KR102254461B1 - 미아미엔시스 아비두스 유전형 판별용 조성물 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종래 어류의 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus)에 의한 스쿠티카병의 원인이 되는 기생충의 유전형을 판별하기 위하여 시퀀싱 방법을 이용하던 불편함을 해소하고자 고안된 것으로, 미아미엔시스 아비두스 미토콘드리아의 일부 핵산 서열을 특이적으로 증폭함으로써 1회의 PCR 반응으로 미아미엔시스 아비두스 유전형 I과 II를 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 장점이 있다.

Description

미아미엔시스 아비두스 유전형 판별용 조성물 및 키트 {Composition and Kit for discrimination of Miamiensis avidus genetic type}

본 발명은 미아미엔시스 아비두스 유전형 판별용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 더 상세하게는 미아미엔시스 아비두스의 유전형 I과 유전형 II를 1 회의 PCR 반응으로 간편하고 정확하게 판별할 수 있는 미아미엔시스 아비두스 유전형 판별용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus)는 대부분의 섬모충과는 달리 신장, 혈관, 뇌조직까지 감염을 유발하고, 이에 따라 숙주조직을 폐사 및 섭치에 의하여 최근 넙치 양식에서 발생하는 다양한 폐사의 원인중 하나의 병원체로 알려져 있다. 스쿠티카충에 의한 병증을 확인하고, 이에 적합한 구제방법을 처방하기 위해서는 그 병증 원인체의 정확한 판별이 필요하나, 다양한 스쿠티카 섬모충은 그 크기와 형태가 유사하여 유전형을 판별하는데 어려움이 있다.

현재 국내에서 발견되는 스쿠티카충의 유전형으로는 유전형 I과 II가 있으며, 스쿠티카충 유전형 Ⅰ과 Ⅱ를 판별하는 기존의 방법으로는 스쿠티카충 mtDNA의 cox1 유전자 (cytochrome c oxidase subunit 1 gene) 서열을 PCR로 증폭 후 DNA 시퀀싱 (sequencing)하는 방법이 이용되었다 (Sung-Ju Jung et al., 2011, Parasitol Res 108:1153-1161) (도 1 참조). 그러나 DNA 시퀀싱은 각 시료를 개별적으로 증폭하고 서열을 분석하는 방법으로 시간과 노력이 지나치게 많이 소요되어 스쿠티카충 감염에 대한 신속한 대응이 어렵다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus ) 스쿠티카충의 유전형을 판결하기 위한 신속한 판별 방법을 개발하였으며, 이 방법을 통해 스쿠티카충의 감염 여부 뿐만 아니라 감염된 스쿠티카충의 유전형을 동시에 판별 가능하여 기존 스쿠티카충의 유전형 판별방법을 대체할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

Sung-Ju Jung, Eun-Young Im, Michaela C. Strder-Kypke, Shin-Ichi Kitamura and Patrick T. K. Woo (2011) Small subunit ribosomal RNA and mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 gene sequences of 21 strains of the parasitic scuticociliate Miamiensis avidus (Ciliophora, Scuticociliatia). Parasitol Res 108:1153-1161. Jun-Young Song, Shin-Ichi Kitamura, Myung-Joo Oh, Hyun-sil Kang, Je-hee Lee, Shin-Ji Tanaka, and Sung-Ju Jung (2009) Pathogenicity of Miamiensis avidus (syn. Philasterides dicentrarchi), Pseudocohnilembus persalinus, Pseudocohnilembus hargisi and Uronema marinum (Ciliophora, Scuticociliatida). Diseases of Aquatic Organisms 83: 133-143.

