAG 229
482 8 OX09-147 CTTATCGATACGACTAACTGCAT
U. marinum 262 9 OX09-144 AACATAGAGCATATAGAGAGTACTCTAA 285
546 10 OX09-145 TTCATCCAGCTGTTGTTAATGT
M. avidus 258 11 OX09-142 AGTAATAATAGAACATTTAACGAATTTAATAACAC 422
679 12 OX09-143 CGTCTTGTAATTAATAAATTTGTAAACGATAC
상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 구체적으로는 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus) 검출용 프라이머 일 수 있다.
서열번호 5(OX09-148): 5'-AAATCAAATCATAGAAATAATAGAGAATTTTTAAATG-3'
서열번호 6(OX09-149): 5'-GCTCCAACACCAGTATATTTAATG-3'
상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 슈도코니렘버스 론지세터스 검출용 프라이머는 상기 슈도코니렘버스 론지세터스의 cox1 유전자를 인식하여 상기 슈도코니렘버스 론지세터스의 특이 유전자를 약 341bp로 증폭시킬 수 있다. 상기 슈도코니렘버스 론지세터스 검출용 프라이머는 통상적인 중합효소 연쇄반응에 사용될 수 있고, 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)에 사용될 수 있다.
상기 슈도코니렘버스 론지세터스 검출용 프라이머를 상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 상기 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 내지 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나와 함께 상기 다중 중합효소 연쇄반응에 사용하는 경우 각 프라이머 쌍 마다 명확히 구분되는 특정 길이의 절편을 생산하여, 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 종을 구분하여 동시에 검출할 수 있게 되므로, 위해성이 높은 스쿠티카증의 감염 여부 및 상기 스쿠티카증의 감염 종의 종류를 신속하게 알 수 있게 한다.
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 구체적으로는 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 검출용 프라이머 일 수 있다.
서열번호 7(OX09-146): 5'-TAAATCTAATCATCGTAATAATAGAGAATTGTTAG-3'
서열번호 8(OX09-147): 5'-CTTATCGATACGACTAACTGCAT-3'
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 슈도코니렘버스 퍼살리너스 검출용 프라이머는 상기 슈도코니렘버스 퍼살리너스의 cox1 유전자를 인식하여 상기 슈도코니렘버스 퍼살리너스의 특이 유전자를 약 229bp로 증폭시킬 수 있다. 상기 슈도코니렘버스 퍼살리너스 검출용 프라이머는 통상적인 중합효소 연쇄반응에 사용될 수 있고, 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)에 사용될 수 있다.
상기 슈도코니렘버스 퍼살리너스 검출용 프라이머를 상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 상기 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나와 함께 상기 다중 중합효소 연쇄반응에 사용하는 경우 각 프라이머 쌍 마다 명확히 구분되는 특정 길이의 절편을 생산하여, 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 종을 구분하여 동시에 검출할 수 있게 되므로, 위해성이 높은 스쿠티카증의 감염 여부 및 상기 스쿠티카증의 감염 종의 종류를 신속하게 알 수 있게 한다.
상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 바람직하게는 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 검출용 프라이머 일 수 있다.
서열번호 9(OX09-144): 5'-AACATAGAGCATATAGAGAGTACTCTAA-3'
서열번호 10(OX09-145): 5'-TTCATCCAGCTGTTGTTAATGT-3'
상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 유로네마 마리넘 검출용 프라이머는 상기 유로네마 마리넘의 cox1 유전자를 인식하여 상기 유로네마 마리넘의 특이 유전자를 약 285bp로 증폭시킬 수 있다. 상기 유로네마 마리넘 검출용 프라이머는 통상적인 중합효소 연쇄반응에 사용될 수 있고, 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)에 사용될 수 있다.
상기 유로네마 마리넘 검출용 프라이머를 상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나와 함께 상기 다중 중합효소 연쇄반응에 사용하는 경우 각 프라이머 쌍 마다 명확히 구분되는 특정 길이의 절편을 생산하여, 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 종을 구분하여 동시에 검출할 수 있게 되므로, 위해성이 높은 스쿠티카증의 감염 여부 및 상기 스쿠티카증의 감염 종의 종류를 신속하게 알 수 있게 한다.
상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 바람직하게는 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 검출용 프라이머 일 수 있다.
서열번호 11(OX09-142): 5'-AGTAATAATAGAACATTTAACGAATTTAATAACAC-3'
서열번호 12(OX09-143): 5'-CGTCTTGTAATTAATAAATTTGTAAACGATAC-3'
상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 상기 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 미아미엔시스 아비더스 검출용 프라이머는 상기 미아미엔시스 아비더스의 cox1 유전자를 인식하여 상기 미아미엔시스 아비더스의 특이 유전자를 약 422bp로 증폭시킬 수 있다. 상기 미아미엔시스 아비더스 검출용 프라이머는 통상적인 중합효소 연쇄반응에 사용될 수 있고, 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)에 사용될 수 있다.
