KR101798478B1 - 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스 균주의 신속한 검출방법 및 검출 키트 - Google Patents

아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스 균주의 신속한 검출방법 및 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Real-Time PCR 기법을 이용한 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 신속한 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 이용한 Real-Time PCR 기법에 관한 것이다.
이는 Real-Time PCR를 이용하여, 곰팡이 균주인 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인할 수 있다.

Description

아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스 균주의 신속한 검출방법 및 검출 키트{Method for detecting rapidly Aspergillus flavus strain producing aflatoxin and detection kit}
본 발명은 Real-Time PCR 기법을 이용한 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 신속한 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 이용한 Real-Time PCR 기법에 관한 것이다. 이는 Real-Time PCR를 이용하여, 곰팡이 균주인 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인할 수 있다.
아플라톡신은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 곰팡이(mold)가 생산하는 산물로 사람에게서 생리적인 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 아플라톡신 이성체 중 아플라톡신 B1의 경우 강력한 발암물질이다. 이러한 아플라톡신의 최조 발견은 1960년 영국에서 칠면조의 집단 폐사의 원인으로 처음 알려졌으며, 다양한 농산물에 오염될 수 있어 신속하고 정확한 검사법을 통하여 확인이 이루어져야 한다.
현재까지 아플라톡신 검사법은 배양을 통한 방법과 LC/MS, 면역학적 분석법 등이 개발되어 적용되어 왔다. 배양의 경우 특이도가 높지만 배양을 통하여 결과를 확인하기 까지 많은 시간이 필요하고 정확한 종 동정과 아플라톡신의 존재 유무는 추가적인 분석을 통해야 하는 단점이 있다. LC/MS를 이용한 분석의 경우 매우 적은 양의 독소의 검출은 어렵고, 면역학적 분석법은 빠른 검사시간, 낮은 검사비용 등의 장점은 있지만 분자진단 검사법과 비교하였을 때 상대적은 낮은 민감도를 보인다.
그러나, 분자진단 검사법의 경우 아플라톡신을 생성하는 곰팡이의 독소의 존재 유무와 종을 동시에 확인이 가능하고 낮은 수의 곰팡이를 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한 Real-Time PCR의 경우 정량적으로 확인이 가능하여 오염의 정도를 확인할 수 있는 장점이 있다.
한국 등록특허 제10-1562491호, 제10-1498768호는 Real-time PCR을 이용한 특정 균주의 검출방법에 관한 것으로, Real-time PCR(Polymerase chain reaction) 은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링 하여 target DNA의 양을 분석하는 장비이다. Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기 영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다. 실제로, 유전자 발현, gene copy assay, genotyping, 등에서 시료에 있는 target gene에 대한 정확한 양 측정에 이용되는 중요한 tool이라 할 수 있다.
이에 Real-time PCR을 이용하여 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인할 수는 방법을 제시하고자 한다.
한국 등록특허 제10-1562491호 한국 등록특허 제10-1498768호
이에 본 발명자들은 새로운 프라이머 세트를 제작하고, 이를 바탕으로 특이적인 프로브를 디자인하여 Real-time PCR을 수행한 결과, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인하여 본 발명은 완성하였다.
따라서, 본 발명은 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 신속한 검출방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 검출 키트를 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA, 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및 (c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 신속한 검출방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하는 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스 균주의 검출키트를 제공한다.
본 발명은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 동시에 신속하게 확인할 수 있어, 식품에 아플라톡신 생성 유무와 아스퍼질러스 플라부스 균주 존재 유무를 확인하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 아플라톡신 및 아스퍼질러스 플라부스 균주의 프라이머 세트의 합성에서 이용된 NCBI 데이터베이스의 access number FN398171.1(ketoreductase nor-1), L25836(O-Methyltransferase omt-1), KM284800(5.8S ribosomal RNA, internal transcribed spacer 2)의 유전자 정보이다.
도 2는 nor-1 유전자에 대한 Real-time PCR 시험결과이다.
도 3은 omt-1 유전자에 대한 Real-time PCR 시험결과이다.