본 발명의 목적은 간편하고 정확하게 미아미엔시스 아비두스 유전형을 판별할 수 있는 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 쌍과; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 미아미엔시스 아비두스 유전형 판별방법을 제공한다: (a) 검체로부터 핵산을 추출하는 단계, (b) 상기 조성물을 이용하여 상기 핵산에서 표적 부위를 중합효소연쇄반응(PCR) 반응으로 증폭하는 단계, (c) PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 크기를 확인하여 마이미엔시스 아비두스 유전형을 판별하는 단계.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 쌍과; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 종래 어류의 스쿠티카병의 원인이 되는 기생충의 유전형을 판별하기 위하여 시퀀싱 방법을 이용하던 불편함을 해소하고자 고안된 것으로, 미아미엔시스 아비두스 미토콘드리아의 일부 핵산 서열을 특이적으로 증폭함으로써 1회의 PCR 반응으로 미아미엔시스 아비두스 유전형을 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 M. avidus 유전형별 변이율이 높은 후보군에 대한 프라이머 쌍을 설계하고, Cox1 유전형 판별방법에 의하여 확인된 샘플의 유전형 판별의 정확도를 확인한 결과이다.
도 2는 스쿠티카병에 감염된 넙치의 뇌와 체표 조직으로부터 분리된 기생충을 본 발명에 의해 도출된 4개의 프라이머 쌍을 이용하여 유전형 판별한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 쌍의 M. avidus에 대한 특이성을 확인하기 위하여 스쿠티카병을 유래하는 또 다른 기생충인 Pseudocohnilembus persalinus을 이용하여 PCR 반응을 진행한 결과이다.
도 4는 M. avidus의 유전형을 판별하기 위하여 멀티플렉스 프라이머 세트 (M-7 또는 M-8)를 이용한 PCR 결과로, 어닐링 온도를 각각 52℃, 54.2℃로 상이하게 진행하였다.
도 5는 주형 핵산 양에 따른 각 프라이머 쌍의 검출 민감도를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

프라이머 세트의 설계는 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 주형 DNA에 대한 높은 특이도 등 여러 가지 제약이 따른다. 또한, 둘 이상의 프라이머 쌍을 하나의 반응에서 사용하는 경우, 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건은 더욱 까다로우며, 하나의 세팅된 반응 조건에서 둘 이상의 프라이머 쌍이 정확히 반응할 수 있도록 프라이머를 설계하여야 한다. 본 발명에서는 이러한 조건을 모두 충족하여 하나의 PCR 반응에서 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus)의 유전형을 판별할 수 있는 두 개의 프라이머 쌍을 설계하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 서서열번호 1 및 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍과; 서열번호 4 및 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 판별용 조성물에 관한 것이다.

한편, 본 발명에서는 상기 두 개의 프라이머 쌍을 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 단 1회의 PCR 반응으로 스쿠티카병이 감염된 어류에서 스쿠티카병을 유발하는 미아미엔시스 아비두스의 유전형이 신속하고 정확하게 판별됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 검체로부터 핵산을 추출하는 단계, (b) 상기 조성물을 이용하여 상기 핵산에서 표적 부위를 중합효소연쇄반응(PCR) 반응으로 증폭하는 단계; 및 (c) PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 크기를 확인하여 마이미엔시스 아비두스 유전형을 판별하는 단계를 포함하는 미아미엔시스 아비두스 유전형 판별방법에 관한 것이다.

본 발명의 (a) 단계는 미아미엔시스 아비두스에서 총 DNA를 추출하는 단계로, 이는 당업계에 알려진 다양한 방법으로 DNA를 추출할 수 있으며, 상업적으로 이용가능한 다양한 DNA 추출용 키트 또는 반응 조성물을 사용할 수 있다.

본 발명의 (b) 단계는 핵산에서 표적 부위를 중합효소연쇄반응(PCR) 반응으로 증폭하는 단계로, 상기 (b) 단계의 PCR 반응 중, 어닐링 온도는 50 내지 55℃로 진행할 수 있으며, 바람직하게는 53.5 내지 54.5℃에서, 더욱 바람직하게는 54.2℃ 진행할 수 있다.

본 발명의 (c) 단계는 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 크기를 확인하여 마이미엔시스 아비두스 유전형을 판별하는 단계로, (c) 단계에서 약 379bp의 밴드가 확인되는 경우 미아미엔시스 아비두스 유전형 II로 판별하고, 약 290 bp의 밴드가 확인되는 경우 미아미엔시스 아비두스 유전형 I로 판별하게 된다.

본 발명에서 사용되는 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.

상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 기생충에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 기생충의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있다.

상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M Egholm et al, Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.

상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다.

일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.

특히 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하면, 프라이머 세트가 DNA 서열의 일부를 증폭하기 때문에 소량으로 존재하는 표적 물질을 백만배 이상으로 증폭할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 검체에 존재하는 특정 염기 서열에 혼성화될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 서열이 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 염기서열이 증폭되고, 이는 미아미엔시스 아비두스의 유전형에 따라 상이하므로, 상기 증폭된 산물(amplicon)의 크기를 통해 미아미엔시스 아비두스의 유전형을 판별할 수 있다.