상기 미아미엔시스 아비더스 검출용 프라이머를 상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍, 상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나와 함께 상기 다중 중합효소 연쇄반응에 사용하는 경우 각 프라이머 쌍마다 명확히 구분되는 특정 길이의 절편을 생산하여, 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 종을 구분하여 동시에 검출할 수 있게 되므로, 위해성이 높은 스쿠티카증의 감염 여부 및 상기 스쿠티카증의 감염 종의 종류를 신속하게 알 수 있게 한다.
상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 동시에 검출할 수 있는 것을 가장 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 일 실시예에 따른 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용한 스쿠티카섬모충 검출 방법에 관한 것이고, 또 다른 일 실시예에 따른 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 포함하는 스쿠티카섬모충 검출키트에 관한 것이다.
상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 상기 스쿠티카섬모충에 대한 기재는 상기 스쿠티카섬모충(scuticociliate)을 검출할 수 있는 프라이머에 관한 기재와 같다.
상기 검출 방법 및 검출 키트는 스쿠티카섬모충에 감염될 수 있는 어류를 대상으로 할 수 있고, 바람직하게는 스쿠티카섬모충에 감염될 수 있는 양식 대상 어종일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 병어, 넙치, 참돔, 돌돔, 농어, 조피볼락, 자주복 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충 검출방법은 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 중합효소를 이용하여 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 유전자를 증폭하는 방법이다. 상기 중합효소연쇄반응은 당업계에서 잘 알려진 방법으로 수행할 수 있고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 한 번에 하나의 표적 유전자만을 증폭하는 단일 중합효소연쇄반응과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)을 포함한다. 상기 다중 중합효소연쇄반응에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
상기 다중 중합효소연쇄반응으로 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하여 스쿠티카섬모충을 탐지하는 경우 각 프라이머 쌍에 따라 증폭하여 생산하는 절편의 길이가 상이하므로, 2 종 이상의 병원성 스쿠티카섬모충을 동시에, 종을 구별하여 검출할 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충 검출방법의 일 예로, 검색 시료를 수득하는 단계, 상기 수득한 검색시료 및 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계 및 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 검색 시료를 수득하는 단계는 어류로부터 스쿠티카섬모충을 분리해낸 뒤, 스쿠티카섬모충의 genomic DNA를 추출하는 방법 또는 어류의 특정 부위에 대하여 임의로 genomic DNA를 추출하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 방법으로 수득한 검색 시료는 중합효소연쇄반응에 사용되는 주형 DNA(PCR template DNA)로 사용될 수 있다. 상기 어류의 특정 부위는 일 예로, 아가미, 궤양소, 뇌, 근육 또는 내장기관 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 주형 DNA로 사용되는 genomic DNA를 추출하는 방법은 통상의 DNA 추출법으로 수행할 수 있으며, 상기 DNA 추출법은 일 예로, 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계는 상기 검색 시료를 주형 DNA로 하고, 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 프라이머로 이용하여, DNA를 증폭하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응 일 수 있고, 일 예로 다중 중합효소연쇄반응 일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계에서 상기 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 것을 바람직하게 사용할 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충 검출방법에서 상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 그리고 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하는 경우 상기 각 프라이머 쌍마다 상이한 특정 길이의 절편을 생산하고, 상기 길이의 차이에 의하여 2 종 이상의 스쿠티카섬모충을 종을 구분하여 동시에 검출할 수 있게 되므로, 위해성이 높은 스쿠티카증의 감염 여부 및 상기 스쿠티카증의 감염 종의 종류를 신속하게 알 수 있게 한다.
상기 중합효소연쇄반응의 반응조건은 상기 중합효소연쇄반응의 종류, 중합효소연쇄반응용 기기의 종류 및 프라이머의 종류에 따라 통상의 반응조건을 선택하거나 적절하게 일부 변형된 조건을 선택될 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응의 반응조건의 일 예로 94 ℃에서 2분 동안 초기변성(pre-denaturation)하고, 증폭과정을 94 ℃에서 30초, 50 ℃에서 30초, 그리고 72 ℃에서 40초 동안 실시하고 최종 연장(final extension)을 72 ℃에서 5분 동안 실시 하는 조건으로 할 수 있으나, 본 발명이 상기 조건에 한정되는 것은 아니다.
상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계는 상기 중합효소연쇄반응의 결과물, 바람직하게는 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하거나 상기 증폭된 DNA 산물이 특정 서열을 가지고 있는 것인지 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
일 예로 해당 프라이머와 검출 대상 스쿠티카섬모충의 유전자를 이용하여 DNA를 증폭할 경우 예상되는 DNA 절편의 크기를 중합효소연쇄반응에서 증폭된 DNA 산물의 크기와 비교하여 확인하거나, 해당 프라이머와 검출 대상 스쿠티카섬모충의 유전자를 이용하여 DNA를 증폭할 경우 예상되는 DNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 중합효소연쇄반응에서 증폭된 DNA 산물의 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 증폭된 DNA 산물의 크기확인은 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 수행할 수 있다.
상기 예상되는 DNA 절편의 크기는 상기 스쿠티카섬모충이 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)인 경우 예상되는 DNA 증폭산물의 크기는 341bp, 상기 스쿠티카섬모충이 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)인 경우 예상되는 DNA 증폭산물의 크기는 229bp, 상기 스쿠티카섬모충이 유로네마 마리넘(Uronema marinum)인 경우 예상되는 DNA 증폭산물의 크기는 285bp, 그리고 상기 스쿠티카섬모충이 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)인 경우 예상되는 DNA 증폭산물의 크기는 422bp일 수 있다.
