CN112375847A - 一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学生物技术研究领域，本发明公开一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，步骤包括：1、设计crRNA序列并通过体外转录合成；2、使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物；3、合成与纯化乙型肝炎病毒RNA；4、使用Cas13a酶和能够同时识别HBV B型和C型病毒的HBV crRNA进行检测方法的灵敏度测试；5、使用Cas13a酶和crRNA对含有HBV B型或C型基因组DNA的质粒进行酶切荧光测试。与目前常规的检测手段相比，本发明公开的方案具有操作简单，灵敏度高，价格低的特点，同时在其特异性识别区域含有额外的发卡结构，以提高检测高特异性，可以在1‑2小时内实现对HBV基因型的区分。

Description

一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测 方法
技术领域
本发明属于医学生物技术研究领域，涉及一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)仍是世界范围内的一个公共卫生问题，超过3.5亿感染者可能罹患终末期肝病和肝细胞癌(HCC)。中国是乙型肝炎高流行地区，因为超过 8％的人口报告有慢性HBV感染。HBV可分为10个基因型，标记为A到J，在核苷酸序列上分布明显。基因型B和C主要分布在大洋洲和亚洲，包括中国，而基因型A和D分布在非洲和欧洲。研究证据表明，了解基因型对疾病进展和确定有效的抗病毒治疗有重要意义。例如，B型和C型感染的慢性发生率低于A型和D 型。基因型被认为与围产期感染和不良预后关系更密切，而B型则表现出更好的治疗效果。总之，乙型肝炎病毒基因分型可能对临床结果和抗病毒治疗有显著影响。
成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR-相关的(Cas)核酸酶系统在分子诊断中的应用已引起广泛关注。Cas13a酶是一种由CRISPR RNA(crRNA) 引导的RNA核酸内切酶，可在crRNA的指引下和靶标RNA特异性结合并激活核酸酶活性，是一种很有前景的RNA传感平台工具。由于CRISPR-Cas系统对多种核酸靶标具有较高的特异性，已经有研究证明了单核苷酸变异(SNVs)/单核苷酸多态性(SNPs)检测的可行性。这些特性表明CRISPR-Cas系统可以作为一个基因分型平台。
目前，用于HBV基因型的诊断通常分为以下几种方法，包括基因型特异性 PCR，线性探针检测，限制性片段长度多态性(RFLP)，实时PCR，反向杂交，直接测序和荧光偏振测定等。但是使用线性探针法检测HBV基因型的稳定性较差，仅靠碱基互补配对原则对不同基因型进行区分，检测结果容易受到客观因素如反应缓冲液、pH值等干扰，且检测灵敏度较低，对于少量样本进行检测时，难度较大，不太适用于临床快速检测的需求。PCR技术的HBV基因分型方法虽然具有灵敏度高的优势，但是需要专门的热循环仪和相关技术人员操作，且相关探针设计比较复杂，不太适用于技术贫乏地区的现场快速检测需求。限制性片段长度多态性(RFLP)方法成本较低，原理简单，但是灵敏度较差，且操作过程繁琐，使其临床应用受到较大的限制。利用HBV基因组DNA直接测序的方法进行分型检测的成本较高，不适用于发展中国家患者的就诊需求，且技术要求太高，不适用于大多数检测场景。
因此，开发一种灵敏，快速，低成本，易于使用且高特异性的方法用于乙型肝炎病毒基因分型的临床诊断至关重要。所以本领域技术人员致力于研发一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法。
发明内容
为了提供一种灵敏，快速，低成本，易于使用且高特异性的方法用于乙型肝炎病毒基因分型的检测手段，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型检测方法，该方法包括以下步骤：
1、设计crRNA序列并通过体外转录合成；
2、使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物；
3、合成与纯化乙型肝炎病毒RNA；
4、使用Cas13a酶和能够同时识别HBV B型和C型病毒的HBV crRNA进行检测方法的灵敏度测试；
5、使用Cas13a酶和B基因型特异性的crRNA对含有HBV B型或C型基因组DNA的质粒进行酶切荧光测试。
进一步地，步骤1又可以分为四个步骤：
A1首先合成与crRNA互补的DNA序列作为体外转录的模板，应注意，在该 DNA序列的3’末端应延伸一段T7启动子的互补序列，如SEQ ID NO:13所示，为后续的T7体外转录做准备；
A2然后将DNA模板和一段短的T7启动子序列，如SEQ ID NO:14所示，在 1x退火缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 7.5),10mM EDTA,1M NaCl)中进行退火反应，首先在95℃孵育10分钟，然后使其缓慢冷却至室温；
A3退火反应结束后，使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃过夜孵育进行crRNA的体外转录。转录反应包含NTP缓冲液混合物(每个NTP终浓度为10mM)、T7RNA聚合酶混合物、模板DNA(2μg)、小鼠RNase抑制剂(1U/μL)；