상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성 하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 방법으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다. 상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 PCR 반응 조건에 따라 수행될 수 있거나 또는 일부 변형하여 실시할 수 있다.

상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다.

상기 판별방법은 상기 프라이머 세트를 이용하여 각 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭 반응을 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 PCR 반응산물이 전기영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 널리 보고되어 있으며, 중합효소 연쇄반응(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H I(WO 89/06700) 및 Davey, C 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcriptionmediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제 (self sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; APPCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 검체는 스쿠티카병에 감염된 어류, 예컨대 넙치, 조피볼락, 돔류 등에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 프라이머 쌍은 스쿠티카병에 감염된 어류에서 미아미엔시스 아비두스를 분리하여 핵산을 추출하거나, 기타 미아미엔시스 아비두스로부터 분리된 핵산을 이용하여 신속하고 정확하게 미아미엔시스 아비두스의 유전형을 판별할 수 있도록 상업적으로 이용가능한 형태로 간편하게 제조될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍과; 서열번호 4 및 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에서, 상기 키트는 반응 완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 당업계의 통상의 기술자가 PCR 반응에 이용할 수 있는 시약을 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 키트는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 "포함"한다는 의미는, 이에 대해 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. M. avidus 로부터 DNA 추출

스쿠티카충 (Miamiensis avidus)으로부터 total DNA를 추출하기 위하여, QuickExtract™ DNA Extraction Solution (Lucigen)을 사용하였으며, 그 방법은 QuickExtract™ DNA Extraction Solution (Lucigen) 표준 방법에 따라 진행하였다. 이 방법을 사용하면, PCR을 위한 주형을 빠른 시간(약 8분) 내에 준비가 가능하다. 본 발명에서 사용한 스쿠티카충은 대한민국 제주도에서 수득한 넙치 뇌에서 2012년 11월 분리하여 국립수산과학원에 보관 중인 M. avidus 유전형 I (#7으로 표기됨)과 대한민국 완도에서 수득한 넙치 뇌에서 2013년 1월 분리하여 국립수산과학원에 보관 중인 M. avidus 유전형 II (#33으로 표기됨)을 이용하여 실험을 진행하였다. 해당 유전형은 종래 알려진 방법 따라 시퀀싱을 통해 최종 확인하였다.

실시예 2. M. avidus 의 total DNA로부터의 PCR

스쿠티카충 (Miamiensis avidus) total DNA로부터 PCR을 진행하기 위한 PCR 조성물은 아래의 표 1과 같이 구성하여 표 2에 기재된 조건으로 실행하였다. PCR 산물을 확인하기 위한 전기영동은 2% agarose gel을 사용하여 실시하였으며, PCR 산물 5㎕를 로딩하여 Mupid-exU 전기영동 장치 (Takara Bio Inc.)에서 100V, 25분간 전기영동을 하였다.

PCR 조성물	농도	Volume (㎕)	제조사
Template DNA	45 ng/㎕	2	-
Forword primer	10 pmole/㎕	1	Bineer
Reverse primer	10 pmole/㎕	1	Bineer
PCR preMix	-	-	AccuPower®PCRPreMix(Bioneer)
DW	-	16	-
Total volume	-	20	-

Pre-denature (temp./time)	Denature (temp./time)	Annealing (temp./time)	Extension (temp./time)	Cycle no.	Elongation (temp./time)
94℃/ 4 min.	94℃/ 30 sec.	50~55℃/30 sec.	72℃/ 30 sec.	30	72℃/ 7 min.

실시예 3. M. avidus 의 유전형 판별용 프라이머 동정

스쿠티카 mtDNA에 존재하는 여러 유전자들 중에 유전형 Ⅰ과 Ⅱ의 서열 변이율이 높은 후보군을 6개 선별하고, 후보군에 적합한 프라이머를 표 3 및 4에 나타내었다. 본 발명에 따른 유전형 Ⅰ과 Ⅱ는 종래 cox1으로 구분하는 유전형 1, 2와 반대로, 본 발명에 따른 유전형 I은 cox1 유전형 2에 해당하고, 본 발명에 따른 유전형 Ⅱ는 cox1 유전형 1에 해당한다.

