KR101071637B1

KR101071637B1 - 미세전이를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR101071637B1
Application number: KR1020040031962A
Authority: KR
Inventors: 사토루 오오나카; 하야시토시노리
Original assignee: 토소가부시키가이샤
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2011-10-10
Also published as: CN100335654C; CN1572886A; US20040224342A1; TWI340168B; TW200508394A; KR20040095688A; US7393641B2; JP2011142917A; EP1475445A1; JP5310764B2; EP1475445B1

Abstract

환자의 종양 원발소 이외의 부위에서 얻어진 시료에서, 종양세포에서 유래한 RNA에서의 특정서열 일부와 상보적인 제 1 프라이머 및 상기 특정서열 일부와 상동적인 제 2 프라이머(양자 중 어느 일방은 5' 말단에 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 부가적으로 가진다)를 사용하는 방법으로서, (1)주형으로 상기 특정서열을 사용하여 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 cDNA를 합성하고, (2)리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소에 의해 RNA-DNA 이중가닥에서 RNA 가닥을 분해하고(단일가닥 DNA의 생성), (3)상기 단일가닥 DNA를 주형으로 하여 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 상기 특정서열과 상보적이거나 상동적인 RNA로 전사될 수 있는 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA를 형성하고, 및 (4) RNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의하여 상기 이중가닥 DNA를 RNA 전사산물(상기 반응(1)에서 이후 cDNA 합성에서 주형으로 된다)로 전사하고, 상기 mRNA를 검출하는 것을 포함하는, 종양세포 미세전이를 검출하는 방법.

종양세포, 미세전이, 올리고뉴클레오티드, 인터컬레이터성 형광색소

Description

미세전이를 검출하는 방법{METHOD OF DETECTING MICROMETASTASIS}

도 1은 10⁴카피/30㎕의 초기 RNA 양으로, 다양한 프라이머의 조합을 사용하여 RNA를 증폭한 결과를 보여주는 그림이다. nega는 RNA 시료 대신에 희석액만으로 이루어진 샘플을 표시한다. 레인 1: nega에서의 조합 1, 레인 2: 10⁴카피에서의 조합 1, 레인 3: nega에서의 조합 2, 레인 4: 10⁴카피에서의 조합 2, 레인 5: nega에서의 조합 3, 레인 6: 10⁴카피에서의 조합 3, 레인 7: nega에서의 조합 4, 레인 8: 10⁴카피에서의 조합 4, 레인 9: nega에서의 조합 5, 레인 10: 10⁴카피에서의 조합 5, 레인 11: nega에서의 조합 6, 레인 12: 10⁴카피에서의 조합 6, 레인 13: nega에서의 조합 7, 레인 14: 10⁴카피에서의 조합 7. 각 올리고뉴클레오티드의 조합을 이용한 경우의 특이적 증폭 밴드를 괄호로 표시했다.

도 2는 실시예 2~4에서 사용한 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드에서, 인터컬레이터성 형광색소(옥사졸 옐로우)가 결합한 화학구조를 나타내며, 이때, B¹, B², B³, 및 B⁴는 핵산 염기이고, Ishiguro, T(1996) Nucleic Acids Res., 24(24)4992-4997에 의하여 제작된 것(도.2A)과, Label-ON Reagents(Clontech제)를 사용해서 뉴클레오티드 사슬내에 관능기를 도입해서 제작된 것(도 2B)이다.

도 3은 10⁷카피/30㎕~10²카피/30㎕의 초기 RNA양에서, 반응시간 및 RNA의 합성에 따라 증대되는 형광의 증가를 나타내는 그래프이다. nega로는 RNA 시료 대신에 희석액만을 사용했다.

도 4는 실시예 3과 동일한 반응 용액으로 MKN45 RNA를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. nega: RNA 시료 대신에 희석액만으로 이루어진 시료. 10⁴: MKN45 세포 10⁴개 상당의 MKN45 RNA. 10³: 정상백혈구 10⁴개 상당의 백혈구 RNA와 혼합된 MKN45 세포 10³개 상당의 MKN45 RNA. 10²: 정상백혈구 10⁴개 상당의 백혈구 RNA와 혼합된 MKN45 세포 10²개 상당의 MKN45 RNA. 10¹: 정상백혈구 10⁴개 상당의 백혈구 RNA와 혼합된 MKN45 세포 10¹개 상당의 MKN45 RNA. nega: 정상백혈구 10⁴개 상당의 백혈구 RNA. cal10＾7: CEA RNA 10⁷카피/5μL. cal10＾3: CEA RNA 10³카피/5μL.

도 5는 10⁷카피/30㎕~10²카피/30㎕의 초기 RNA양에서, 반응시간 및 RNA의 합성에 따라 증대되는 형광의 증가를 나타내는 그래프이다. nega로는 RNA 시료 대신에 희석액만이 사용되었다.