A4体外转录反应完成后，向系统中加入适量的无RNase的DNase I(总共4个单位)，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板。最后用2倍体积的RNAXP清洁磁珠对转录后的crRNAs进行纯化，并在-20℃保存。所得的crRNAs使用Nanodrop 进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素/PAGE)进行验证分析。
进一步地，步骤2中的RPA引物的前向引物序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，步骤2中的RPA引物的反向引物序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，步骤3的具体步骤为：
B1、首先利用设计好的RPA引物对通过RPA试剂盒对含有HBV DNA的质粒进行扩增；
B2、扩增后的产物再使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃孵育过夜进行体外转录；
B3、体外转录反应完成后，向系统中加入适量的无RNase的DNase I(总共4 个单位)，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板；
B4、得到的HBV体外转录产物通过MEGAclear转录纯化试剂盒进行纯化，然后使用Nanodrop进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素 /PAGE)进行验证分析。
进一步地，步骤4的具体步骤为：在不与RPA扩增结合的条件下进行灵敏度测试。此检测体系中包含45nM Cas13a酶，22.5nM HBV crRNA，250nM荧光报告分子，1U/μL小鼠RNA酶抑制剂，以及不同量的靶标HBV RNA和1x测试缓冲液，测试缓冲液中含有40mM Tris-HCl,60mM NaCl,以及6mM MgCl2,pH 7.5。单次反应的总体积为20μL，在酶标仪中反应2小时，反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次体系内荧光信号。
进一步地，步骤5中将CRISPR-Cas13a技术与RPA扩增相结合，将所有试剂集成在一个独立的管中，测试时只需要向体系中加入不同的crRNA和待测质粒。
进一步地，步骤5的酶解荧光测试方法包括以下步骤：
C1、预先在离心管中加入HBV的RPA前向引物和反向引物各0.48μM，1x RPA 缓冲液，1UμL-1小鼠RNA酶抑制剂，四种rNTP各2mM，1μL T7聚合酶，45 nM Cas13a酶，250nM荧光报告分子(5’FAM-UUUUU-3’BHQ1)，5mM氯化镁，以及14mM醋酸镁。荧光报告分子为只含5个碱基的短链RNA，其一端修饰了荧光基团FAM，另一端修饰了荧光淬灭基团BHQ1。当此报告分子处于完整状态时，由于荧光共振能量转移(FRET)作用，荧光信号被淬灭，体系不会发荧光。一旦 Cas13a酶在crRNA的指引下被靶标序列激活其RNA酶活性，即可切断此短链 RNA，从而荧光基团与淬灭基团距离变远，荧光淬灭机制失效，体系发荧光。
C2、向上述离心管中按照需要加入不同的crRNA(终浓度为22.5nM)和待测的适量HBV DNA，在酶标仪中反应2小时，反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次体系内荧光信号。
本发明的有益效果：
1、灵敏度高，检测灵敏度低于临床对于HBV DNA的检出需求：2000IU/ml。能够实现对少量样本的快速精确检测。
2、本申请中所设计的部分crRNA，在其特异性识别区域含有额外的发卡结构，提高检测高特异性，能够精确地将不同基因型的HBV进行区分，可确保准确性。
3、快速，节省了检测分型的时间，可以在1-2小时内实现对HBV基因型的区分。
4、操作简单，免去繁琐的操作过程，尽可能节省检测人员的时间成本。测试人员只需向检测体系中加入适量的待测样本即可得到检测结果。
5、成本低，所需用到的技术和方法价格合理。
附图说明
图1、基于CRISPR-Cas13a的HBV基因分型平台原理示意图；
图2、HBV crRNA的序列设计示意图；
图3、使用HBV crRNA对200pM的HBV B型和C型RNA进行Cas13a酶切荧光检测的终点荧光信号强度示意图；
图4、使用CRISPR-Cas13a技术对HBV B型靶标RNA进行灵敏度测试的结果示意图；
图5、将CRISPR-Cas13a技术和RPA扩增结合所得到的灵敏度测试结果示意图；
图6、两种不同的HBV B型特异的crRNA1和crRNA2的序列设计示意图；
图7、crRNA1和crRNA2分别B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA识别时的碱基互补配对模型示意图；
图8、使用crRNA1对B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA进行分型检测时的荧光信号强度示意图；
图9、使用crRNA2对B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA进行分型检测时的荧光信号强度示意图；
图10、在crRNA的特异性识别区域引入了额外的发卡结构的hs-crRNA1序列设计示意图；
图11、在crRNA的特异性识别区域引入了额外的发卡结构的hs-crRNA2序列设计示意图；
图12、使用hs-crRNA1对B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA进行分型检测时的荧光信号强度示意图；