프라이머명	염기서열	서열번호
TypeⅠ&Ⅱ-orf143F	5’-GAATGTTATTAAGGTATAAGGATA-3’	1
TypeⅠ-orf143R	5’-TCAAACGTATAAATATGTATACTTC-3’	2
TypeⅡ-orf143R	5'-AACGTATAAATACAGATGCTTT-3’	3
TypeⅠ-orf355F	5'-AAATAAAACCTATATTTATATAATAAGG-3’	4
TypeⅠ-orf355R	5'-AAGTTATACAACTTAATATTACATAATAAC-3’	5
TypeⅡ-orf355F	5'-TTTAAATAAAACTTATACTTATATAATAAAA-3’	6
TypeⅡ-orf355R	5'-AAGTTATACAACTTAATATTACATAATAGT-3’	7
TypeI-orf386F	5'-AATTGGCTTAAATAATAGTACTAAAC-3’	8
TypeI-orf386R	5'-TTATCAGTAATTTGCTCACTATATT-3’	9
TypeII-orf229F	5'-TAAATATTTAACGTATAACAATGTTAAT-3’	10
TypeII-orf229R	5'-AAAGTAGCTAACTATTCAAGAAATC-3’	11
TypeI-orf571F	5'-TTTGTATTATTATTAGAAAACATTGT-3’	12
TypeI-orf571R	5'-GTTTAATGTTTTTATTAAAAAAATATAG-3’	13
M_avidus_mt-orf73F	5'-ATAAGTACAATGGCATTTAAT-3’	14
M_avidus_mt-orf73R	5'-TACTAAAATTAAACAAAGTTAAATC-3’	15

프라이머 세트	프라이머
TypeⅠ-orf143	TypeⅠ&Ⅱ-orf143F
	TypeⅠ-orf143R
TypeⅡ-orf143	TypeⅠ&Ⅱ-orf143F
	TypeⅡ-orf143R
TypeⅠ-orf355	TypeⅠ-orf355F
	TypeⅠ-orf355R
TypeⅡ-orf355	TypeⅡ-orf355F
	TypeⅡ-orf355R
TypeI-orf386	TypeI-orf386F
	TypeI-orf386R
TypeII-orf229	TypeII-orf229F
	TypeII-orf229R
TypeI-orf571	TypeI-orf571F
	TypeI-orf571R
Mt-orf73	M_avidus_mt-orf73F
	M_avidus_mt-orf73R

각각의 프라이머 세트를 이용하여 M. avidus의 유전형을 분석해 보았다. PCR 조성물과 조건은 표 1과 표 2에 기재된 바와 동일하게 진행하였다.

PCR 결과는 도 1과 같으며, TypeⅠ-orf143은 M. avidus의 유전형 I 특이적으로, TypeⅡ-orf143는 유전형 Ⅱ 특이적으로 예상되는 사이즈인 379bp의 PCR 밴드가 검출되었다. 또한, TypeⅠ-orf355에서도 유전형 I 특이적으로 예상되는 사이즈인 290bp의 선명한 밴드가 검출되었다. 그러나 TypeⅡ-orf355의 경우 유전형 Ⅱ에 대해 예상되는 사이즈인 293bp의 밴드가 확인되었으나 검출 감도가 상대적으로 약하게 나타났다 (도 1a). 그러나, TypeI-orf386, TypeII-orf229, TypeI-orf571의 경우 PCR 밴드가 확인되지 않아, 유전형 Ⅰ과 Ⅱ의 서열 변이율이 높은 서열을 표적으로 함에도 불구하고 M. avidus 검출이나 유전형 판별에 적합하지 않은 프라이머 세트로 확인되었고 (도 1b), Mt-orf73의 경우에는 유전형 Ⅰ과 Ⅱ에서 모두 검출되는바 (도 1c), 유전형 판별에 적합하지 않은 프라이머 세트로 판별되었다.

