KR20220076345A - 6종의 두족류 판별을 위한 종 특이적 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

6종의 두족류 판별을 위한 종 특이적 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어 판별용 프라이머 세트에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라미어 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였을 때 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 각 종을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인한 바, 이를 수산 산업에 있어서 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어를 판별하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

6종의 두족류 판별을 위한 종 특이적 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도{Species-specific multiplex primer sets for identification of six species of Cephalopoda, and uses thereof}
본 발명은 낙지(Octopus minor), 주꾸미(Octopus ocellatus), 문어(Enteroctopus dofleini), 훔볼트오징어(Dosidicus gigas), 참문어(Octopus vulgaris) 및 살오징어(Todarodes pacificus) 등 6종의 두족류(Cephalopoda)를 정확하고 신속하게 식별할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
두족류는 두족강(Cephalopoda)에 속하는 연체동물을 뜻하며, 좌우대칭형으로 머리 위에 몸통이 붙어 있고, 머리 아래에 다리가 존재하는 특징을 가진다. 국내에서 자주 소비되는 두족류 종은 살오징어(Todarodes pacificus), 낙지 (Octopus minor), 주꾸미(Octopus ocellatus), 훔볼트오징어(Dosidicus gigas), 참문어(Octopus vulgaris), 문어(Enteroctopus dofleini)가 있으며, 현재 각 종의 생산량이 국내 소비량보다 적기 때문에 수입에 의존하고 있다. 수입되는 경우, 원형 그대로 들어올 수도 있으나 주로 가공된 형태로 들어온다
상기 6종의 두족류가 가공되지 않은 경우에는 형태학적 특성을 이용하여 각 종을 쉽게 식별할 수 있으나, 1차 가공식품으로써 절단된 경우, 또는 젓갈과 같이 염장되어 2차 가공 처리된 경우에는 형태학적 특성으로는 각 종을 판별하기 어렵다. 특히 최근에는 원가절감을 이유로 문어 대신 속칭 가문어로 불리는 훔볼트오징어를 사용하는 등 원산지와 종 표시를 속이는 사례가 발생하고 있는 바, 형태에 관계없이 상기 6종의 두족류를 정확히 식별할 수 있는 기술이 요구된다.
2012년 식품의약품안전처는 식품 중 사용원료 판별 지침서(Ⅱ)에 두족류를 포함한 수산물 74종에 대한 PCR 판별법을 수록하였다. 하지만 이는 단일 PCR에 대한 조건으로 다중 증폭 반응에 적용할 수 없는 기술이다. 이에 있어 낙지, 문어, 주꾸미, 참문어, 훔볼트오징어 및 살오징어를 식별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응용 프라이머가 개발된 바 있다(Kim et al. (2015). J. FD Hyg. Safety 30: 43-50 참고).
하지만 한번의 증폭 반응으로 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어, 각 종을 판별할 수 있는 기술에 대해서는 개발된 바 없다.
본 발명자들은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어에 대하여 각 개체를 정확하게 판별할 수 있는 기술에 대하여 연구하던 중, 각 종에 대한 종 특이적 프라이머를 제작하고, 이를 이용한 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR)을 수행하였을때 각 종에 대한 특이 크기의 밴드가 생성되어 각 종을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료내 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 멀티플렉스 PCR에 적용할 수 있는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 프라이머 세트에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라미어 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였을 때 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어를 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인하였다. 따라서 가공시 형태적으로 식별이 어려운 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어 샘플으로부터 각 개체를 판별할 수 있는 바, 이를 수산 산업에 있어서 상기 6종을 판별하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 낙지, 주꾸미, 문어, 훔볼트오징어, 참문어 및 살오징어 DNA 샘플에 대하여, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과이다(마커(M): 100bp DNA ladder, 1: 낙지, 2: 주꾸미, 3: 문어, 4: 훔볼트오징어, 5: 참문어, 6: 살오징어, 7: 대조군: 3차 증류수).