본 발명은, 종양세포의 미세전이를 검출하는 방법, 상기 방법에서 프라이머 등으로서 호적하게 사용되는 폴리뉴클레오티드(CEA 검출용), 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종양세포 미세전이의 검출 킷트에 관한 것이다. 종양세포의 미세전이를 검출하는 본 발명의 방법은, 종양세포 RNA의 1단계, 일정온도 증폭 및 검출이 가능하고, 예를 들면 종양세포의 수술적 제거 전에 실시될 수 있는 신속한 방법이다.

암세포는 혈류나 림프액류를 통해서 원발 종양으로부터 퍼져서, 먼곳의 미세전이를 형성한다. 원발소의 성공적 절제가 미세전이로 인한 종양 재발을 항상 막을 수 있는 것은 아니기 때문에, 원발 종양에서 뿐만이 아니라 그 주변부에서의 모든 림프절을 절제(림프절곽청)하는 것이 수술에 있어 통상적이다. 비록, 림프절곽청이 재발을 방지할 수 있다하더라도, 많은 환자들이 그들의 삶의 질을 불가피하게 저하시키는 부종과 같은 후유증으로 고통받는다고 하는 문제가 있다.

그래서, 최소한의 절제부위로 재발을 막는 것이 현대의 종양외과수술의 목표로 되고 있다. 이를 위해서는, 미세전이의 정확한 포착이 필수적이다. 그러나, 수술전의 화상진단에 의한 미세전이의 측정은 감도나 특이성이 충분하지 않기 때문에 수술중에 환자 조직으로부터의 대표 절편을 현미경으로 조사할 필요가 있었다.

최근에는 암특이적인 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 RT-PCR 증폭법에 의한 종양세포의 검출이 활발하게 연구되고 있다(Palmieri G., Ascierto PA.등, Journal of Clinical Oncology, 19, 1437-1443(2001), Nogi H. Takeyama H.,등, Breast Cancer, 10, 74-81,(2003), Hampton R., Walker M.,등., Oncogene, 21, 7817-7823, (2002))

Palmieri G., Ascierto PA.등., Journal of Clinical Oncology, 19, 1437-1443,(2001), Nogi H. Takeyama H.,등, Breast Cancer, 10, 74-81,(2003), Hampton R., Walker M.,등., Oncogene, 21. 7817-7823(2002)에 개시된 RT-PCR법은, 귀찮을 정도로 상당한 숙련이 요구되는 반응 용액의 반복적인 급속 가열 및 냉각이 필요로되고, 역전사와 PCR 증폭과 같은 최소한 2단계가 필요로 된다고 하는 문제가 있다. 그래서, RT-PCR법에서는, 결과를 얻기까지 장시간이 걸릴 뿐아니라(예를 들면, 일반적으로, 역전사반응은 30~60분, PCR 반응은 30~60분), RT 반응과 PCR 반응 사이에 시료간 오염을 피하기 위해 주의할 필요가 있다. 1단계 RT-PCR법이 현재까지 개발되어 있으며, 비록 시간의 단축화가 가능하다고 할지라도, 검출 한계가 10³~10⁵ 카피 수준으로, 여전히 불충분하다.

또한, RT-PCR법에서 감도를 향상시키려면, 증폭해서 검출하려는 각 표적 RNA 마다, 가열 및 냉각 조건과 같은 증폭 조건을 최적화할 필요가 있다. 그러나 미세전이의 검출에 있어서는, CEA(암태아성 항원), Cytokeratin 20, β-actin, mammagloblin A, SCC 항원(편평상피암 항원, squamous cell carcinoma antigen) 및 PBGD(porphobilinogen deaminase)와 같은, 복수 종양 마커의 mRNA를 동시에 증폭 및 검출할 필요가 간혹 있다. 그와 같은 경우에, 서로 다른 적정 증폭 및 검출 조 건을 가지는 mRNA를 실제로 동일한 유전자 증폭장치(thermocycler)로 처리하는 것이 곤란하게 되어 각각 검출을 행하지 않으면 안되고, 그 결과 측정 결과가 지연되게 된다.

RNA에서 cDNA로의 역전사의 경우, 반응 용액을 가열 및 냉각하여 증폭하는 RT-PCR과는 달리, 반응 용액을 가열 또는 냉각할 필요가 없고, 증폭 산물이 RNA인 몇몇 RNA 증폭 방법이 보고되어 있다(예를 들면, JP 특허 제 2650159호에 개시된 NASBA법, JP 특허 제 3241717호에 개시된 TMA법, JP-A-2000-14400호에 개시된 증폭· 검출법 등). 이들 방법은, 특정서열을 가진 RNA 전사산물로 전사되고, RNA 폴리머라제를 위한 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA의 합성을 포함한다.

