KR102368480B1 - 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 장수풍뎅이 누디바이러스(Oryctes rhinoceros nudivirus) 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 진단용 조성물은 RT-PCR에 적합하여 실시간 진단에 이용할 수 있다는 점과 Ultrafast PCR에서도 이용 가능하다는 점에서 신속 진단과 함께 진단 정확성 측면에서도 매우 우수한 효과를 지닌다.

Description

장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 {Primer set for detecting Oryctes rhinoceros nudivirus and method for detecting using the same}

본 발명은 장수풍뎅이 누디바이러스에 특이적인 유전자 서열을 검출하는 제제를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것이다.

단백질 공급원, 소자본ㆍ작은 공간에서 사육가능, 강한 번식력, 상대적으로 쉬운 사육관리, 대량살상의 윤리문제 회피, 온실가스와 자원비용 절감 등의 장점을 가지고 있어 곤충산업은 미래 녹색생명산업으로 주목을 받고 있다. 그러나 곤충의 산업화가 진행되면서 건강한 곤충의 대량사육이 요구되고 있다. Virus에 의한 백강병(white muscardine), 녹강병(green muscardine), 고름병, bacteria에 의한 물렁물렁병 등과 함께 fungus, 원충(protozoa), 선충(nematoda), 응애(mites) 등에 의해서 대량 집단사육 시 질병 발생이 발생하여 대규모 피해가 만성적으로 발생하고 있다. 그 동안에 농진청에서 진단/판별 kit, 병 유발 유전자탐색, 친환경 방제법을 발전시켜오고 있다. 그러나 정밀한 진단 및 치료법이 개발되지 않은 상태이다.

국내 주요 산업곤충인 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목(Coleoptera), 풍뎅이과 (Family Scarabaeidae)에 속하는 곤충이다. 장수풍뎅이는 습도나 온도에 민감하지 않고 먹이가 까다롭지 않아 사육이 간편하여 애완곤충으로 각광받고 있으며, 최근에는 장수풍뎅이의 애벌레가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가되고 있다. 예로부터 한약재로 자주 이용되어 온 굼벵이, 누에, 동충하초, 지네 등은 유용한 곤충자원으로 이용되고 있으며 최근 신약 개발에 있어서 이러한 천연자원의 기능에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다. 이와 같이 장수풍뎅이는 애완용으로도 널리 이용되며 유용한 곤충자원의 하나로 자리 잡고 있다.

장수풍뎅이의 대량 사육 시 발생하는 질병의 원인이 Oryctes rhinoceros nudivirus(OrNV)인 것이 2015년에 처음 보고되었다. 그러나 아직 정확한 진단, 발병기전과 치료방법을 찾지 못하고 있으며 곤충 사육농가에 매년 심각한 경제적 손실을 입고 있다.

한국 장수풍뎅이의 경우, 장수풍뎅이에 감염하는 세균과 진균의 진단은 몇 가지 정도 알려져 있다. 세균의 경우 S.marcescens와 B.thuringiensis가 있고, 진균의 경우 M.anisopliae와 B.bassiana이 있다.

하지만 바이러스성으로 의심되는 질병에 의한 유충 집단 폐사로 심각한 경제적 손실이 있으나 아직까지 연구 자료는 매우 미흡한 실정이다. 바이러스병이 만연하고 있음에도 불구하고, 질병 유발 바이러스의 동정이나 진단방법은 전무한 상태이다. 따라서 장수풍뎅이 병원성 바이러스를 신속하게 조기 진단할 수 있는 검출 방법에 대한 연구가 요구되는 실정이다.

대한민국공개특허 제10-2019-0142564호 대한민국등록특허 제10-2024188호

이에, 본 발명자들은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)에 대한 Oryctes rhinoceros nudivirus(OrNV) 및 이로 인하여 발생하는 질환을 신속하고 효과적으로 진단하는 방법을 연구하여, 신규의 프라이머 세트를 디자인하였다.

이에 따라, 바이러스의 신속 및 정량적 진단을 위한 프라이머를 디자인하여, Real-Time PCR 및 신속한 진단이 가능한 Ultrafast PCR에 적용이 가능하고 기존과 다르게 매우 빠른 시간 내에 진단이 가능한 신규의 진단 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 lef-8 (late expression factor-8)의 특정 표적 부위를 검출하는 제제를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물, 감염 진단용 키트 및 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 장수풍뎅이 누디바이러스(Oryctes rhinoceros nudivirus) 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.