상기 스쿠티카섬모충 검출키트는 상기 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 스쿠티카섬모충 검출키트는 상기 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머 및 중합효소연쇄반응을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 검출 키트의 일 예로, 상기 스쿠티카검출용 프라이머는 상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, Taq DNA 중합효소(polymerase)을 포함하는 2X PCR Master Mix; 및 주형 DNA 즉, 어류로부터 분리된 스쿠티카섬모충의 genomic DNA 또는 어류의 특정 부위의 genomic DNA인 시료 DNA를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 일 예로 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR)용 기기 또는 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR)용 기기 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중합효소연쇄반응용 혼합물(Mixture)은 상기 중합효소연쇄반응용 기기에 따라 적절한 조성으로 제조될 수 있다. 상기 혼합물의 일 예로, 각 프라이머 쌍 5 pmol, LA Taq 중합효소(Takara) 2.5 U, 염화마그네슘 2.5 mM 및 4 ㎕ dNTPs에 주형 DNA 즉, 유전체 DNA 각 12.5 ng을 포함하는 조성으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 스쿠티카 목에 속하는 4종의 스쿠티카섬모충을 신속하고 정확하게 검출하기 위한 것으로, 해양생물체로부터 분리된 스쿠티카섬모충의 cox1 유전자의 염기서열을 분석하고, 상기 염기서열을 이용하여 신속하게 각 스쿠티카섬모충의 종을 구분하여 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였고, 상기 프라이머를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 통해 신속하게 2 종 이상의 스쿠티카섬모충의 종을 구분하여 검출할 수 있다.
도 1은 4 개 종의 스쿠티카섬모충 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus , GQ500580), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus , GQ500579), 유로네마 마리넘(Uronema marinum , GQ500578) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus, GQ855300)의 cox1 유전자의 뉴클레오티드 염기서열 얼라인을 나타내는 그림이다. 밑줄쳐진 염기서열은 일반적으로 사용되는 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 검은색으로 하이라이트된 흰색 글씨의 염기서열이 유전자 다중증폭(multiplex PCR)에 사용된 8개의 종-특이적 프라이머 염기서열을 나타낸다.
도 2는 cox1 유전자의 계통수를 나타낸다. 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)(GenBank GQ500580), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)(GenBank GQ500579), 유로네마 마리넘(Uronema marinum)(GenBank GQ500578) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)(GenBank GQ855300) 종은 염기서열이 밝혀졌다. 각각의 마디의 수는 1000 유전정보에 대한 부트스트랩 퍼센테이지를 나타낸다.
도 3은 새롭게 개발된 프라이머를 이용하여 스쿠티카섬모충 종을 구분하여 동정하는 유전자 다중증폭(multiplex PCR)의 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1 및 레인 7은 분자량 마커를 나타내고, 레인 2는 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)의 종-특이적 절편, 레인 3은 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 의 종-특이적 절편, 레인 4는 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus) 의 종-특이적 절편, 레인 5는 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)의 종-특이적 절편을 나타낸다. 레인 6은 혼합된 샘플에서 4개 종의 동시에 감지한 것을 나타낸다.
하기 실시예는 본발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다
실시예1 . 섬모충의 분리 및 기내 배양
2002년부터 2005년 까지 대한민국 제주도의 어류 양식장에서 양식되는 넙치와 볼락 중에서 스쿠티카증에 감염된 넙치와 볼락의 뇌와 아가미 조직으로부터 스쿠티카섬모충(Scuticociliates)을 분리하였다. 보다 구체적으로 볼락(S. schlegelii)으로부터 균주 1을 분리하고, 넙치(P. olivaceus)로부터 균주 2 내지 균주 4를 분리하여, 총 4개 종의 섬모충을 분리하였다. 분리된 섬모충은 1% 효모 추출물(yeast extract)과 1% 프로테오스 펩톤(proteose peptone)을 포함하는 살균된 해수에서 15 ℃로 초대배양(primary culture)을 하였다. 5일 배양 후, 96-well 조직-배양 플레이트의 각 웰(well)에 싱글(single) 섬모충만 남을 때까지 상기 초대 배양물을 연속 희석하여 섬모충을 여러 번 복제하고, 상기 복제된 섬모충을 두 가지 종류의 배지1 및 배지2 에서 각각 배양하였다.
상기 배지1은 Millport S로, 증류수 100 ml 당 1.5g NaCl, 0.25g MgCl2 ·6H2O, 0.04g KCl, 0.012g CaSO4 그리고 비브리오 속(Vibrio sp.)의 2% brain heart infusion broth(final concentration of 0.5%)으로 구성하였다.
또한 상기 배지 2는 Eagle's MEM로 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제로 암피실린(ampicillin) 100 IU/ml와 100 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin) 그리고 왕연어 배아-214 세포(Chinook salmon embryo-214, CHSE-214)로 구성하였다.