보다 구체적으로는, 임의의 RNA의 경우에, (1)RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소)가 특정 서열의 3' 영역에 상보적인 DNA 프라이머와 주형으로서 상기 RNA를 사용해서, 상기 RNA가 다른 RNA와 구별되는 상기 RNA에서의 특정서열과 상보적인 DNA를 합성하고, (2) 리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소가 상기 역전사에 의해 생성된 RNA-DNA 이중가닥에서 상기 RNA 가닥을 분해하여, 단일가닥 DNA를 남기고, (3)DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 상기 단일가닥의 3' 영역에 상보적이고, 5' 말단에서 상기한 프로모터 서열을 가지는 DNA 프라이머를 사용하여, RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA를 합성하고, 및 (4)RNA 폴리머라제가 상기 이중가닥 DNA를 전사하여 전사산물(상기 특정서열을 가진 RNA)을 생성하는 것이다. 특정서열을 가지는 RNA 전사산물은 상기 반응(1)에 있어서 주형으로 되고, 상기 반응(1)에서 사용되는 DNA 프라이머와 결합해서, 반응(2) 및 그 이후의 반응을 일으켜, 상기 연쇄 반응으로 RNA 증폭이 진행된다.

이들 방법은, PCR에서 처럼 반응 용액을 가열 및 냉각할 필요가 없거나, 또는 RNA의 역전사와 그후의 연쇄적 증폭반응을 나눠서 실시할 필요가 없다는 점에 특징이 있다.

본 발명의 목적은, 종양세포 유래의 RNA를 증폭·검출하는 것에 적용되는 방법에 있어서, 환자의 종양 원발소 이외의 부위에서 얻어진 시료에서, 종양세포의 미세전이를 일정온도, 1단계 조작으로, 신속하게(예를 들면 수술 시행중에) 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 이루어진 것이다. 본원 청구항 1의 발명은, 환자의 종양 원발소 이외의 부위에서 얻어진 시료에서, 종양세포에서 유래한 RNA에서의 특정서열 일부와 상보적인 제 1 프라이머 및 상기 특정서열 일부와 상동적인 제 2 프라이머(양자 중 어느 일방은 5' 말단에 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 부가적으로 가진다)를 사용하는 방법으로서, (1)주형으로 상기 특정서열을 사용하여 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 cDNA를 합성하고, (2)리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소에 의해 RNA-DNA 이중가닥에서 RNA 가닥을 분해하고(단일가닥 DNA의 생성), (3)상기 단일가닥 DNA를 주형으로 하여 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 상기 특정서열과 상보적이거나 상동적인 RNA로 전사될 수 있는 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA를 형성하고, 및 (4) RNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의하여 상기 이중가닥 DNA를 RNA 전사산물(상기 반응(1)에서 이후 cDNA 합성에서 주형으로 된다)로 전사하고, 상기 mRNA를 검출하는 것을 포함하는, 종양세포 미세전이를 검출하는 방법을 제공한다.

본원 청구항 2의 발명은, 상기 청구항 1에 있어서, 종양세포에서 유래한 RNA가 암태아성 항원(CEA) RNA인 종양세포 미세전이를 검출하는 방법을 제공한다.

본원 청구항 3의 발명은, 상기 청구항 1에 있어서, 프라이머 등으로서 호적하게 사용되는, 서열번호 1~22 중 어느 것에 있어서 적어도 10개의 연속하는 뉴클레오티드와 상동적인 또는 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본원 청구항 4의 발명은, 청구항 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 종양세포 미세전이의 검출 킷트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은, 종양세포의 미세전이를 일정온도, 1단계 조작으로, 신속하게(예를 들면, 수술 시행중에) 검출가능하도록, 증폭산물로서 RNA를 생성하는 RNA 증폭반응을 사용한다. 특히, 전사산물과 혼성화 가능한 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 반응 용액에 첨가(JP 특허 제3189000호)하는 것이, 특정서열 또는 상보적인 서열의 증폭 및 그 증폭 모습을 검출(모니터링)하는 것을 가능하게 한다. 모니터링에 사용되는 프로브는, 특정서열 또는 상보적인 서열과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드에 인터컬레이터성 형광색소를 결합함으로써 얻어진 것으로, 상기 인터컬레이트성 형광색소가 상기 전사산물과 혼성화되자마자 형광특성을 변화시키게 된다. 상기 모니터링은 본 발명을 실시하는 가장 호적한 형태이다. 비록 올리고뉴클레오티드에 대한 표지로서 인터컬레이터성 형광색소를 결합하는 방법에는 특별한 제한은 없지만, 인 원자에 링커를 개입해서 인터컬레이터성 형광색소를 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 사슬 내 또는 어느 쪽 말단에 아미노기 등의 관능기를 도입하고나서, 인터컬레이터성 형광색소에도 필요하면 올리고뉴클레오티드에 도입한 관능기와 반응 또는 결합가능한 관능기를 선택적으로 도입하여, 두 관능기를 결합시킴으로써 결합할수 있다. 상세한 것은, JP-A-2000-154431호 또는 Ishiguro, T(1996) Nucleic Acids Res. 24(24)4992-4997에 개시되어 있다(본 명세서의 도 2A). 관능기를 올리고뉴클레오티드 사슬내 또는 말단으로 도입하는 것도 여하한 방법으로 할 수 있지만, 예를 들면, Label-ON Reagents(Clontech)를 사용함으로써 도입할 수 있다(도 2B).