도 2는 낙지, 주꾸미, 문어, 훔볼트오징어, 참문어 및 살오징어 DNA 샘플에 대하여, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 민감도를 확인한 결과이다(M: 100 bp DNA ladder, line 1: 50 ng/μl, line 2: 10 ng/μl, line 3: 1 μg/l, line 4: 0.1 μg/ul, line 5: 0.01 ng/μl).
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행할 때 최적의 결합 온도 조건을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어의 미토콘드리아(mitochondrial) 사이토크롬 산화효소 서브유닛 1(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ) 유전자를 타겟으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 "미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 서브유닛 1 유전자"는 미토콘드리아에 존재하는 유전자로 생물종마다 다른 핵산서열을 나타낸다. 이하 COⅠ로 기재한다.
본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 상기 서열번호 1 내지 7에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 7의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 참문어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 문어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 주꾸미의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 낙지의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 훔볼트오징어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 살오징어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머의 길이는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하는 온도와 밀접한 관계를 가지는데 일반적으로 길이가 길어질수록 온도는 높아지게 된다. 사용 목적에 따라 달라질 수는 있으나 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면, 1 회의 검사만으로 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어 중에서 gDNA의 유래를 신속하고 정확하게 식별해 낼 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조할 수 있다. 더불어 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 이에 시약 및 도구로서 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 더불어 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 키트는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR, 멀티플렉스 PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR, 복구연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR, 멀티플렉스 PCR) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 또는 본 발명에 따른 판별용 키트를 이용한, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 시료내 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하거나 단지 배양액을 증류수에 희석시켜 끓이는 방법으로도 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 본 발명에 따른 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction, nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction, single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction, multiplex RT-PCR), 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction, RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction, RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 들 수 있다. 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR, 멀티플렉스 PCR)의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "다중 중합효소연쇄반응 PCR(Multiplex PCR)"은 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법이다. 일반적으로 Multiplex PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 한 번의 증폭으로 여러 개의 산물을 동시에 생성할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 이를 하나의 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 정확하게 생성되는 특징이 있다.
더불어 상기 판별 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트의 농도는 2.5 내지 15 pmol/μl일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 pmol/μl일 수 있다.
또한 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
또한 본 발명의 PCR 조건에 있어서, 증폭 반응은 92 내지 97℃ 에서 10초 내지 1분간 변성(denaturation), 45 내지 60℃에서 20초 내지 1분간 결합(annealing), 65 내지 75℃에서 20초 내지 1분간 신장(extension) 과정을 총 30회 내지 40회 반복한 후 65 내지 75℃에서 3분 내지 10분간 최종 신장 과정을 수행하는 것을 특징으로 한다.
보다 바람직하게는 상기 증폭 반응은 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 54℃에서 30초 결합(annealing), 72℃에서 30초 신장(extension) 과정을 총 34회 반복한 후 72℃에서 7분간 최종 신장 과정을 수행할 수 있다.
상기 증폭 반응에서 온도 및 시간 조건은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행할 때 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의한 타당한 수치로 변경될 수 있다.
상기 "증폭"은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어 샘플로부터 추출된 DNA 내에 혼합된 COⅠ 유전자의 DNA를 주형(Template)으로 하여, 상기 주형 내의 특정 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 반복하여 시험관 내에서 해당 DNA 부위를 대량 합성하도록 반응시킨 후, 전기영동에서 뚜렷한 밴드로 가시화하여 판별하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 "검출"은 증폭된 표적 서열에 검출가능한 표지 물질로 표지함으로써, 수행될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 검출에 사용될 수 있는 상기 표지 물질은 Cy5 또는 Cy3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지시킬 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭시, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 참문어의 COⅠ 유전자에 대하여 459bp 크기의 산물을 증폭하고, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 문어의 COⅠ 유전자에 대하여 360bp 크기의 산물을 증폭하였다. 또한, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 주꾸미의 COⅠ 유전자에 대하여 248bp 크기의 산물을 증폭하였다. 더불어 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 낙지의 COⅠ 유전자에 대하여 194bp 크기의 산물을 증폭하였다. 또한 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 훔볼트오징어의 COⅠ 유전자에 대하여 141bp 크기의 산물을 증폭하였다. 더불어 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 살오징어의 COⅠ 유전자에 대하여 82bp 크기의 산물을 증폭하였다.