실시예2 . 분리된 섬모충의 동정 - 형태학적 특성
상기에서 분리된 4개 종의 섬모충을 동정하기 위하여 형태학적 특성을 분석하였다. 상기 분석은 통상적으로 사용되는 질산은 함침법(silver nitrate impregnation method)과 탄산은 함침법(silver carbonate impregnation method)을 사용하여 실시하였다.
보다 구체적으로 질산은 함침법과 관련하여, 섬모충류(ciliates)를 2000 rpm 속도로 5분 동안 원심 분리하여 농축하고, Champy's fixative로 고정한 후에 DaFano's fixative로 세척하였다. 글라스 슬라이드는(glass slide)는 슬라이드 워머(slide warmer) 위에서 35 내지 45 ℃로 데운 후, 상기 섬모충 농축물 한 방울과 녹인 젤라틴을 데워진 슬라이드 위에 떨어뜨렸다. 상기 슬라이드 상의 액체상태의 시료를 냉각하여 고체화한 후, 증류수로 헹구었다. 슬라이드를 차가운 1% 질산은 용액에 담가 30분 동안 인큐베이트 하고, 그 다음 차가운 증류수로 세척한 후, 슬라이드의 시료가 금색 또는 갈색으로 변할 때까지 10 내지 15 분 동안 자외선(<254 nm)을 조사하였다. 그 후, 상기 시료를 30%, 70% 및 100% 알코올로 탈수 시키고, 자일렌(xylene)으로 제거하고 고정하였다.
또 탄산은 함침법과 관련하여, 상기 섬모충 농축물을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고, Fernandez-Galiano's 용액에서 염색하였다. 상기 염색은 60 ℃로 예열 된 핫플레이트 위에서 상기 용액이 황금갈색으로 변할 때까지 5분 동안 실시하였다. 5% 싸이오황산나트륨(Na2S2O3)을 가하여 상기 반응을 종결시켰다.
상기 각각의 방법에 의하여 염색된 섬모충을 광학현미경, 접안 마이크로미터와 이미지-분석 소프트웨어(Image-Pro Plus 3.0, USA)를 이용하여 형태학적 특성을 측정 및 분석하였다.
상기 분리된 섬모충의 형태학적 분석 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 상기 형태학적 특성을 공지의 균주와 비교하여 본 결과, 균주 1은 Thompson(1965)과 Whang et al.(2011)에 공지된 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)와 유사하여 상기 균주로 추정하였고, 균주 2는 Evans & Corliss(1964), Song(2000) 및 Whang et al.(2011)에 공지된 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)와 유사한 특성을 나타태어 상기 균주로 추정하였다. 균주 3은 Thompson(1964), Cheung et al.(1980) 및 Ma et al.(2004)에 공지된 유로네마 마리넘(Uronema marinum)와 유사하여 상기 균주로 추정하였고, 균주 4는 Thompson & Moewus(1964), Dragesco et al.(1995) 및 Jung et al.(2007)에 공지된 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)와 유사한 특성을 나타내어 상기 균주로 추정하였다.
특성 균주 1 균주 2 균주 3 균주 4
신체용적 길이 34.4 (30.6-39.2)±2.07 (n=35) 26.6 (21.8- 32.4)±2.40 (n=32) 26.2 (19.5-32.8)±2.64 (n=40) 37.9 (32.7-43.9) ±2.67 (n=39)
너비 12.7(10.8-14.9)±0.92 (n=35) 13.8 (11.2-16.1)±1.34 (n=32) 12.2 (8.8-16.3)±1.30 (n=40) 24.4 (19.6-28.8)±2.35 (n=39)
Somatic ciliature Kinety 개수 9 (9-10)±0.33 (n=30) 10 (9-10)±0.18 (n=30) 12 (11-13)±0.64 (n=25) 13 (12-14)±0.61 (n=34)
caudal cilium 길이 14.3 (13-15.5)±0.79 (n=10) 12 (11.1-13.6)±0.77 (n=13) - 9.2 (6.5-11.4)±1.28 (n=30)
Oral ciliature
 M11 )의 길이 8.2 (6.8-9.2)±0.58 (n=31) 7.6 (6.6-8.7)±0.63 (n=28) 2.0 (1.4-2.9)±0.37 (n=29) 3.3 (2.8-4)±0.27 (n=30)
M21 )의 길이 13.9 (11.7-16.1)±1.19 (n=31) 12 (10.5-15.1)±0.85 (n=27) 1.7 (1.3-2.2)±0.24 (n=27) 3.3 (2.8-3.9)±0.28 (n=30)
M31 )의 길이 - 0.5 (0.4-0.7)±0.12 (n=18) 1.4 (0.9-1.7)±0.20 (n=20) 0.8 (0.5-1.2)±0.19 (n=30)
구연막(PM)2 ) 7.6 (6.2-9.5)±0.77 (n=25) 6 (4.7-7.8)±0.78 (n=30) 7.3 (5.7-8.7)±0.67 (n=30) 4.9 (4.1-6.1)±0.50 (n=29) (PM1)
5.8 (4-7.4)±0.79 (n=27) (PM2)
buccal field 길이3 ) 17.6 (15.6-19.9)±1.16 (n=22) 15.8 (14.2-16.8)±0.70 (n=18) 17.9(14.6-20.7)±1.49 (n=32) 16.5 (14.6-18.5)±1.10 (n=34)
수축액포(CVP)4 ) 개수 2 1 (1-2) 1 1
위치 End of kinety 3 & 4 End of kinety 3 (kinety 3 & 4) End of kinety 2 End of Kinety 2
지역 Jeju, Korea Jeju, Korea Jeju, Korea Jeju, Korea
1) M1,2,3: 막판(membranelles) 1, 2, 3
2) PM: 구연막(paroral membrane)
3) buccal field 길이: 구연막의 apex에서 posterior end까지의 거리.