장수풍뎅이 누디바이러스병 (병원체: Oryctes rhinoceros nudivirus)은 장수풍뎅이 대량 사육 중 가장 많이 발생하는 질병으로 현재 전국적으로 가장 문제가 되는 질환이다. 오염된 먹이를 섭취하는 경우에 발생하며, 감염충 발견 즉시 제거 및 소거를 수행하여야 병의 확산을 차단할 수 있다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 lef-8 (late expression factor-8)의 특정 표적 부위로써 200 bp 이하의 염기서열(192bp)이다. 이러한 염기서열을 표적으로 함으로써, 기존에 알려진 검출 방법과는 달리 빠르고 정확하게 장수풍뎅이 누디바이러스의 진단이 가능하다. 특히, 200 bp 이하의 짧은 서열을 표적함으로써 Real-Time PCR 및 Ultrafast-PCR에 적합한 구성을 가지며, 이에 따라 기존의 알려진 장수풍뎅이 누디바이러스 검출 시약과 대비하여 매우 빠르게 검출을 진행할 수 있고 실시간 검출이 가능하며 정확도 또한 충분히 우수한 결과를 확보할 수 있다.

상기 장수풍뎅이 누디바이러스 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 설계한 프라이머 이외에 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 포함할 수 있다. 나아가 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.

본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 서열번호 2 및 3으로 이루어질 수 있다.

서열번호 2: TCC TAT CAG CAG GTC GTC AT

서열번호 3: AAT CCA TTT GGA GCG TGC AT

상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다. 본 발명에서는 위와 같은 조건을 맞추면서도 Real-Time PCR 및 Ultrafast-PCR에 적합하도록 서열을 설정하였다는 점에서 기존의 기술들과 상이한 차별성을 가진다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 누디바이러스 유전자를 검출하는 제제는 장수풍뎅이 누디바이러스 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 바람직하게 프라이머는 서열번호 2 및 3일 수 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하면 장수풍뎅이 누디바이러스를 실시간으로 빠르고 정확하게 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단을 위한 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있다. 상기 키트는 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다.

상기 적합한 담체로는, 이에 제한되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

또한 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 장수풍뎅이 누디바이러스 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 b) 상기 a)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 a) 단계에서 사용하는 프라이머는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다.

또한 본 발명의 상기 a) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 듀플렉스 중합효소연쇄반응(duplex Polymerase Chain Reaction, duplex PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification), 초고속 중합효소연쇄반응 (Ultrafast Polymerase Chain Reaction) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있다.

본 발명의 b) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

본 발명의 진단용 조성물은 RT-PCR에 적합하여 실시간 진단에 이용할 수 있다는 점과 Ultrafast PCR에서도 이용 가능하다는 점에서 신속 진단과 함께 진단 정확성 측면에서도 매우 우수한 효과를 지닌다.

도 1은 본 발명에 따른 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 표적 증폭 서열을 특정하는 염기서열 정보에 관한 것이다.
도 2는 Ultrafast PCR을 통한 장수풍뎅이 누디바이러스 검출 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 Realtime PCR Standard 조건 확인을 수행한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 논산, 용인, 남원 및 남양주의 지역별 농가에서 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 충으로부터 장수풍뎅이 누디바이러스를 검출한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1. 장수풍뎅이 누디바이러스의 검출을 위한 프라이머 세트 및 PCR 조건 설정

장수풍뎅이 누디바이러스 정량적 측정을 위한 프라이머 제작을 위해 기존에 알려진 충북 영동에서 유래한 Oryctes rhinoceros nudivirus 의 염기서열 중 lef-8 유전자 서열을 바탕으로 200bp 미만 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 프라이머 세트를 BLAST Primer 프로그램을 이용하여 구성하였다.

해당 프라이머 세트를 도출하기 위한 서열 정보 및 증폭되는 서열 정보를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 Avq 1F위치에 상응하는 AdVq1-F 프라이머 및 Avq1R 위치에 상응하는 AdVq1-R 프라이머를 이용하여 증폭 가능한 192 bp 정도의 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다.

한편, AdVq1-F 프라이머 및 AdVq1-R 프라이머 서열은 아래 표 1에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명칭	증폭부위	GenBank #	프라이머 서열 (5’ → 3’)	길이 (bp)	Tm (℃)	예상 (bp)
2	AdVq1-F	lef-8	KM233708.1	TCC TAT CAG CAG GTC GTC AT (서열번호 2)	20	55.4	192
3	AdVq1-R	lef-8	KM233708.1	AAT CCA TTT GGA GCG TGC AT (서열번호 3)	20	53.4	192

상기 서열번호 2 및 서열번호 3을 가지는 프라이머 세트는 BLAST search를 통하여 유전자은행 (GenBank)에 등록된 유전자 서열정보와 비교하여 특이성 확인 후 제작하였다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 하기 조건 하에 Real-Time PCR 및 Ultrafast PCR 을 수행하였다.

