JP5310764B2 - 微小転移の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍細胞の微小転移の検出法、該方法でプライマー等として好適に使用されるポリヌクレオチド（ＣＥＡ検出用）、そしてこれらポリヌクレオチドを含有する腫瘍細胞の微小転移の検出キットに関するものである。本発明の腫瘍細胞の微小転移の検出法は、一定温度下、１段階の操作で腫瘍細胞に由来するＲＮＡを増幅し検出する方法であるため、迅速な検出ができ、例えば手術による腫瘍細胞の除去前に実施することが可能である。

癌細胞は原発巣部位から放出され、血流やリンパ液流を経由して広がり、遠方の臓器に微小転移を形成する。この微小転移によって原発巣の根治的切除が成功したにも関わらず再発する症例があることにより、原発巣のみならず周辺のリンパ節の切除（リンパ節郭清）が標準術式となっているが、リンパ節郭清で再発を防ぐことができたとしても後遺症（むくみ等）で生活レベルの低下を余儀なくされている患者が多いことも問題となっている。

そこで、再発を防ぎ、かつ、切除範囲をできるだけ縮小することが現代の腫瘍外科手術の目標となっているが、そのためには微小転移を正確に捕らえなくてはならない。ところが術前の画像診断による微小転移の検出では検出感度や特異性が十分といえないため、術中に被験者の組織等をサンプリングして代表切片を顕微鏡で調査する必要があった。

最近では癌特異的な遺伝子の発現に伴い生成されるｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し検出することで腫瘍細胞を検出する研究が盛んに行われている（非特許文献１から３）。

また、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法として、特許文献１から３のような方法が知られている。

Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ｇ．，Ａｓｃｉｅｒｔｏ ＰＡ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９，１４３７−１４４３、２００１年

Ｎｏｇｉ Ｈ．，Ｔａｋｅｙａｍａ Ｈ．，ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，１０，７４−８１、２００３年 特許第２６５０１５９号 Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒ．，Ｗａｌｋｅｒ Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，７８１７−７８２３、２００２年 特許第３２４１７１７号 特開２０００−１４４００号

非特許文献１から３に開示されたＲＴ−ＰＣＲ法では、反応液温度を急激に昇温し降温するという繰り返し操作が必要であり、またその操作の複雑さから熟練を要するうえ、逆転写とＰＣＲ法による増幅という、二段階以上の工程が必要となるという課題がある。この結果ＲＴ−ＰＣＲ法では、検出結果を得るまでに長時間が必要（例えば逆転写反応は３０から６０分、ＰＣＲ反応は３０から６０分を要することが一般的である）となることに加え、特にＲＴ反応後ＰＣＲ反応を開始する際に試料間のコンタミネーションが行いよう注意する必要がある。一段階の工程で実施可能なＲＴ−ＰＣＲ法も開発されており、該方法によれば時間の短縮化は可能であるものの、検出感度は１０^３から１０^５コピー程度と、なおも十分とは言えない。

更にＲＴ−ＰＣＲ法で感度を高めようとすると、増幅し検出する対象ＲＮＡごとに、例えば温度の昇降条件等の増幅条件を最適化する必要がある。しかしながら微小転移の検出においては、例えばＣＥＡ（癌胎児性抗原）、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ２０及びβ ａｃｔｉｎ、又は、はＭａｍｍａｇｌｏｂｉｎ Ａ、ＳＣＣ抗原（扁平上皮癌関連抗原、Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ）及びＰＢＧＤ（Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）等というように、複数の腫瘍遺伝子のｍ−ＲＮＡを同時に増幅し検出することが必要となる場合がある。このような場合に前記した最適化条件が異なってしまうと、実際のところ複数のｍ−ＲＮＡを同一の温度昇降装置で処理することが困難となって複数回の検出を行わざるを得なくなり、検出結果を得るまでにますます時間が必要となる。

ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに変換した後、反応液を昇降温してＤＮＡを増幅するいわゆるＰＣＲを実施するＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、反応液の昇降温なしにＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法が知られている（例えば特許文献１に記載されたＮＡＳＢＡ法、特許文献２に記載されたＴＭＡ法、特許文献３に記載された増幅・検出法等）。これらの方法では、例えば、その転写によって特定配列のＲＮＡ転写産物を生成する、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成することを含む方法である。

より具体的には、例えば、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定配列に対して、（１）その３’端に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（２）この逆転写によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解し、１本鎖ＤＮＡを生成させ、（３）この１本鎖の３’端に相補的で、それ自身がその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記したプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（４）この２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定配列のＲＮＡ）を生成するのである。ＲＮＡ転写産物は特定配列のＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（２）以降の反応が進行してＲＮＡ増幅の連鎖反応が引き起こされる。