4) CVP: 수축액포(Contractile vacuole pores)
실시예3 . 분리된 섬모충의 동정 - SSU rDNA 분석
상기에서 분리된 각 섬모충에 대한 형태학적 동정이 맞는지 확인하기 위하여 SSU rDNA 염기서열 분석을 수행하였다. 배양된 섬모충(ciliates)을 원심 분리(1000×g, 10 분)하고, 살균된 해수로 세척하였다. DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, Dusseldorf, Germany)를 이용하여 유전체 DNA(Genomic DNA)를 추출하고, SmartSpec Plus Spectrophotometer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 총 유전체 DNA의 농도를 측정하였다. SSU rDNA를 증폭하기 위하여, GenBank에 등록된 스쿠티카섬모충의 SSU rDNA 염기서열(accession number Z22881 Uronema marinum, AY103190 Uronema elegans 및 U83128 Uronema acuminata)을 기초로 프라이머를 디자인하였다(표 3). PCR은 각 프라이머 20 pmol, Ex Taq 중합효소(Takara, Shiga, Japan) 2.5 U 및 유전체 DNA 50 ng을 포함하는 50 ㎕ PCR 반응 혼합물에서 실시하였다. Takara PCR Thermal cycler(TP650)를 사용하여 95 ℃에서 5분 동안 초기변성(pre-denaturation)하고, 다음으로 증폭과정(amplication)을 95 ℃에서 30초, 55 ℃ 에서 30초 그리고 72 ℃에서 2분 동안 수행하고 상기 과정을 30번 반복하였다. 상기 반응의 반응물을 1% 아가로스에서 전기영동으로 분석하고, AccuprepTM Gel 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용해서 정제하였다. 부분적인 염기서열 분석은 정방향과 역방향으로 ABI 377 DNA sequencer(Applied Biosystems by Life Technologies, USA) 장비로 분석하였고, 키트는 standard ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하였으며, 그 방법은 상기 키트 및 장비의 사용방법에 따랐다. 상기 분석을 통하여 새롭게 서열이 밝혀진SSU rDNA 유전자를 GenBank/EMBL 데이터베이스의 염기서열과 비교하였다. 보다 구체적으로은 P, persalinus SSU rDNA(AY835669), 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus) SSU rDNA(FJ899594), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) SSU rDNA(DQ867072) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) SSU rDNA(AY550080)와 비교하였다.
프라이머 염기서열(5'-3')
정방향(SSUF) 5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'
역방향(SSUR) 5'-GATCYWTCTGCAGGTTCACCTAC-3'
상기 분리된 섬모충 각각은 균주 1이 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus , FJ899594), 균주 2가 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus , AY835669), 균주 3이 유로네마 마리넘(Uronema marinum, DQ867072) 및 균주 4가 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus , AY550080)의 보관된 염기서열에 대하여 100%, 99.8%, 100% 그리고 100% 상동성을 보였다.
따라서 상기에서 분리된 섬모충은 형태학적 분석의 결과와 동일하게, 균주 1이 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 균주 2가 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 균주 3이 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 그리고 균주 4가 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 임을 확인 하였다.
실시예4 . cox1 유전자의 PCR 및 염기서열 분석
테트라히메나 테모필라(Tetrahymena thermophila , GenBank accession numbers AF396436)와 짚신벌레(Paramecium aurelia , NC_001324)의 cox1 유전자의 얼라인 시퀀스를 이용하여 하기의 프라이머1 내지 2를 디자인 하였다(표 4). 디제너레이트 PCR 프라이머 MOU08-121과 MOU08-122를 디자인 하는데 상응하는 뉴클레오티드 포지션을 이용하였다(표 4). PCR반응은 각 프라이머 10 pmol, LA Taq 중합효소(Takara) 0.5 U 및 유전체 DNA 50 ng을 포함하는 50 ㎕ PCR 반응 혼합물에서 실시하였다. PCR은 94 ℃에서 2분 동안 초기변성(pre-denaturation)하고, 다음으로 증폭과정을 94 ℃에서 30초, 50 ℃ 에서 30초, 그리고 72 ℃에서 2분 동안 수행하고 상기 단계를 30번 반복하였다. 증폭 산물은 1% 아가로스에서 전기영동으로 분석하였다.