실시예 4. 다양한 검체에 대한 M. avidus 의 유전형 판별

상기 실시예 3을 통하여, TypeI-orf143, TypeII-orf143, TypeI-orf355, TypeII-orf355가 M. avidus 유전형 판별에 적합한 것으로 예측되는바, 여수 부근의 넙치 양식장에서 스쿠티카병으로 의심되는 병원체 시료를 대상으로 본 발명에서 개발된 프라이머 쌍을 이용하여 유전형 판별을 진행하였다. 넙치의 뇌와 체표 조직으로부터 분리된 병원체의 total DNA를 추출하고, 표 1 조성과 표 2의 조건과 동일하게 PCR을 진행하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이 TypeⅠ-orf143와 TypeⅠ-orf355에서는 밴드가 확인되지 않았고, TypeⅡ-orf143에서는 선명한 밴드가, TypeⅡ-orf355에서는 다소 흐릿한 밴드가 확인되어, 양식장의 넙치는 M. avidus의 유전형 Ⅱ에 감염된 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는, cox1 유전형을 시퀀싱으로 확인한 결과와도 일치하는 것으로 나타났다.

한편, 위와 같은 방법으로 출원인(국립수산과학원)이 보유하고 있는 다양한 M. avidus strain들을 대상으로 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 하기 표 5와 같이 M. avidus의 유전형을 정확히 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

M. avidus strain #	Cox1 type	PCR results				mtType decision
		Type Ⅰ	Type Ⅱ	Type Ⅰ	Type Ⅱ
		orf143	orf143	orf355	orf355
# 27	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 9	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 52	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 3	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 12	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 21	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 26	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 30	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 39	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 47	1	-	+	-	+	Ⅱ
# 6	2	+	-	+	-	Ⅰ
# 7	2	+	-	+	-	Ⅰ

실시예 5. M. avidus 에 대한 검출 특이성 확인

스쿠티카병을 유발하는 또 다른 병원체로는 Pseudocohnilembus persalinus가 알려져 있는바 (Jun-Young Song et al., Diseases of Aquatic Organisms 83: 133-143), 본 발명의 프라이머가 P. persalinus에 의해 간섭받지 않고 M. avidus 특이적으로 유전형을 판별할 수 있는지 확인해보고자 하였다.

이를 위하여 P. persalinus을 Song et al (Diseases of Aquatic Organisms (2009) 83: 133-143) (균주번호 SCL-B)로부터 분양 받아 사용하였으며, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 표 1과 표 2의 조건으로 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 3에서와 같이 P. persalinus (도 3에는 "P"로 표시됨)에서는 PCR 밴드가 확인되지 않아, 본 발명의 프라이머는 M. avidus 특이적으로 유전형을 판별할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 멀티플렉스 PCR

M. avidus 유전형을 명확히 판별하기 위해, 유전형 Ⅰ과 유전형 Ⅱ에 특이적인 프라미어 쌍을 각각 하나씩 포함하는 멀티플렉스 PCR을 위한 프라이머 세트를 표 6과 같이 디자인하였다. 이와 같은 프라이머 세트를 이용하여 표 1에 기재된 조성과 표 2에 기재된 반응을 일부 변경하여 PCR 반응을 진행하였다. 표 1의 조성과 비교하여, 프라이머는 각각 10 pmole/㎕로 하고, DW. 14㎕로 조정하였다. 한편, 다수의 프라이머가 동시에 PCR 반응에 관여하는 경우, 각 프라이머는 주형 DNA에 결합하는 온도가 상이하여 1회의 반응으로 프라이머가 동시에 비특이적 결합없이 원하는 위치에 결합하여 PCR 반응을 유도하는 어닐링 온도를 도출하는 것에는 어려움이 있다. 이에, 본 발명자들은 표 2에 기재된 PCR 반응에서, annealing temperature를 50 내지 55℃로 범위로 변경하며 실험을 진행하였다.

Multiplex primer set	primer set 1		primer set 2
	primer set	primer name	primer set	primer name
M-7	TypeⅠ-orf143	TypeⅠ&Ⅱ-orf143F	TypeⅡ-orf355	TypeⅡ-orf355F
		TypeⅠ-orf143R		TypeⅡ-orf355R
M-8	TypeⅡ-orf143	TypeⅠ&Ⅱ-orf143F	TypeⅠ-orf355	TypeⅠ-orf355F
		TypeⅡ-orf143R		TypeⅠ-orf355R