これら方法の特徴は、ＰＣＲのように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の連鎖的増幅反応を分けて実施することがない、とう点にある。

そこで本発明の目的は、被験者における腫瘍細胞の原発巣部位以外から得られた試料に対し、これらのような方法を適用して腫瘍細胞由来のＲＮＡを増幅・検出することにより、結果的に腫瘍細胞の微小転移を一定温度、１段階操作で、迅速に（例えば手術施行中に）検出可能な方法を提供することにある。

前記の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、被験者における腫瘍細胞の原発巣部位以外から得られた試料に対して、腫瘍細胞由来のＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー及び特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第１又は第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列又は特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、及び、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行うことにより前記ｍ−ＲＮＡを検出する、腫瘍細胞の微小転移の検出法である。

本願請求項２の発明は、前記請求項１の発明に係り、腫瘍細胞のＲＮＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であることを特徴とする。

本願請求項３の発明は、前記請求項３の方法でプライマー等として好適に使用される、配列番号１〜２２に示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。

そして本願請求項４の発明は、請求項３に記載のポリヌクレオチドを含有する腫瘍細胞の微小転移の検出キットである。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅する方法を採用することにより、腫瘍細胞の微小転移を一定温度、１段階操作で、迅速に（例えば手術施行中に）検出可能である。特に、転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（特許第３１８９０００号公報参照）を反応液に共存させておけば、特定配列又はそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することもできる。モニタリングに用いるプローブは、特定配列又はそれに相補的な配列と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドに、該ヌクレオチドが転写産物と相補結合すると結合していない状態と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素を結合したものであり、本発明を実施するにおいて前記モニタリングは最も好適な形態である。なお、オリゴヌクレオチドへのインタカレーター性蛍光色素の標識方法は特に限定はないが、リン原子からリンカーを介して結合する方法が望ましい。結合方法としては先ず、オリゴヌクレオチドの鎖内または末端にアミノ基等の官能基を導入し、インタカレーター性蛍光色素にも必要であればオリゴヌクレオチドへ導入した官能基と反応又は結合可能な官能基を導入し、双方の官能基同士を結合させることが例示できる。より詳細には、特願２０００−１５４４３１号又はＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７に記載されている（本明細書の図２Ａ参照）。更に、オリゴヌクレオチド鎖内あるいは末端への官能基の導入方法も特に限定はないが、Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を例示することができる（図２Ｂ）。

本発明は、一定温度で実施することができるが、その温度は３５℃から５０℃（好ましくは４４℃）と比較的低温である。本発明は、腫瘍細胞の微小転移を、被験者における腫瘍細胞の原発巣部位以外から得られた試料に対して実施することによって検出するものである。本発明によってその微小転移を検出し得る腫瘍細胞は、特異的なＲＮＡを転写している腫瘍細胞、又は、特異的ではないものの、正常細胞とは異なる転写量で任意のＲＮＡを発言しているものであれば特に制限はない。

本発明において、腫瘍細胞の微小転移検出のために直接的な増幅・検出対象とされるＲＮＡは、例えば、ｓｒｃ、ｅｒｂＢ、ｓｉｓ、ｒａｓ、ｍｙｃ又はｆｏｓ等の癌遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＤＥＫ−ＣＡＮ又はＥ２Ａ−ＰＢＸ等から転写されるｍ−ＲＮＡ、そして癌胎児性タンパク質として知られるＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＦＰ（ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＯＡ（ｐａｎｃｒａｔｉｃ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＮＳＥ（ｎｅｕｒｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ）、ＳＣＣ（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＢＦＰ（ｂａｓｉｃ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、γＳｍ（γ−ｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＰ１（β１−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＡＦ（ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ２０、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ、α ｍａｃｒｏｇｌｏｂｉｎ等をコードする遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡ、癌性異所産生物質であるＥｌａｓｔａｓｅ−１、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＩＣＤＨ（ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）等の癌性アイソザイム等をコードする遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡ、ＡＤＨ（ａｎｔｉｄｉｕｒｅｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＡＣＴＨ（ａｄｏｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＣＲＦ（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＳＨ（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＰＲＬ（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、βＨＣＧ（β ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）又はｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ等のホルモン等をコードする遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡ、そしてＩＡＰ（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＩＶＫＡ ＩＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＨＢＧ（ｓｅｘ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）等の癌性異常タンパク質（ポリペプチド）等をコードする遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡを例示することができる。中でもＣＥＡに関するＲＮＡは、正常細胞ではほとんど転写されていない、腫瘍細胞に特異的なＲＮＡであり、増幅・検出対象として特に好適である。