본 발명은, 35℃~50℃(바람직하게는 44℃)의 비교적 저온에서 일정온도로 실시된다. 본 발명은, 종양세포의 미세전이를 검출하기 위해, 환자의 종양 원발소 이외의 부위에서 얻어진 시료를 사용한다. 본 발명에 의해 미세전이를 검사하기 위한 종양세포는 특히 제한되지는 않으며, 특이적인 RNA를 전사하고 있는 종양세포, 또는 특이적이진 않지만, 비정상적인 양으로 임의의 RNA를 발현하고 있는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 종양세포의 미세전이 검출을 위해 직접적인 증폭·검출 표적으로 되는 RNA로는, 예를 들면, src, erbB, sis, ras, myc 또는 fos 등의 암유전자에서 전사된 mRNA, BCR-ABL, PML-RARA, DEK-CAN 또는 E2A-PBX에서 전사된 mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen), AFP(alpha fetoprotein), POA(pancreatic oncofetal antigen), NSE(neuron specific enolase), SCC(squamous cell carcinoma antigen), PSA(prostate specific antigen), BFP(basic fetoprotein), γSm(γ-seminoprotein), SP1(β1-glycoprotein), CAF(carcinoembryonic fibronectin), cytokeratin 19, cytokeratin 20, mammaglobin, 또는α macroglobin 등의 암태아성 단백질을 암호화하는 유전자에서 전사된 mRNA, 암성 이소성 생성물질(oncogenic ectopic product)인 elastase-1, 또는 ALP(alkaline phosphatase), PAP(prostate acid phosphatase), 또는 ICDH(isocitric acid dehydrogenase) 등의 암성 아이소자임을 암호화하는 유전자에서 전사된 mRNA, ADH(antidiuretic hormone), ACTH(adorenocorticotropic hormone), CRF(corticotrophin-releasing factor), FSH(follicle-stimulating hormone), PRL(prolactin), PTH(parathyroid hormone), βHCG(β human chorionic gonadotropin), PTHrP(parathyroid hormone-related peptide) 또는 calcitonin 등의 호르몬을 암호화하는 유전자에서 전사된 mRNA, 또는 IAP(immunosuppressive acid protein), PIVKA II(protein induced by Vitamin K absence or antagonist), TPA(tissue polypeptide antigen), 또는 SHBG(sex hormone binding globulin) 등의 암성 이상 단백질(폴리펩티드)을 암호화하는 유전자에서 전사된 mRNA일 수 있다. 특히 CEA RNA는, 정상세포에서는 거의 전사되지 않 는 것으로, 종양세포에 특이적인 RNA이므로, 증폭·검출 표적으로 바람직하다.

본 발명을 실시하기 위해서는, 표적 RNA를 먼저 선별하고, 다음으로 그 RNA에서 특정서열을 선별하고, 그리고 선별된 특정서열을 위해 본 발명에서 사용되는 제 1 및 제 2 프라이머 서열을 디자인한다. 예를 들면, 서열번호 1~22 중에서 적어도 10개의 연속하는 뉴클레오티드와 상동 또는 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 실시예에서 기술한 것처럼, CEA 유전자에서 전사된 mRNA의 검출을 위해 사용되는 프라이머의 바람직한 예이다.

종양의 원발소부란, 종양이 발생한 부위이다. 본 발명에서는, 상기 종양의 원발소부와는 다른 부위에서 유래한 시료를 사용한다. 시료란, RNA를 포함하는 핵산 시료를 의미한다. 본 발명에서는, 예를 들면, JP-A-7-59572호 공보에 개시된 절차에 의하여 환자의 종양 원발소 이외 부위의 조직으로부터 준비된 시료를 사용하고, 상기에서 예시한 것처럼 RNA는, 당해 시료를 얻은 조직으로 종양세포가 미세전이되어 있는지 여부를 측정하기 위해 RNA를 직접적으로 증폭 및 검출한다.

이하에서 본원발명을 더욱 상세하게 설명한다. 시료중에, 증폭·검출 표적인 종양세포 RNA가 존재하는 경우에는, (1)제 1 프라이머(특정서열의 3' 영역에 상보적인)가 RNA에서의 특정서열과 혼성화되고, RNA 의존성 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 주형으로서의 RNA에서 특정서열을 따라 cDNA로서 신장하여 RNA-DNA 이중가닥을 형성하고, (2)다음으로, 리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소에 의해 RNA-DNA 이중가닥에서 RNA가 분해되어 단일가닥 DNA를 생성하고, (3)제 2 프라이머(표적 RNA의 5' 영역에 상동적이고, 그 5' 말단에 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열 이 부가되어 있다)가 상기 단일 가닥 DNA와 혼성화되어, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소에 의해 상기 표적 RNA 서열과 상동적인 RNA로 전사되는 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA를 생성하고, 및 (4)상기 이중가닥 DNA가 RNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소에 의해 상기 특정서열과 상동적인 RNA 전사산물로 전사된다. 이 특정 서열을 가진 RNA 전사산물은 반응(1)에서 주형으로 되고, 상기 (1)~(4)의 반응은 RNA 및 DNA 합성을 촉매하는 효소가 그 기질을 완전히 사용하든가, 또는 불활성화 될 때까지 연속적으로 진행된다.