Real-Time PCR은 95℃에서 10분 후 (95℃에서 15초, 56℃에서 30초)를 35반복 수행하였으며, Ultrafast-PCR은 95℃에서 30초 후 (95℃에서 4초, 56℃에서 4초, 72℃에서 4초)를 50반복 수행하였다.

실시예 2. 장수풍뎅이 누디바이러스의 검출을 위한 ultrafast PCR 결과 확인

위 실시예 1에서 언급한 Ultrafast PCR 조건을 이용하여 누디바이러스에 대한 검출을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 구체적으로, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염충으로부터 genomic DNA를 추출하고, 이를 이용하여 진단을 수행하였다.

도 2에서, 확인할 수 있는 바와 같이, 혈림프의 1/100 희석액을 ultrafast PCR을 통하여 확인하였을 시 모두 진단이 가능하였다. 또한 genomic DNA 농도 최소 10^-4 ng/mL부터 진단이 가능함을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 약 20 분 이내에 누디바이러스를 검출할 수 있었다.

이러한 검출은 기존에 통상 이용되는 누디바이러스 검출 시약과 대비하여 약 4배 이상 시간을 단축하면서도 우수한 정확도를 나타내는 진단 결과로써, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 우수한 효과를 보여준다.

실시예 3. 장수풍뎅이 누디바이러스의 검출을 위한 Realtime PCR 결과 확인

위 실시예 1에서 언급한 Realtime PCR 조건을 이용하여 누디바이러스에 대한 검출을 수행하고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3은 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 Realtime PCR Standard 조건을 나타낸다. 도 4는 각 지역별 농가로써, 논산, 용인, 남원 및 남양주에서 얻은 장수풍뎅이 누디바이러스 감염충으로부터 검출을 수행한 결과를 나타낸다.

실시예 3과 마찬가지로, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염충으로부터 genomic DNA를 추출하고 이를 이용하여 진단을 수행하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각 지역별 농가의 장수풍뎅이 누디바이러스 감염충으로부터 모두 누디바이러스가 신속하게 검출된 것을 확인할 수 있었다.

상기 실험 결과들로부터, 본 발명의 프라이머 세트가 약 200 bp의 염기서열을 특정하여 증폭시킴으로써 RT-PCR에 적합하여 실시간 진단에 이용할 수 있다는 점을 확인하였다. 또한, Ultrafast PCR에서도 이용 가능한 프라이머에 해당하여 진단 효율을 크게 증가시킬 수 있다는 점에서 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

위와 같은 신속진단과 함께 진단 정확성 측면에서도 매우 우수한 효과를 지닌다는 점에서, 본 발명에 따른 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물, 감염 진단용 키트 및 감염 진단 방법의 우수한 효과를 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting Oryctes rhinoceros nudivirus and method for detecting using the same <130> 1135 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial lef-8 <400> 1 tcctatcagc aggtcgtcat ccactatacc gtgctccgtt tcgaccgtta tgaacgtaga 60 gtctttcgga tgtttgaccg tcttgaacgt aaactcgacg gtaatgcacg cgttatagtg 120 gactttcggt aaaaacggca atatattcga atcgatcacc acgccgtcct cgatgcacgc 180 tccaaatgga tt 192 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AdVq1-Foward Primer <400> 2 tcctatcagc aggtcgtcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AdVq1-Reverse Primer <400> 3 aatccatttg gagcgtgcat 20

Claims (10)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 장수풍뎅이 누디바이러스(Oryctes rhinoceros nudivirus) 유전자를 검출하기 위한 초고속 중합효소연쇄반응(Ultrafast Polymerase Chain Reaction)용 프라이머 세트를 포함하며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것인, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 및 DNA 중합효소를 더 포함하는, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물.
6. 제1항에 따른 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단용 키트.
7. a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 장수풍뎅이 누디바이러스 유전자에 특이적으로 결합하는 초고속 중합효소연쇄반응(Ultrafast Polymerase Chain Reaction)용 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것이며; 및
   b) 상기 a)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제7항에 있어서,
    상기 b) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 장수풍뎅이 누디바이러스 감염 진단 방법.
    
    

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