프라이머 1 내지 2를 이용하여 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)로 부터 길이가 945bp로 예상되는 강한 PCR signal을 생산했으나, 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)로부터는 생산하지 못했다. 따라서 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)를 포함하는 상기 4개 모든 종으로부터 PCR 산물을 생산할 수 있는 새로운 프라이머 세트를 만들 필요가 있으므로, 3개 종의 PCR 산물을 제거하고 Accuprep Gel 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 산물을 각각 pGEM®-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하고, 이를 이용하여Escherichia coli DH5 cells (Stratagene/Agilent, Inc., USA)를 전환하였다. AccuprepTM 플라스미드 추출 키트를 이용하여 알칼라인 라이시스법(alkaline lysis method)을 이용하여 재조합 플라스미드를 준비하고, 일반적인 프라이머 M13F-pUC(-40) 및 M13R-pUC(-40)를 사용하여 부분적인 염기서열을 확인 하였다. 상기에서 확인된 염기서열에 근거하여, 하기의 프라이머 3(OX09-26) 내지 4(OX09-27)를 디자인 하였다. OX09-26 및 OX09-27는 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 및 유로네마 마리넘(Uronema marinum)로 부터 716bp 그리고 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)로 부터 719bp 길이의 미토콘드리아 cox1 유전자 절편을 증폭시킬 수 있을 것으로 예상하였다(표 4). PCR 조건은 94 ℃에서 2분 동안 초기변성(pre-denaturation)하고, 다음으로 증폭과정을 94 ℃에서 30초, 48 ℃에서 30초 그리고 72 ℃에서 1분 동안 실시하고 상기 과정을 30번 반복하였고, 72 ℃에서 5분 동안 최종 연장(final extension)을 실시 하였다. cox1과 SSU rDNA 염기서열은 ClustalW web-based query program(v1.80)을 이용하여 얼라인 하였다. Kimura two-parameter (K2P) distance model을 이용하여 cox1과 SSU rDNA 염기서열에 대한 염기서열 차이를 측정하였다. MEGA(v4)를 이용한 sequence evolution의 K2P모델로 측정된 cox1 염기서열의 추정 유전적 거리를 기초로 neighbor-joining(NJ) 계통수를 작성하였다. NJ 계통수에서 신뢰추정(confidence estimate)은 1000개 유전정보(replicates)의 부트스트랩 제너레이션(bootstrap generation)을 통해서 결정하였다.
프라이머 위치 염기서열 (5'-3') 크기(bp)
1 MOU08-121 119 of T. thermophila cox1 TCAGGAGCTGCMTTAGCHACYATG 945
2 MOU08-122 1143 of T. thermophila cox1 TARTATAGGATCMCCWCCATAAGC
3 OX09-26 278 of T. thermophila cox1 GDTAYTTACAAGTWATTACYGCWCATGG 716,
M. avidus는 719
4 OX09-27 993 of T. thermophila cox1 TAAAACYCTYCTATGYCTCATACC
cox1-특이적 증폭 프라이머인 프라이머 3(OX09-26)과 프라이머 4(OX09-27)는 분리된 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)로부터 길이 720bp이하의 단일 DNA 밴드를 생산하였다. 각 PCR 산물을 복제하고, 예상 분자량을 확인하기 위하여 클론의 PCR 스크리닝을 하고, 클론을 선발하여 서열을 밝혔다.
슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 및 유로네마 마리넘(Uronema marinum)에서 얻어진 염기서열은 716bp(프라이머 52bp를 제외하고 정확하게 664bp) 이고(도 1), GenBank에 기탁하여 각각에 대한 기탁번호(accession numbers) GQ500580, GQ500579 및 GQ500578를 부여 받았다.
미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)의 부분적인 cox1 염기서열은 719bp(프라이머 52bp를 제외하고 정확하게 667bp) 이고, GenBank에서 기탁번호 GQ855300를 부여받았다. 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)의 cox1 염기서열은 공지된 염기서열(GenBank EU831221)과 99.7% 상동성을 보였다.
cox1 유전자 사이의 평균 염기서열 차이는 23.5% 였고, 범위는 18.8에서 27.5% 였다(표 4). 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)의 cox1 유전자의 진화적 위치를 확인하기 위하여 계통발생수를 작성하여 도 2에 나타내었다.
실시예5 . 다중 중합효소연쇄반응( multiplex PCR )
cox1 염기서열 비교 데이터를 기초로, 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 구별할 수 있는 새로운 종-특이적 프라이머 세트를 만들기 위한 초가변영역을 선택하였다.
정방향 프라이머는 cox1 유전자의 종-특이적 지역에서 set 시작점 염기서열 세트에 상보적인 반면에, 역방향 프라이머는 각각의 프라이머가 다른 길이의 최종 PCR 절편을 생산하도록 디자인하였다. 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 염기서열과 위치는 하기의 표 5와 같다.