图13、使用hs-crRNA2对B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA进行分型检测时的荧光信号强度示意图；
图14、使用hs-crRNA1对不同浓度的B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA 进行检测时的荧光信号强度示意图；
图15、使用hs-crRNA2对不同浓度的B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA 进行检测时的荧光信号强度示意图。
具体实施方式
实施例1
HBV病毒基因组DNA的RPA引物设计
1、使用NCBI Primer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物，该引物对HBV B型和C型病毒都有效，即只需要这一对 RPA引物即可实现对HBVB型和C型病毒的扩增。
2、经筛选，本发明中最后使用的RPA引物对为：前向引物序列如SEQ ID NO:1 所示和反向引物序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2：
设计crRNA序列并通过体外转录合成
1、首先合成与crRNA互补的DNA序列作为体外转录的模板，应注意，在该 DNA序列的3’末端应延伸一段T7启动子的互补序列，如SEQ ID NO:13所示，为后续的T7体外转录做准备。
2、然后将DNA模板和一段短的T7启动子序列，如SEQ ID NO:14所示，在 1x退火缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 7.5),10mM EDTA,1M NaCl)中进行退火反应，首先在95℃孵育10分钟，然后使其缓慢冷却至室温。
3、退火反应结束后，使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃过夜孵育进行crRNA的体外转录。转录反应包含NTP缓冲液混合物(每个NTP终浓度为10mM)、T7RNA聚合酶混合物、模板DNA(2μg)、小鼠RNase抑制剂(1U/μL)。
4、体外转录反应完成后，向系统中加入适量的无RNase的DNase I(总共4个单位)，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板。最后用2倍体积的RNAXP清洁磁珠对转录后的crRNAs进行纯化，并在-20℃保存。所得的crRNAs使用Nanodrop 进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素/PAGE)进行验证分析。
实施例3：
HBV RNA的合成与纯化
1、首先利用设计好的RPA引物对通过RPA试剂盒对含有HBV DNA的质粒进行扩增。扩增后的产物再使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃孵育过夜进行体外转录。
2、体外转录反应完成后，向系统中加入适量的无RNase的DNase I(总共4个单位)，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板。
3、得到的HBV体外转录产物通过MEGAclear转录纯化试剂盒进行纯化，然后使用Nanodrop进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素/PAGE) 进行验证分析。
实施例4：
使用Cas13a酶和能够同时识别HBV B型和C型病毒的HBV crRNA进行检测平台的灵敏度测试
在不与RPA扩增结合的条件下进行灵敏度测试。此检测体系中包含45nM Cas13a酶，22.5nM HBV crRNA，250nM荧光报告分子，1U/μL小鼠RNA酶抑制剂，以及不同量的靶标HBV RNA和1x测试缓冲液(含有40mM Tris-HCl,60mM NaCl,以及6 mM MgCl2,pH 7.5)。单次反应的总体积为20μL，在酶标仪中反应2小时，反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次体系内荧光信号。HBV crRNA的完整crRNA序列如 SEQ ID NO:3所示，HBV crRNA的完整crRNA序列的特异性识别区域序列如SEQ ID NO:4所示，HBV crRNA的序列设计如图2所示，灵敏度测试结果如附图3和图4所示，其中**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001.n.s.,不显著。
实施例5：
使用Cas13a酶和B基因型特异性的crRNA对含有HBV B型或C型基因组DNA 的质粒进行酶切荧光测试，此过程将CRISPR-Cas13a技术与RPA扩增相结合
1)预先在离心管中加入HBV的RPA前向引物和反向引物各0.48μM，1x RPA缓冲液，1UμL-1小鼠RNA酶抑制剂，四种rNTP各2mM，1μL T7聚合酶，45nM Cas13a酶，250nM荧光报告分子(5’FAM-UUUUU-3’BHQ1)，5mM氯化镁，以及14mM 醋酸镁。荧光报告分子为只含5个碱基的短链RNA，其一端修饰了荧光基团FAM，另一端修饰了荧光淬灭基团BHQ1。当此报告分子处于完整状态时，由于荧光共振能量转移(FRET)作用，荧光信号被淬灭，体系不会发荧光。一旦Cas13a酶在crRNA 的指引下被靶标序列激活其RNA酶活性，即可切断此短链RNA，从而荧光基团与淬灭基团距离变远，荧光淬灭机制失效，体系发荧光。