상기 실시형태에서, 제 2 프라이머로서 그 5'말단에 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열이 부가된 것을 사용된다(이하 제 1 실시형태라고 한다). 본 발명에서는, 제 1 프라이머로서 5'말단에 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열이 부가된 것을 사용해도 좋다(이하 제 2 실시형태라고 한다). 본 발명의 제 1 실시형태에서, 특정서열을 더욱 효율적으로 증폭함으로써 그 검출감도를 향상시키기 위해서, 상기 반응(1)에 선행하여, 특정서열을 포함하는 RNA가 특정서열의 5'말단에서 절단된다( JP-A-2000-14400).

RNA를 절단하기 위해서는, 이후 반응에서도 사용되는 리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소가, 예를 들면, 중복영역을 가지는 것으로, 특정서열의 5'말단에 인접하는 RNA 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드(절단용 올리고뉴클레오티드)의 존재하에서 사용될 수 있다. 절단용 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 아미노화 등의 예비 처리를 하는 것이 이 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 기능하는 것을 방지하기 위해 바람직하다.

종양세포의 미세전이를 검출하기 위해서는, 상기와 같이 해서 증폭된 특정서열의 존재를 검출해서 그 특정서열의 존재를 확인하거나 증폭된 특정서열의 양(RNA 카피수)으로부터 시료중에 존재하는 특정서열의 양(표적 RNA 카피수)을 추정할 필요가 있다. 특정서열은 예정 시간 동안 상기 반응을 수행한 이후에, 특정서열과 혼성화될 수 있는 고정화 및 표지화된 프로브를 사용하는 반응 용액으로 샌드위치법에 의해 검출할 수 있다. 그러나, 상기 특정서열과 혼성화될 수 있는 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 프로브는 반응(4)를 저해하지 않기 때문에, 그 존재하에서 상기 특정서열을 증폭하고, 특정서열의 증폭을 모니터링하는 것이 특히 바람직하다. 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 존재하에서 특정서열의 증폭을 행하는 경우에는, 그 프로브가 프라이머처럼 신장되는 것을 막기위해, 그 3' 말단에 글리콜산, 비오틴 등을 부가해 두는 것이 바람직하다. 증폭반응 동안 이 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 특정서열과 혼성화되어 발하는 형광신호를 형광검출기에 의해 측정한다. 이 형광 프로파일에서 얻어진 정보(형광색소가 발하는 형광의 강도가 일정 수준에 도달할 때까지 요구되는 증폭 시간 등)를 기지량의 표준 RNA에 대한 형광 프로파일에서 얻어진 정보와 비교하는 것에 의해, 그 특정서열의 존부를 확인하거나 증폭된 특정서열의 양(RNA 카피수)으로부터 시료중에 존재하는 특정서열의 양(표적 RNA 카피수)을 추정할 수 있다.

상기에서 기술한 것처럼, 기제(ready-made)의 검출 킷트를 준비해 두는 것이, 본 발명의 방법을 크게 촉진하게 된다. 검출 킷트는, 바람직하게는, 제 1 및 제 2 프라이머, 절단용 프라이머(제 1 실시형태의 경우), 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브, RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소, 리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소, RNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 및 이들 효소의 기질 등과 같이, 특정서열의 증폭 및 검출을 위해 필요한 모든 시약을 포함한다. 이들 모든 시약을 단일 용기에 넣을 수 있다는 점이 주목할만하다. 즉, 일정량의 시료를 단일 용기에 분주하기만 하면, 자동적으로 종양세포 RNA의 증폭 및 검출 반응이 일어난다. 이 용기에 있어서 유일한 요구사항은, 형광색소로부터의 신호를 외부에서 측정할 수 있도록 부분적으로 투명하기만 하면 된다는 것이다. 시료를 분주한 후에 밀폐할 수 있는 용기가, 오염을 방지하기 위해 특히 바람직하다.

이하에서, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 하지만, 본 발명은 결코 이들 특정 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본원 발명에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 사용해서, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA) RNA를 특이적으로 증폭했다. CEA RNA는, CEA 유전자의 뉴클레오티드 서열(National Center Biotechnology Information accession No.: M29540)을 포함하는 이중가닥 DNA의 in vitro 전사에 의해 준비 및 정제하였다. 본 실시예에 있어서, 특정서열은 후술하는 표 1에 나타난 전사산물을 의미하는 것이다.

(1) 시료인 CEA RNA(2109-mer)를, 260nm의 UV 흡수계측기에 의해 정량하고, RNA 희석액(10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mM EDTA, 0.5U/㎕ RNase inhibitor, 5.0mM DTT)을 이용해서 1.0×10⁴카피/5㎕로 희석했다. 콘트롤(nega)로는 희석액을 사용했다.

(2) 하기와 같은 조성의 반응 용액 20.8㎕를 0.5ml PCR 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨 엘머 제)에 분주하고, 상기 CEA RNA 시료 5.0㎕를 첨가했다.