本発明の実施に当たっては、まずどのＲＮＡを検出対象とするかを決定し、次にそのＲＮＡ中に存在する特定配列を決定し、そして決定された特定配列に基づいて本発明の実施に使用する第１及び第２プライマー等の配列をデザインすることになる。例えば配列番号１〜２２に示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、実施例において述べるように、ＣＥＡをコードする遺伝子から転写されるｍ−ＲＮＡの検出プライマー等として特に好適な配列の一例を示したものである。

腫瘍細胞の原発巣部とは、最初に腫瘍が発生した部位を意味する。本発明では、前記腫瘍細胞の原発巣部以外から得られた試料を使用する。ここで試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明では、例えば被験者における腫瘍細胞の原発巣部位以外から得られた組織等を材料として、例えば特開平７−５９５７２号等に記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、前記例示したようなＲＮＡを直接的な増幅・検出対象とすることで、当該試料の由来元である組織等に腫瘍細胞が微小転移しているか否かを検出するのである。

以下に本願発明を更に具体的に説明する。試料中に、増幅・検出対象とした腫瘍細胞由来のＲＮＡが存在した場合には、（１）該ＲＮＡ中に存在する特定配列を鋳型として、第１のプライマー（特定配列の３’末端領域に相補的配列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリラーゼによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、（２）次いでリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡが分解されて１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、（３）該１本鎖ＤＮＡに対し第２のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配列で、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記標的ＲＮＡ配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、（４）該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素存在下で前記特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成されるが、このＲＮＡ転写産物は特定配列からなるＲＮＡであるため（１）の反応における鋳型となり、結果として上記（１）から（４）の反応はＲＮＡやＤＮＡを生成する際の酵素基質が使い尽くされるか、又は、上記の各種酵素が失活するまで連鎖的に生じることになる。

上記例は第２プライマーとしてその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたものを用いる例（以下第１形態という）である。本発明では、第１プライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加して使用しても良い（以下第２形態という）。第１形態で本発明を実施する場合には、特定配列の増幅効率を高めてその検出感度を向上させるために、前記（１）の反応に先立って、特定配列を含むＲＮＡを特定配列の５’末端で切断しておく必要がある（例えば特許文献３参照）。

ＲＮＡを切断する方法としては、例えば、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を共存させ、後の反応でも使用されるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させて切断する方法を例示することができる。ここで、切断用オリゴヌクレオチドの３’末端は、このオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能しないよう、例えばアミノ化等の処理を施しておくことが好ましい。

腫瘍細胞の微小転移を検出するためには、上記のようにして増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定する必要がある。特定配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行った反応液に対して、特定配列に対して相補的に結合し得る固定化及び標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定配列に特異的に結合する、インタカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。またこのプローブは前記（１）から（４）の反応を阻害しないため、その存在下で上記特定配列の増幅を実施して、特定配列の増幅の様子をモニタリングすることが特に好ましい。なお、インタカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定配列の増幅を行う場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加する等しておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインタカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特定配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出機によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した増幅反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、その存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。

以上に記載した本発明の方法は、予め検出キットを用意しておくことにより、極めて簡単に実施することが可能である。検出キットは、好ましくは、第１及び第２のプライマー、（第１形態で本発明を実施するのであれば）切断用プライマー、インタカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、これら酵素の基質等の、特定配列を増幅し検出するために必要な全ての試薬を含むものであるが、これら全ての試薬を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的に腫瘍細胞由来のＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。

以上の説明のように、本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４４℃）条件下で、増幅反応から検出までを１段階の操作で、短時間に、腫瘍細胞由来のＲＮＡを増幅、検出することができる。したがって、手術施行中に腫瘍細胞の微小転移を検出することに応用可能である。

本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（腫瘍細胞由来のＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、短時間に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。

また、一定温度であるために，複数の標的ＲＮＡ（腫瘍細胞由来のＲＮＡ）の増幅、検出を同時に、１つの装置で実施できる。

そして、上記の結果、本発明によれば、一段階操作で、腫瘍細胞に由来するＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを提供すること、すなわち腫瘍細胞由来ＲＮＡの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合わせを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度な腫瘍細胞の検出方法ならびに検出キットを医療分野に提供することが可能となる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて，癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）ＲＮＡの特異的増幅を行った。なおＣＥＡ ＲＮＡとは、ＣＥＡの塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．： Ｍ２９５４０）を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。そして本実施例における特定配列は、後述する表１における転写産物を意味するものである。