미생물 위치 서열
번호		 명칭 염기서열 (5'-3') 크기(bp)
P. longisetus 255 5 OX09-148 AAATCAAATCATAGAAATAATAGAGAATTTTTAAATG 341
595 6 OX09-149 GCTCCAACACCAGTATATTTAATG
P. persalinus 254 7 OX09-146 TAAATCTAATCATCGTAATAATAGAGAATTGTTAG 229
482 8 OX09-147 CTTATCGATACGACTAACTGCAT
U. marinum 262 9 OX09-144 AACATAGAGCATATAGAGAGTACTCTAA 285
546 10 OX09-145 TTCATCCAGCTGTTGTTAATGT
M. avidus 258 11 OX09-142 AGTAATAATAGAACATTTAACGAATTTAATAACAC 422
679 12 OX09-143 CGTCTTGTAATTAATAAATTTGTAAACGATAC
PCR 반응은 각 프라이머 5 pmol, LA Taq 중합효소(Takara) 0.25 U, 염화마그네슘 2.5 mM 및 4 ㎕ dNTPs(각2.5 mM)에 단일 PCR을 하는 경우 주형 DNA 25 ng을 포함하고, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 하는 경우 주형 DNA 12.5 ng을 포함하는 25 ㎕ PCR 반응 혼합물(PCR Mix)에서 실시하였다. PCR 반응 조건은 94 ℃에서 2분 동안 초기변성(pre-denaturation)하고, 증폭과정을 다음으로 94 ℃에서 30초, 50 ℃에서 30초, 그리고 72 ℃에서 40초 동안 실시하고 상기 단계를 30번 반복하였고, 72 ℃에서 5분 동안 최종 연장(final extension)을 실시하였다. 증폭 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기 영동으로 분석하였고, 절편이 크기는 Takara 100 bp DNA Ladder와 비교하여 알아냈다. PCR 산물의 사이즈는 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)는 229bp, 유로네마 마리넘(Uronema marinum)는 285bp, 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)는 341bp 그리고 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)는 422bp 였다.
슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus)에 특이적인 프라이머인 서열번호 7(OX09-146) 및 서열번호8(OX09-147)의 프라이머 쌍은PCR 산물은 229bp를 나타냈다(도 3, 레인 2).
유로네마 마리넘(Uronema marinum)에 상보적인 PCR 산물은 285bp이고, 서열번호 9(OX09-144) 및 서열번호10(OX09-145)의 프라이머 쌍을 이용하였다(도 3, 레인 3).
슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus)에 특이적인 정방향 프라이머로 서열번호 5(OX09-148) 및 역방향 프라이머로 서열번호 6(OX09-149)의 프라이머 쌍을 이용한 경우 산물은341bp의 절편을 생산하였다(도 3, 레인 4).
미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 특이적인 프라이머인 서열번호 11(OX09-142) 및 서열번호 12(OX09-143)의 프라이머 쌍은 422bp 절편을 생산하였다(도 3, 레인 5).
4개 종의 DNA가 혼합된 시료를 단일 반응에서 상기 각 프라이머를 같은 양의 몰로 사용하여 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)법으로 분석한 결과, 명확히 구별되는 4개의 PCR 산물을 얻었다. 상기 프라이머 세트를 이용하는 경우 특정 절편 길이에 근거하여, 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 한 번의 탐지를 수행하여 구분할 수 있음을 확인 하였다(도 3, 레인 6). 상기 프라이머 셋트를 이용하여 상기 스쿠티카섬모충의 감염여부 및 감염종을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는바, 양식업에 문제가 되는 스쿠티카증의 진단을 신속하게 하여 어류의 집단폐사를 막을 수 있을 것이다.
<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A PRIMER FOR SCUTICOCILIATE AND A METHOD FOR DETECTING SCUTICOCILIATE USING THE SAME <130> DP20120012 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 664 <212> DNA <213> Pseudocohnilembus longisetus <400> 1 tttaattatg gtattttttg ttgttgtacc tttaattttt ggtgcttttg caaatttttt 60 aattccttac catatcggtt ctaaagacgt agcataccca cgtttgaata gtattggttt 120 ttgaattcaa ccttgtggtt ttattttagt atcaaaaatt gcctttttaa gacctcaata 180 ttgaagatat tacgataaag tagcatatta ttttcctttg ttaagcaaat caaatcatag 240 aaataataga gaatttttaa atgaaaatcc tttacaattg caagcattga aaaggtattt 300 agtagacgac catactattt catttaaacc taaggtttca actaaataca gtgattatga 360 taactattca ggtttaccat gaaaattatt actttgaaaa gatatcgtta attatccaga 420 atctttttgg tatgtagtta gtcgtattga taaagtaagg cgtaaaaagg tttattttac 480 aaaatgttct aacagagttt taactacagc aggttgaact tttattaccc cattctcatc 540 taacattaaa tatactggtg ttggagctca ggatttatta ttagtttctg ttgtttttgc 600 tggtttaagc tctactgttt cttttactaa tttattaatt accagaagaa ctttatgtat 660 gcct 664 <210> 2 <211> 664 <212> DNA <213> Pseudocohnilembus persalinus <400> 2 ccttattatg gtatttttcg ttgttgtacc tataatattt ggtgcttttg caaatttttt 60 aatcccatac catatcggtt caaaagacgt agcttaccca cgtttaaata gtatcggttt 120 ttgaattcaa ccatgtggtt ttattttagt atcaaaaata gcttttttaa ggccacaata 180 ttgaagatac tacgataaag tctcttacta ttttccatta ctaagtaaat ctaatcatcg 240 taataataga gaattgttag gtgataatcc attccaacta caagctttaa aaagatattt 300 agtcgacgaa catactattt ttttcaaacc taaaattaaa tcaaaatatt cagattatga 360 aaattattca ggattacctt gaaaattatt attatgaaag gatatagtaa attatcctga 420 atctttttga tatgcagtta gtcgtatcga taaggttaga cgtaagaaag tatactttac 480 taagtgttct aatagaacat taacaactgc tggttgaaca ttcattactc cattttcatc 540 taatacaaaa tatacaggtg taggtgcaca agacttatta cttgtttcag tagtgtttgc 600 tggacttagc tcaactgttt cttttacaaa tttattaatt acaagaagaa cattgtgtat 660 gcct 664 <210> 3 <211> 664 <212> DNA <213> Uronema marinum <400> 3 