반응 용액의 조성(효소용액 첨가후의 반응 용액에서의 최종농도)

60.0mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.6)

17.0mM 염화마그네슘

100.0mM 염화칼륨

1.0mM DTT

6U RNase Inhibitor (다카라 바이오 제 )

0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

3.0mM ATP, CTP, UTP

2.25mM GTP

3.6mM ITP

각 1.0μM의 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 1에 나타난 서열을 가지고, 표 1에서 나타난 조합으로 사용됨(제 2 올 리고뉴클레오티드 프라이머는 5'말단에 서열번호 23(T7 폴리머라제의 프로모터 서열)을 부가적으로 가짐)).

0.16μM의 절단용 올리고뉴클레오티드(표적 RNA를 제 2 프라이머와의 혼성화 부위에서 절단하기 위한 것으로, 3'말단은 아미노화되어 있다. (표 1)).

13.0% DMSO

용량 조정용 증류수

조합	제 1 프라이머	제 2 프라이머	절단용 프라이머	증폭산물의 길이(mer)
1	서열번호: 1	서열번호: 7	서열번호: 13	332
2	서열번호: 2	서열번호: 8	서열번호: 14	238
3	서열번호: 3	서열번호: 8	서열번호: 14	313
4	서열번호: 4	서열번호: 9	서열번호: 15	318
5	서열번호: 4	서열번호: 10	서열번호: 16	243
6	서열번호: 5	서열번호: 11	서열번호: 17	253
7	서열번호: 6	서열번호: 12	서열번호: 18	357

(3)상기 반응 용액을, 44℃에서 5분간 인큐베이팅한 후, 하기 조성으로 미리 44℃에서 2분간 인큐베이팅한 효소액 5.0㎕를 첨가했다.

효소액의 조성(반응시의 최종농도)

2.0% 소르비톨

8 U AMV 역전사효소(다카라 바이오 제)

142 U T7 RNA 폴리머라제(GIBCO제)

3.6㎍ 소 혈청 알부민

용량 조정용 증류수

(4)그리고나서, PCR 튜브를 44℃에서 30분간 인큐베이팅한 후, 특정 증폭산물을 3% 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석했다.

(5) 전기영동 후에는 SYBR Green II(다카라 슈조 제)로 염색했다.

전기영동 결과를 도 1에 나타냈다. 모든 조합에서 특정 RNA 증폭산물, 즉, 증폭된 특정서열(도 1의 괄호부분)이 얻어졌고, CEA 유래의 RNA 증폭에 유용한 것이 확인되었다.

실시예 2

인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 준비했다.

서열번호 19로 표시된 서열을 가지는 20-mer 올리고뉴클레오티드를 Label-ON Reagents (Clontech제)를 사용해서, 5'말단으로부터 5번째 뉴클레오티드(G)와 6번째 뉴클레오티드(A) 사이에, C₁₅의 링커를 통해 아미노기를 덧붙임으로써 수식하였고, 나아가 그 3'말단을 비오틴으로 수식했다. 종래의 인터컬레이터성 형광색소인 옥사졸 옐로우를 표지하여, 옥사졸 옐로우 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(서열번호 19)를 생성했다(도 2B, Ishiguro, T(1996)Nucleic Acids Res. 24(24)4992-4997).

실시예 3

본원발명에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 사용해서, 다양한 초기 카피수의 CEA RNA를 검출했다.

시료인 CEA RNA(2109-mer)를, 260nm에서 UV 흡수계측기에 의해 정량하고, RNA 희석액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1mM EDTA, 0.5U/㎕ RNase inhibitor, 5.0mM DTT)을 이용해서 1.0×10⁷~10²카피/5㎕로 희석했다. 콘트롤(nega)로는 희석액을 사용했다.

하기 조성의 반응 용액 20.0㎕를 0.5ml PCR 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨 엘머제)에 분주하고, 상기 CEA RNA 시료 5.0㎕를 첨가했다.

반응 용액의 조성(효소 용액 첨가후 반응 용액에서의 최종농도)

60.0mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.6)

17.0mM 염화마그네슘

100.0mM 염화칼륨

1.0mM DTT

0.25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

3.0mM ATP, CTP, UTP

2.25mM GTP

3.6mM ITP

각 1.0μM의 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 20) 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 12)(제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'말단에 서열번호 23(T7 폴리머라제의 프로모터 서열)을 부가적으로 가진다).

0.16μM의 절단용 올리고뉴클레오티드(서열번호 18; CEA RNA를 제 2 프라이머와 혼성화할 수 있는 위치에서 절단하기 위한 것으로, 3'말단이 아미노화 되어있 음)

6U RNase Inhibitor(다카라 바이오사제)

13.0% DMSO

용량 조정용 증류수

15.0 nM의 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(실시예 2에서 조제한 것).

(3)상기 반응 용액을, 44℃에서 5분간 인큐베이팅한 후, 하기 조성으로, 미리 44℃에서 2분간 인큐베이팅한 효소액 5.0㎕를 첨가했다.

효소액의 조성(반응시의 최종 농도)

2.0% 소르비톨

8 U AMV 역전사효소(다카라 바이오 제)

142 U T7 RNA 폴리머라제(GIBCO제)

3.6㎍ 소 혈청 알부민

용량 조정용 증류수

(4) PCR 튜브에서의 반응 용액의 형광 강도는 44℃에서 온도자동조정 형광분광광도계에 의해, 여기파장 470nm, 형광파장 510nm로, 직접 측정했다.