그 결과, 도 4에서와 같이 어닐링 온도를 54.2℃로 진행하였을 때 유전형 Ⅰ과 유전형 Ⅱ에 상응하는 명확한 두 개의 밴드가 확인되어, 본 발명은 해당 온도에서 4개의 프라이머가 비특이적 반응없이 주형 DNA의 표적 위치에 결합하여 PCR 반응을 유도하는 것을 알 수 있었으며, M-7의 프라이머 세트보다 M-8의 프라이머 세트에서 유전형 Ⅰ과 유전형 Ⅱ에 특이적인 프라미어 쌍이 더 선명하게 판별되었다. 다수의 프라이머 쌍을 하나의 PCR 반응에 사용하는 경우, 각 프라이머는 비특이적으로 결합될 수 있는 가능성이 높고, 어닐링 온도가 모든 프라이머에서 유사하도록 프라이머를 설계하지 않는 한, PCR 밴드가 생성되지 않거나 비특이적 밴드를 생성되기도 한다. 그러나, 본 발명에서는 이러한 비특이적 반응이 확인되지 않아, 본 발명에 따른 프라이머 세트(M-8)가 단 한 번의 반응으로도 M. avidus 유전형을 정확하게 판별할 수 있음을 입증하였다.

실시예 7. 민감도 조사

본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하는 경우, 극소량의 샘플에서도 M. avidus 유전형을 명확히 판별할 수 있는지 민감도 조사를 진행하였다. 실험은 표 1에 기재된 조성과 표 2에 기재된 반응 조건을 활용하였으며, 주형으로 사용되는 total DNA 양만 0.01~100ng/㎕로 변화시키며 첨가하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이 TypeⅠ-orf143, TypeⅡ-orf143는 1ng/㎕, TypeⅠ-orf355는 0.1ng/㎕, TypeⅡ-orf355는 10ng/㎕에서 선명한 밴드가 확인되어, TypeⅡ-orf143와 TypeⅠ-orf355를 조합하는 프라이머 세트인 M-8이 더 적은 시료로도 민감하게 M. avidus 유전형을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> Composition and Kit for discrimination of Miamiensis avidus type <130> P19-B276 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type I&II-orf143F <400> 1 gaatgttatt aaggtataag gata 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf143R <400> 2 tcaaacgtat aaatatgtat acttc 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeII-orf143R <400> 3 aacgtataaa tacagatgct tt 22 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf355F <400> 4 aaataaaacc tatatttata taataagg 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf355R <400> 5 aagttataca acttaatatt acataataac 30 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeII-orf355F <400> 6 tttaaataaa acttatactt atataataaa a 31 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeII-orf355R <400> 7 aagttataca acttaatatt acataatagt 30 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf386F <400> 8 aattggctta aataatagta ctaaac 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf386R <400> 9 ttatcagtaa tttgctcact atatt 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeII-orf229F <400> 10 taaatattta acgtataaca atgttaat 28 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeII-orf229R <400> 11 aaagtagcta actattcaag aaatc 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf571F <400> 12 tttgtattat tattagaaaa cattgt 26 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TypeI-orf571R <400> 13 gtttaatgtt tttattaaaa aaatatag 28 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M_avidus_mt-orf73F <400> 14 ataagtacaa tggcatttaa t 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M_avidus_mt-orf73R <400> 15 tactaaaatt aaacaaagtt aaatc 25

Claims (7)

1. 서열번호 1 및 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍과;
   서열번호 4 및 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 I 또는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 II 판별용 조성물.
   
2. 다음 단계를 포함하는 미아미엔시스 아비두스 유전형 I 또는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 II 판별방법:
   (a) 검체로부터 핵산을 추출하는 단계
   (b) 제1항의 조성물을 이용하여 상기 핵산에서 표적 부위를 중합효소연쇄반응(PCR) 반응으로 증폭하는 단계; 및
   (c) PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 크기를 확인하여 마이미엔시스 아비두스 유전형을 판별하는 단계.
   
3. 제2항에 있어서, (c) 단계에서 379bp의 밴드가 확인되는 경우 미아미엔시스 아비두스 유전형 II로 판별하고, 290 bp의 밴드가 확인되는 경우 미아미엔시스 아비두스 유전형 I로 판별하는 것을 특징으로 하는 판별방법.
   
4. 제2항에 있어서, (b) 단계의 PCR 반응 중, 어닐링 온도는 53.5 내지 54.5℃에서 진행하는 것을 특징으로 하는 판별방법.
   
5. 서열번호 1 및 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍과;
   서열번호 4 및 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 I 또는 미아미엔시스 아비두스 (Miamiensis avidus) 유전형 II 판별용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 반응 완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 키트.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 키트.
   
   
   

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