2)向上述离心管中按照需要加入不同的crRNA(终浓度为22.5nM)和待测的适量HBV DNA，在酶标仪中反应2小时，反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次体系内荧光信号。
其中，两种不同的HBV B型特异的crRNA1和crRNA2的序列设计如图6所示， crRNA1完整的crRNA序列如SEQ ID NO:5所示，crRNA1完整的crRNA序列的特异性识别区域序列如SEQ ID NO:6所示，crRNA2完整的crRNA序列如SEQ ID NO:7所示，crRNA2完整的crRNA序列的特异性识别区域序列如SEQ ID NO:8所示，crRNA1 和crRNA2分别B型(靶标)与C型(非靶标)HBV DNA识别时的碱基互补配对模型图如图7所示，hs-crRNA1完整的crRNA序列如SEQID NO:9所示，hs-crRNA1完整的crRNA序列的特异性识别区域序列如SEQ ID NO:10所示，hs-crRNA2完整的crRNA序列如SEQ ID NO:11所示，hs-crRNA2完整的crRNA序列的特异性识别区域序列如SEQ ID NO:12所示，在crRNA的特异性识别区域引入了额外的发卡结构的hs-crRNA1的序列设计如图10所示，在crRNA的特异性识别区域引入了额外的发卡结构的hs-crRNA2的序列设计如图11所示，实施例5的检测结果如附图5、附图8、图9、图12-图15所示，其中**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001.n.s.,不显著。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序 列 表
<110> 上海交通大学
<120> 一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法
<130> 2020
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
aattctaata cgactcacta tagggactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggg 57
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
ccaacaagaa gatgaggcat agcagcagga tg 32
<210> 3
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacauaa aacgccgcag acacauccag 60
cgau 64
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
auaaaacgcc gcagacacau ccagcgau 28
<210> 5
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccagg uuggugagug acuggagauu 60
uggg 64
<210> 6
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
cagguuggug agugacugga gauuuggg 28
<210> 7
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaaga agauaaaacg ccgcagacac 60
aucc 64
<210> 8
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
aagaagauaa aacgccgcag acacaucc 28
<210> 9
<211> 78
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuaac gaggacaaau uggaggacaa 60
caggaacacc uguugucc 78
<210> 10
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
uaacgaggac aaauuggagg acaacagg 28
<210> 11
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuaac gaggacaaau uggaggacaa 60
caggccucgu ua 72
<210> 12
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
uaacgaggac aaauuggagg acaacagg 28
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
ccctatagtg agtcgtatta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
taatacgact cactataggg 20

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，在按下述方法涉及得到的通用型重组聚合酶扩增引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的乙型肝炎病毒进行酶切荧光测试，实现乙型肝炎病毒基因分型检测，通用型重组聚合酶扩增引物又称为RPA引物；