tttaattatg gtattttttg tagttgttcc tattattttt ggagcatttg ctaatttttt 60 aataccttac catattggtt caaaagatgt agcataccca agattaaata gtatagcttt 120 ttgaattcaa ccttgtggtt ttattttagt agctaaaatt gctttcttaa ggcctcaatt 180 ttgaaggtat tatgataaaa cagcttatta ctttccttta ttagataggg gtcaacatag 240 agcatataga gagtactcta atgaaaatat ttttcaattt agagctttaa aaagatacgt 300 tttagatgag cattcattat tctgaaaagc taaaacaaaa gaaaaattta gtaactattc 360 tgattattct ggaattcctt taaaattatt attttgaaaa gatgttatta attatccgga 420 atcattttga tatgtagtta gccgtattaa taaagtaaga cgtaaaaaag tatactttac 480 aaaatgttct aatagaacat taacaacagc tggatgaact tttattacac ctttctcatc 540 taatatcaaa tatacaggta ttggagctca agatttatta ttagtaggag tagtttttgt 600 aggaattagt tctacaactg gttttactaa tttattaatt acaagaagaa ctctatgtat 660 gcca 664 <210> 4 <211> 667 <212> DNA <213> Miamiensis avidus <400> 4 tttaattatg gtattttttg atgtagttcc tgttattttt ggggcttttg caaatttttt 60 aataccgtac catattggtt ctaaagatgt ggcttaccct agactaaata gtataggttt 120 ttgaattcaa ccttgtggtt ttattttagt atctaaaata gcatttttaa ggccacaata 180 ctgaagatac tatgataaag cttcttacta ttttccttta cttgataaaa gtaataatag 240 aacatttaac gaatttaata acactaataa catttttcag tttagagcat tacaaaggta 300 tgctttagac gaacatacgc tattttgaaa acctaaacta acaaataaat atacaaatta 360 tgaaaattat tctggaattc ctttaaaatt attattttga aaagatatta ttaactaccc 420 agaatctttt tgatacgttg taagtcgtat taatagagta cgtagaaaaa aagtatattt 480 tactaaatgt tctaacagaa ccttaactac agctggttga acttttatta caccatttgc 540 atcaaatgta aaatatacag gtattggtgc tcaagattta ctattagtat cagttgtttt 600 tgctggtatt agttctacag tatcgtttac aaatttatta attacaagac gtactttatg 660 tatgcct 667 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. longisetus cox1 F-primer <400> 5 aaatcaaatc atagaaataa tagagaattt ttaaatg 37 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. longisetus cox1 R-primer <400> 6 gctccaacac cagtatattt aatg 24 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. persalinus cox1 F-primer <400> 7 taaatctaat catcgtaata atagagaatt gttag 35 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. persalinus cox1 R-primer <400> 8 cttatcgata cgactaactg cat 23 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U. marinum cox1 F-primer <400> 9 aacatagagc atatagagag tactctaa 28 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U. marinum cox1 R-primer <400> 10 ttcatccagc tgttgttaat gt 22 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. avidus cox1 F-primer <400> 11 agtaataata gaacatttaa cgaatttaat aacac 35 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. avidus cox1 R-primer <400> 12 cgtcttgtaa ttaataaatt tgtaaacgat ac 32

Claims (11)

  1. 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
    서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
    서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
    서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스쿠티카섬모충은 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum), 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus) 검출용 프라이머인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus) 검출용 프라이머인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 검출용 프라이머인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus) 검출용 프라이머인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  7. 서열번호 5의 염기서열을 이루어진 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 7의 염기서열을 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍
    으로 이루어진 슈도코니렘버스 론지세터스(Pseudocohnilembus longisetus), 슈도코니렘버스 퍼살리너스(Pseudocohnilembus persalinus), 유로네마 마리넘(Uronema marinum) 및 미아미엔시스 아비더스(Miamiensis avidus)를 동시에 검출할 수 있는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 스쿠티카섬모충 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 포함하는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 스쿠티카섬모충 검출 방법은 상기 제7항에 따른 프라이머를 이용하는 것인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 스쿠티카섬모충 검출 방법은 스쿠티카섬모충을 탐지하는 단계를 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)으로 수행하는 것인 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출 방법.
  11. 제1항에 내지 제7항에 따른 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출용 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 스쿠티카섬모충(scuticociliate) 검출키트.
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