따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어를 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인하였다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 종 특이적 프라이머 제작
낙지(Octopus minor), 주꾸미(Octopus ocellatus), 문어(Enteroctopus dofleini), 훔볼트오징어(Dosidicus gigas), 참문어(Octopus vulgaris) 및 살오징어(Todarodes pacificus) 등 6종의 두족류(Cephalopoda)을 대상으로 멀티플렉스용 프라이머를 제작하였다.
6종 간 판별 가능한 특이 프라이머를 제작하기 위해 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 서브유니트 1(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COⅠ) 유전자를 대상으로 하였다. 상기 6종의 NCBI GenBank(Dosidicus gigas NC_009734, Octopus minor NC_015896, Octopus ocellatus NC_007896, Octopus vulgaris NC_006353, Todarodes pacificus NC_006354, Enteroctopus dofleini NC_056385)에 등록된 유전자 서열을 바탕으로 Bioedit 프로그램을 이용하여 다중서열 정렬 수행 후 하기 표 1의 종 특이 프라이머를 제작하였다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 방향 증폭 산물 크기
(bp) 		서열
번호
참문어(O. vulgaris_F) CACTTAGCAGGTATTTCATCAATCC 정방향 459 1
문어(E. dofleini_F) CCACTATTTGTATGATCTGTTC 정방향 365 2
주꾸미(O. ocellatus_F) TGACCCAAGAGGAGGAGGT 정방향 248 3
낙지(O. minor_F) GGTCATCCCGAAGTTTACATTCTT 정방향 194 4
훔볼트오징어(D. gigas_F) TATTGTTTCTCACCACTCTTTC 정방향 141 5
살오징어(T. pacificus_F) CCATACTATCAATTGGTCTCC 정방향 82 6
Octopodidae_R GCWCGWGTRTCWACATCYAT 역방향 - 7
상기 표 1에 있어서, 참문어의 특이적인 프라이머, O. vulgaris_F(서열번호 1) 및 Octopodidae_R(서열번호 7)는 COⅠ 유전자의 441-466 bp 부위 및 879-899 bp 부위의 염기서열을 기반으로 제작하였다. 더불어 문어의 특이적인 프라이머, E. dofleini_F(서열번호 2)는 534-556 bp 부위 염기서열을 기반으로 제작하였고, 주꾸미의 특이적인 프라이머, O. ocellatus_F(서열번호 3)는 651-669 bp 부위의 염기서열을 기반으로 제작하였다. 또한 낙지의 특이적인 프라이머, O. minor_F(서열번호 4)는 705-729 bp 부위의 염기서열을 기반으로 제작하였으며, 훔볼트오징어의 특이적인 프라이머, D. gigas_F(서열번호 5)는 758-780 bp 부위의 염기서열을 기반으로 제작하였고, 살오징어의 특이적인 프라이머 T. pacificus_F(서열번호 6)은 817-837 bp 부위의 염기서열을 기반으로 제작하였다.