（１）ＣＥＡ ＲＮＡ（２１０９ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０^４コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。

（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＣＥＡ ＲＮＡ試料５．０μｌを添加した。

反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１７．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００．０ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマーと第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列及び使用したプライマーの組合せは表１の通り）。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号２３（Ｔ７ポリメレースのプロモータ配列）を付加して使用した。

０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（標的ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化されている。表１参照）。

１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水

（３）上記の反応液を、４４℃で５分間保温後、以下の組成の予め４４℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。

酵素液の組成（反応時の再終濃度）
２．０％ ソルビトール
８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ（株）製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを４４℃に３０分間保温した後、特定の増幅産物を３％アガロースゲルを用いた電気泳動により分析した。

（５）電気泳動後の染色にはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造製）を用いた。

電気泳動結果を図１に示した。いずれの組み合わせでも、特異的なＲＮＡ増幅産物、即ち増幅された特定配列（図１の括弧部分）が得られた。このことから、これらのオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＣＥＡに由来するＲＮＡの増幅に有用であることが示された。

実施例２
インタカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。

配列番号１９に記載の配列中の５’末端から５番目の塩基（Ｇ）と６番目の塩基（Ａ）の間に、Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて炭素数１５のリンカーを介してアミノ基を修飾結合した、２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを調製した。さらにその３’末端をビオチンで修飾した。これに、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１９）を調製した（図２Ｂ、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。

実施例３
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて、ＣＥＡ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。

（１）ＣＥＡ ＲＮＡ（２１０９ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０^７〜１０^２コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。

（２）以下の組成の反応液２０．０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。

反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１７．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００．０ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２０）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２）。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号２３（Ｔ７ポリメレースのプロモータ配列）を付加して使用した。

０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１８；ＣＥＡ ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）
６Ｕ リボヌクレエース インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
１５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（実施例２で調製したもの）。
（３）上記の反応液を、４４℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、予め４４℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。

酵素液の組成（反応時の再終濃度）
２．０％ ソルビトール
８ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ（株）製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４４℃保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。

酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図３に示した。ＲＮＡサンプル濃度は１０^７コピー／３０μｌから１０^２コピー／３０μｌである。図３より、ＣＥＡ ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＥＡに由来するＲＮＡ量を検出することが可能であることが示唆された。

実施例４
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて，実際の低分化型胃癌細胞株ＭＫＮ４５が発現するＣＥＡを測定した。

（１）サンプル採取。
低分化型胃癌細胞株ＭＫＮ４５をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ含有）で培養後、トリプシン処理によって細胞をディッシュから剥離、回収した。遠心分離により培地を除き、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した後、細胞ペレットを０．５ｍＬ ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製）に溶解した。

また、社内の健康ドナーボランティア採血より、モノ・ポリ分離溶液（大日本製薬社製）で正常白血球を分離し、０．５ｍＬ ＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解した。

（２）ＲＮＡ抽出。

１０^６個のＭＫＮ４５と正常白血球をそれぞれ１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ（０．５ｍＬ ＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解している）、使い捨て可能なホモジナイザー（家田社製）にて細かく裁断した。さらに０．５ｍＬ ＴＲＩＺＯＬ試薬を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。室温に５分間静置した後、０．２ｍＬのクロロホルムを加え、１５秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。室温に３分間静置後、４℃、１５分間、１２０００ｘＧで遠心した。上清を新たなエッペンドルフチューブに移し、０．５ｍＬプロパノールを加え、転倒混和した。室温１０分静置後、４℃、１５分間、１２０００ｘＧで遠心した。上清を除去し、ペレットに１ｍＬの７５％エタノール水溶液を加え、４℃、５分間、７５００ｘＧで遠心した。上清を取り除き、ペレットを１時間、風乾した。その後、ペレットをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度測定値から濃度を算出した。ＭＫＮ４５ １０^６個からは１０．７μｇのＲＮＡが抽出され、正常白血球１０^６個からは１２．２μｇのＲＮＡが抽出された。

（３）ＭＫＮ４５抽出物の測定。

試薬組成は実施例３と同様で実施した。サンプルは、ＭＫＮ４５抽出物１００ｎｇ／５μＬをＭＫＮ４５ １０^４個相当とし、さらにこれを正常白血球抽出物１２０ｎｇ／５μＬ（１０^４個相当）で１０倍づつ希釈して、ＭＫＮ４５の１０^３個相当，１０^２個相当、１０^１個相当とした。ｎｅｇａには正常白血球抽出物１２０ｎｇ／５μＬ（１０^４個相当）を用いた。ＣＥＡ ＲＮＡは、１０^３コピー／５μｌと１０^７コピー／５μｌを測定した。
測定データを図４に示した。１０^４の正常白血球中のＭＫＮ４５は１０^１個まで検出できた。正常白血球抽出物（ｎｅｇａ）は検出しなかった。得られた結果から、本発明は正常組織中の微小な癌細胞を検出しうることを証明した。