所述RPA引物的设计方法包括以下步骤：
1)设计成簇的规则间隔短回文重复序列RNA，所述设计成簇的规则间隔短回文重复序列RNA又称为crRNA，所述crRNA序列并通过体外转录合成；
2)使用NCBIPrimer Blast在线工具设计乙型肝炎病毒基因组DNA的RPA引物。
2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤1)的具体步骤包括：
A1、首先合成与crRNA互补的DNA序列作为体外转录的模板，在DNA序列的3’末端应延伸一段T7启动子的互补序列，如SEQ ID NO:13所示，为后续的T7体外转录做准备；
A2、然后将DNA模板和一段短的T7启动子序列，T7启动子序列如SEQ ID NO:14所示，在1x退火缓冲液中进行退火反应，首先在95℃孵育10分钟，然后使其缓慢冷却至室温；
A3、退火反应结束后，使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃过夜孵育进行crRNA的体外转录，转录反应包含NTP缓冲液混合物、T7 RNA聚合酶混合物、模板DNA、小鼠RNase抑制剂；
A4、体外转录反应完成后，向系统中加入无RNase的DNaseI，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板，最后用2倍体积的RNAXP清洁磁珠对转录后的crRNA进行纯化，并在-20℃保存，所得的crRNA使用Nanodrop进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证分析。
3.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤A2的退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl，Tris-HCl的pH 7.5,10mMEDTA,1M NaCl。
4.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤A3转录反应中含模板DNA 2μg。
5.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤A3转录反应中小鼠RNase抑制剂含量为1U/μL。
6.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤A3中每个NTP终浓度为10mM。
7.如权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤A4中无RNase的DNaseI添加量为总共4个单位。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
B1、设计crRNA序列并通过体外转录合成；
B2、使用NCBIPrimer Blast在线工具设计HBV基因组DNA的通用型重组聚合酶扩增(RPA)引物；
B3、合成与纯化乙型肝炎病毒RNA；
B4、使用Cas13a酶和能够同时识别乙型肝炎病毒B型和C型病毒的HBV crRNA进行检测方法的灵敏度测试；
B5、使用Cas13a酶和B基因特异性的crRNA对含有乙型肝炎病毒B型或C型基因组DNA的质粒进行酶切荧光测试。
9.如权利要求8所述的基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤B3的步骤为：
C1、首先利用设计好的RPA引物对通过RPA试剂盒对含有乙型肝炎病毒DNA的质粒进行扩增；
C2、扩增后的产物再使用HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃孵育过夜进行体外转录；
C3、体外转录反应完成后，向系统中加入适量的无RNase的DNase I(总共4个单位)，37℃孵育15分钟，以消化DNA模板；
C4、得到的HBV体外转录产物通过MEGAclear转录纯化试剂盒进行纯化，然后使用Nanodrop进行浓度测量，并通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证分析。
10.如权利要求8所述的基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法，其特征在于，步骤B5对基因组DNA的质粒进行酶切荧光测试的步骤为：
D1、预先在离心管中加入乙型肝炎病毒的RPA前向引物和反向引物各0.48μM，1x RPA缓冲液，1UμL-1小鼠RNA酶抑制剂，四种rNTP各2mM，1μL T7聚合酶，45nM Cas13a酶，250nM荧光报告分子，5mM氯化镁，以及14mM醋酸镁，荧光报告分子为只含5个碱基的短链RNA，其一端修饰了荧光基团FAM，另一端修饰了荧光淬灭基团BHQ1，当此报告分子处于完整状态时，由于荧光共振能量转移作用，荧光信号被淬灭，体系不会发荧光；一旦Cas13a酶在crRNA的指引下被靶标序列激活其RNA酶活性，即可切断此短链RNA，从而荧光基团与淬灭基团距离变远，荧光淬灭机制失效，体系发荧光。
D2、向离心管中按照需要加入不同的和待测的适量HBV DNA，在酶标仪中反应2小时，反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次体系内荧光信号，
其中，荧光报告分子为5’FAM-UUUUU-3’BHQ1，步骤D2中crRNA的终浓度为22.5nM。
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