도 3은 10⁷카피/30㎕~10²카피/30㎕의 CEA RNA 초기 농도로, 0분에서의 효소액 첨가시로부터, 샘플의 형광강도비(소정 시각의 형광강도치/백그라운드의 형광 강도치)의 경시변화를 나타낸다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 형광 프로파일은 초 기 CEA RNA 농도에 의존하고, 미지 시료중에서의 CEA RNA를 정량할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 4

본원 발명에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합을 사용해서, 저분화형 위암세포주 MKN45에 의한 CEA RNA의 발현을 실제로 측정했다.

(1) 샘플링

저분화형 MKN45 위암세포를 RPMI 1640 배지(10% FCS 함유)에서 배양하여, 트립신 처리에 의해 디쉬(dish)에서 회수하고, 원심분리에 의해 배지로부터 분리한 후, 인산 완충화 생리식염수로 세정하였다. 세포 펠렛을 0.5mL TRIZOL 시약(인비트로젠사제)에 용해했다.

건강한 직원 지원자에 의해 기부된 혈액에서, 모노-폴리 분리 용액(다이니폰 제약사제)을 사용하여 정상 백혈구를 분리하고, 0.5mL TRIZOL 시약에 용해했다.

(2) RNA 분리

10⁶개의 MKN45 세포와 10⁶개의 정상백혈구의 용해체(0.5mL TRIZOL 시약에서 의)를 1.5mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 일회용의 호모지나이저(이에다 화학사제)를 사용하여 분쇄했다. 분쇄체는 실온에서 5분간 인큐베이트 되었고, 0.2mL의 클로로포름을 가하여, 15분간 볼텍스 믹서로 교반하고, 실온에서 4분간 정치후, 4℃에서, 15분간, 12000×G로 원심분리했다. 상층액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겨, 0.5mL 프로판올을 가하고, 쉐이킹(shaking)하여 혼합하고, 실온에서 10분 정치후, 4℃에서, 15분간, 12,000×G로 원심분리했다. 상층액을 제거한후, 펠렛에 1mL의 75% 에탄올 수용액을 가하여 혼합하고, 4℃에서, 5분간, 7500×G로 원심분리했다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 1시간 동안 에어-드라이 하고나서, RNA 희석액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1mM EDTA, 0.5U/㎕ RNase inhibitor, 5.0 mM DTT)에 용해하였다. 260nm에서 흡광계측기에 의한 RNA 농도 측정에 의해 정상 백혈구 10⁶개로부터 12.2㎍의 RNA가 추출된 반면, MKN45 10⁶개에서는 10.7㎍의 RNA가 분리되었음이 밝혀졌다.

(3) MKN45 RNA 측정

실시예 3에서와 동일한 조성의 반응 용액을 사용했다. 시료는, MKN45 RNA 100ng/5μL(10⁴개 상당)를 백혈구 RNA 120ng/5μL(10⁴개 상당)로 10배 희석해서, MKN45 RNA 10³개 상당, 10²개 상당, 10¹개 상당으로 준비했다. 네거티브 시료로는, 백혈구 RNA 120ng/5μL(10⁴개 상당)를 사용했다. CEA RNA는, 10³카피/5㎕와 10⁷카피/5㎕에서 측정했다.

도 4에 나타난 측정 데이터는 10⁴개의 정상 백혈구에서 최소한 10¹개 MKN45 를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다. 정상 백혈구 RNA(nega)에서는 아무것도 검출되지 않았다. 얻어진 결과에서, 본 발명은 정상 조직에서 미세전이 암세포를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5

다양한 초기 카피수의 CEA RNA를, 실시예 3에서와 동일한 조건하에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 사용해서 검출하였다.

그러나, 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 20을, 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 22를, 절단용 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 21을 가졌다. 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머는 그 5' 말단에 서열번호 23(T7 폴리머라제를 위한 프로모터 서열)을 부가적으로 가졌다.

10⁷카피/30㎕~10²카피/30㎕의 CEA RNA 초기 농도에서, 0분에서의 효소액 첨가시로부터, 샘플의 형광강도비(소정 시각의 형광강도치/백그라운드의 형광 강도치)의 경시변화를 도 5에 나타낸다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 형광 프로파일은 초기 CEA RNA 농도에 의존했고, 미지 시료중에서 CEA RNA를 정량할 수 있다는 것이 시사되었다.

나아가, 실시예 3의 결과와 비교했을 때, 각각의 초기 카피수에 대한 검출시간은 짧았다. 이는 본 실시예의 프라이머의 조합에 의해서 특히 신속한 검출이 제공될 수 있음을 시사한다.

2003, 5, 7에 출원된 일본 특허출원 2003-129360의 명세서, 특허청구범위, 도면 및 요약서를 포함하는 전체 내용이 여기에서 참조로서 통합되어 있다.