実施例５
本願発明による、別のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、ＣＥＡ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を実施例３と同様に行った。ただし、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２０、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２２を使用した。なお、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５‘末端には配列番号２３（Ｔ７ポリメレースのプロモータ配列を）付加して使用した。切断用オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号２１を使用した。

酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図５に示した。ＲＮＡサンプル濃度は１０^７コピー／３０μｌから１０^２コピー／３０μｌである。図５より、ＣＥＡ ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＥＡに由来するＲＮＡ量を検出することが可能であることが示唆された。

また、実施例３の結果よりも、各初期コピー数の検出時間が早くなり、プライマーの組み合わせとして、この組み合わせが特に好適であることが示された。

実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０^４コピー／３０μｌにおいて、ＲＮＡ増幅反応を様々なプライマーの組み合わせにより行った結果である。ｎｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。レーンＭが分子量マーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４，ニッポンジーン（株）製））、レーン１が組合せ１のｎｅｇａ、レーン２が組合せ１の１０^４コピー、レーン３が組合せ２のｎｅｇａ、レーン４が組合せ２の１０^４コピー、レーン５が組合せ３のｎｅｇａ、レーン６が組合せ３の１０^４コピー、レーン７が組合せ４のｎｅｇａ、レーン８が組合せ４の１０^４コピー、レーン９が組合せ５のｎｅｇａ、レーン１０が組合せ５の１０^４コピー、レーン１１が組合せ６のｎｅｇａ、レーン１２が組合せ６の１０^４コピー、レーン１３が組合せ７のｎｅｇａ、レーン１４が組合せ７の１０^４コピーである。なお、図中に、各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたときの特異的増幅バンドを括弧で示した。 実施例２〜４で用いたインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの、インターカレーター性蛍光色素（この実施例ではオキサゾールイエロー）との結合部分の化学構造である。Ｂ^１、Ｂ^２、Ｂ^３、Ｂ^４は核酸塩基を示す。特願２０００−１５４４３１またはＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７に記載の方法で作製した場合（図２Ａ）と、Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてヌクレオチド鎖内に官能基を導入して作製した場合（図２Ｂ）である。 実施例３で行った初期ＲＮＡ量１０^７コピー／３０μｌから１０^２コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた。 実施例３と同様の試薬組成でＭＫＮ４５抽出物を測定したときのグラフである。ｎｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルのことである。１０^４はＭＫＮ４５ １０^４個相当の抽出物である。１０^３は正常白血球１０^４個中のＭＫＮ４５ １０^３個相当の抽出物である。１０^２は正常白血球１０^４個中のＭＫＮ４５ １０^２個相当の抽出物である。 １０^１は正常白血球１０^４個中のＭＫＮ４５ １０^１個相当の抽出物である。ｎｅｇａは正常白血球１０^４個相当の抽出物である。ｃａｌ１０^７はＣＥＡ ＲＮＡ１０^７コピー／５μＬ、ｃａｌ１０^３はＣＥＡ ＲＮＡ１０^３コピー／５μＬである。 実施例５で行った初期ＲＮＡ量１０^７コピー／３０μｌから１０^２コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた。

Claims (1)

1. 被験者における腫瘍細胞の原発巣部位以外から得られた試料に対して、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）由来のｍ−ＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の３’末端領域に相補的な配列を有する配列番号２０に記載した第１のプライマー、特定配列の５’末端領域に相同的な配列を有する配列番号２２に記載したオリゴヌクレオチドの５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した第２のプライマー、及び特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有する配列番号２１に記載した切断用オリゴヌクレオチドを用いて、
   （１）切断用オリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により、特定配列の５’末端側でＲＮＡを切断し、
   （２）第１のプライマーが特定配列と相補結合して、ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、
   （３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
   （４）第２のプライマーが１本鎖ＤＮＡと相補結合して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、
   （５）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成し、このＲＮＡ転写産物が前記（２）の反応における鋳型となる、
   反応を行ない、増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、又は、増幅された特定配列量から試料中に存在した特定配列量を推定することで、腫瘍細胞の微小転移を検出する方法。

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