실시예 2. 제작 프라이머의 종 특이적 판별 여부 평가
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트가 실제 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어를 판별할 수 있는지 멀티플렉스 PCR을 수행하여 확인하였다. 20 ㎕의 PCR 프리믹스 키트(AccuPower Multiplex PCR premix Kit (Bioneer, Korea))에 각 종의 게놈 DNA(Genomic DNA) 50 ng 1 ㎕ 및 1 ㎕의 상기 실시예 1의 서열번호 1 내지 서열번호 7의 프라이머(10 pmole 농도)를 넣어주었다. 이를 이용해 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 54℃에서 30초간 결합(annealing), 72℃에서 30초간 신장(extension) 과정을 한 싸이클(cycle)의 주기로 34회 반복한 후, 72℃에서 7분간 최종 신장반응시켜 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 최종적으로 증폭된 산물을 GelRed (Invitroogen, USA)로 염색된 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)을 이용해 전기영동하여 종 특이적 판별 여부를 확인하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머로 PCR 반응 수행시, 참문어에 대하여 459 bp, 문어에 대하여 365 bp, 주꾸미에 대하여 248 bp, 낙지에 대하여 194 bp, 훔볼트오징어에 대하여 141 bp, 살오징어에 대하여 82 bp의 증폭산물이 형성됨을 확인하였다.
실시예 3. 검출 민감성 평가
본 발명에 따른 프라이머 세트의 각 종에 대한 검출 민감성을 확인하였다. 이를 위하여 농도별(0.1ng, 1ng, 10ng, 50ng) 각 종의 시료를 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 PCR을 실시한 후, 전기영동을 통해 PCR 산물의 특이적인 밴드 형성 및 크기를 확인하였다.
그 결과 도 2와 같이, 낙지, 주꾸미, 참문어, 문어, 훔볼트오징어는 0.1ng의 농도에도 검출됨을 확인하였다. 한편, 살오징어의 경우 10ng 이상의 농도에서 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 최적의 결합 온도 조건 확인
본 발명에 따른 프라이머 세트의 최적의 결합 온도 조건을 확인하였다. 이를 위하여 50 내지 61℃의 다양한 결합 온도 범위에서 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 PCR을 실시한 후, 전기영동을 통해 PCR 산물의 특이적인 밴드 형성 및 크기를 확인하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 51℃ 내지 54℃의 결합 온도 조건에서, 각 종에 대하여 종전 확인한 크기의 PCR 산물이 단일 밴드로 형성됨을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어의 미토콘드리아 DNA의 COⅠ 유전자를 이용하여 개발한 프라이머 세트에 대한 것으로, 상기 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR을 통해 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 각 종을 정확하고 신속하게 판별할 수 있음을 확인한 바, 이를 수산 산업에 있어서 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 또는 살오징어를 판별하는데 유용하게 사용할 수 있다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Species-specific multiplex primer sets for identification of six species of Cephalopoda, and uses thereof <130> 1-13P-1 <150> KR 10-2020-0164081 <151> 2020-11-30 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O. vulgaris_F <400> 1 cacttagcag gtatttcatc aatcc 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. dofleini_F <400> 2 ccactatttg tatgatctgt tc 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O. ocellatus_F <400> 3 tgacccaaga ggaggaggt 19 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O. minor_F <400> 4 ggtcatcccg aagtttacat tctt 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D. gigas_F <400> 5 tattgtttct caccactctt tc 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T. pacificus_F <400> 6 ccatactatc aattggtctc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Octopodidae_R <400> 7 gcwcgwgtrt cwacatcyat 20

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및
    서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 참문어의 미토콘드리아(mitochondrial) 사이토크롬 산화효소 서브유닛 1(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COⅠ) 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 문어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 주꾸미의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 낙지의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 훔볼트오징어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머는 살오징어의 COⅠ 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별용 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별용 키트.
  10. 시료내 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 참문어, 문어, 주꾸미, 낙지, 훔볼트오징어 및 살오징어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 판별 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 증폭 반응은 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
KR1020210164114A 2020-11-30 2021-11-25 6종의 두족류 판별을 위한 종 특이적 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 KR20220076345A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220078362A (ko) * 2020-12-03 2022-06-10 주식회사 바이오티엔에스 두족류(Cephalopod) 검출용 조성물

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