이상의 설명과 같이, 본 발명에 의하면, 비교적 저온 및 일정온도(35℃~50℃, 바람직하게는 44℃)에서, 단시간에 1단계 조작으로, 종양세포에서의 특정 RNA 서열을 증폭, 검출할 수 있으므로, 수술 시행중에 종양세포의 미세전이를 검출하는 것에 적용할 수 있다.

본 발명에서는, 표적 RNA로부터 DNA 의존성 DNA 폴리머라제를 위한 프로모터 영역을 가지는 이중가닥 DNA를 합성하고, 다음으로 단일가닥 RNA 생성을 비약적으로 증대시키기 위하여 상기 이중 가닥 DNA에서 다량의 단일가닥 RNA를 합성하고, 인터컬레이터성 형광색소로 표지된 프로브와 상기 RNA 전사산물의 혼성화에 의해 유발되는 형광증가를 측정하고, 형광강도의 증가를 분석함으로써, 단시간에 쉽게 시료중의 표적 RNA(종양세포 RNA에서의 특정 서열)의 초기 양을 결정할 수 있다.

본 발명이 일정온도로 수행될 수 있기 때문에, 복수의 다른 표적 RNA(종양세포에서의 특정 RNA서열)용 기제(ready-made) 검출 킷트가, 동일한 장치로 동시에 사용될 수 있으므로, 다른 종의 종양의 전이도 검출할 수 있다.

또한 본 발명은, 종양세포 RNA에서의 특정서열을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드의 조합, 즉 종양세포 RNA에서의 특정서열 증폭용의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 종양세포 RNA에서의 특정서열 검출용의 올리고뉴클레오티드의 조합을 제공함으로써, 간편, 신속한, 그리고 고감도의 종양세포 미세전이 검출방법 및 이를 이용한 검출 킷트를 제공한다.

<110> Tosoh Corporation <120> METHOD OF DETECTING MICROMETASTASIS <130> TOP04130KR <150> JP2003-129360 <151> 2003-05-07 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R4 <400> 1 tttgtagctt gctgtgtcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R6 <400> 2 tattattcac agtgatgttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R8 <400> 3 agactgtgat cgtcgtgact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R11 <400> 4 ttaattcgtt ctggattcca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R14 <400> 5 ctggctgagt tattggcctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R19 <400> 6 gagtctgggg gggaaatgat 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 <400> 7 accccaatgc atccctgctg atc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4 <400> 8 tacaaatgtg aaacccagaa ccc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F6 <400> 9 ataatagtgg atcctatacg tgc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 <400> 10 cagtctatgc agagccaccc aaa 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F11 <400> 11 aattaagtgt tgaccacagc gac 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F14 <400> 12 agccagtggc cacagcagga cta 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 <400> 13 tggggtatat tatctctcga ccac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S4 <400> 14 tttgtagctt gctgtgtcat ttct 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S6 <400> 15 tattattcac agtgatgttg ggga 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S8 <400> 16 agactgtgat cgtcgtgact gtgg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S11 <400> 17 ttaattcgtt ctggattcca cact 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S14 <400> 18 ctggctgagt tattggcctg gcag 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INAF <400> 19 tgctggagat ggagggcttg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R16-8 <400> 20 gttcacaggt gaaggccaca 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S2-1 <400> 21 tgttggagat aaagagctct tgtg 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2-1 <400> 22 ccaacatcac tgagaagaac agc 23 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter sequence <400> 23 aattctaata cgactcacta tagggaga 28

Claims

환자의 종양 원발소 이외의 부위에서 얻어진 시료에서, 종양세포에서 유래한 RNA에서의 특정서열 일부와 상보적인 서열번호 20의 제 1 프라이머 및 상기 특정서열 일부와 상동적인 서열번호 22의 제 2 프라이머(이때 제 2 프라이머는 5' 말단에 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 부가적으로 가진다)를 사용하는 방법으로서, (1)주형으로 상기 특정서열을 사용하여 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 cDNA를 합성하고, (2)리보뉴클레아제 H 활성을 가지는 효소에 의해 RNA-DNA 이중가닥에서 RNA 가닥을 분해하고(단일가닥 DNA의 생성), (3)상기 단일가닥 DNA를 주형으로 하여 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의해 상기 특정서열과 상보적이거나 상동적인 RNA로 전사될 수 있는 프로모터 서열을 가지는 이중가닥 DNA를 형성하고, 및 (4)RNA 폴리머라제 활성을 가지는 효소 작용에 의하여 상기 이중가닥 DNA를 RNA 전사산물(상기 반응(1)에서 이후 cDNA 합성에서 주형으로 된다)로 전사하고, 상기 mRNA를 검출하는 것을 포함하는 종양세포 미세전이를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 종양세포에서 유래한 RNA가 암태아성 항원(CEA) RNA인 종양세포 미세전이를 검출하는 방법.
서열번호 20과, 서열번호 22로 표시되는 각 서열의 적어도 연속하는 10 염기 이상을 포함하는 프라이머 쌍.
제3항의 프라이머 쌍을 포함하는 종양세포 미세전이의 검출 킷트.