도 4는 ITS2 유전자에 대한 Real-time PCR 시험결과이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현 예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 신속한 검출을 위해, (a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA, 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및 (c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 포함하는 프라이머는 각각 서열 상동성이 95% 이상인 염기서열을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 프라이머가 20bp인 경우, 20bp 중 2개 이상 틀리면 용융 온도(melting temperature)의 감소가 5도 이상이 되므로 결과가 좋지 않게 나타나지만, 1개만 틀릴 경우에는 PCR 과정에서 열처리(annealing) 온도를 약간 내려 실험 할 경우 동등한 결과를 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전 되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 “프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지될 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 5'-말단에 표지되는 형광발색체는 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 3'-말단에 표지되는 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군에서 선택된다.
프로브의 5'-말단 및 3'-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것 일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'-말단의 형광물질 에너지에 의해 5'-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5'-말단의 형광물질이 유리되면서 3'-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.
본 발명에서의 서열번호 1 및 2는 도 1에 나타낸 아플라톡신 생성 유전자인 케토 리덕타아제(ketoreductase) nor-1의 염기 서열(access number: FN398171.1)을 포함한다.
본 발명에서의 서열번호 3 및 4는 아플라톡신 생성 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제(O-Methyltransferase) omt-1의 염기 서열을 포함한다.
본 발명에서의 서열번호 5 및 6은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2)의 염기 서열을 포함한다.
본 발명에서의 서열번호 7은 아플라특신 생성 관련 유전자인 nor-1 염기 서열에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8은 아플라특신 생성 관련 유전자인 omt-1 염기 서열에 특이적으로 결합하며, 서열번호 9는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2) 서열에 특이적으로 결합하는 프로브이다.
또한 본 발명 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하는 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 균주의 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 서열번호 7 내지 9의 프로브 이외에 PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 조성물의 성분의 비제한적인 예로는 반응용 완충용액, dNTPs, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTPs는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 키트에는 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출방법 및 검출키트는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 존재와 함께 아플라톡신 생성 유무를 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 검출할 수 있다.
이하, 실시예, 실험예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브의 제작
아플라톡신 정량을 위한 프라이머 세트의 합성에는 염기서열 분석을 통해 NCBI 데이터 베이스에 등록번호(access number) FN398171.1로 등록되어 있는 aflatoxin biosynthesis ketoreductase nor-1 유전자와, 등록번호(access number) L25836로 등록되어 있는 aflatoxin biosynthesis O-methyltransferase omt-1 유전자 정보를 선정하였다. 아울러, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 종 동정 유전자 마커를 위해서는 등록번호(access number) KM284800로 등록되어 있는 ribosomal RNA, internal transcribed spacer 2 유전자 정보를 선정하였다(도 1 참조).
도 1의 유전자의 합성과 하기 표 1 및 2의 프라이머와 프로브의 제작은 파이오니아사(pioneer, 한국)의 올리고 합성 서비스를 이용하여 합성하였고, 형광프로브의 경우 FAM과 BHQ1으로 수식하여 최종 농도가 100uM이 되도록 멸균증류수를 첨가하여 준비하였으며, 증폭 실험 전까지 냉장보관하였다.
이때 프라이머와 프로브 서열의 Tm 값 분석은 IDT사에서 제공하는 web-based 프로그램인 oligoanalyzer 3.1을 이용하였다.
프라이머
서열번호 염기서열(5’-> 3‘) 명칭 길이 GC% Tm 증폭산물
1 CAAGCAACAGGCCAAGT nor-1 forward primer 17 52.9 53.3 61
2 GTGCATGTTGGTGATGGT nor-1 reverse primer 18 50 532
3 CCTGAGGGGAGCACCGT omt-1 forward primer 17 70.6 60 62
4 GAAACCCGTCGGCTGAGAT omt-1 reverse primer 19 57.9 57.4
5 GTCCGAGCGTCATTGCT ITS2 forward primer 17 58.8 55.4 241
6 TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGT ITS2 reverse primer 26 38.5 55.9
프로브
서열번호 5’ 수식 염기서열(5’-> 3‘) 3‘ 수식 길이 GC% Tm 증폭산물 비고
(특이성)
7 FAM TCTTGATCGGCGCCCGATC BHQ1 19 63.2 60.1 61 nor-1
probe
8 FAM CGGCGGCGGTCGTGGT BHQ1 16 81.2 65.1 62 omt-1
probe
9 FAM CGCTTGCCGAACGCAAATCAATC BHQ1 23 52.2 59.8 241 ITS2
probe
실시예 2: 프라이머 및 프로브의 특이도 확인
(1) 미생물로부터 유전체 DNA 추출
아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 종 동정과 아플라톡신 생성 유전자인 nor-1, omt-1 유전자 증폭실험을 위해 하기 표 2에 표기된 곰팡이를 생물자원센터로부터 분양받았다.
분양받은 미생물의 경우, 동결건조상태의 앰플을 멸균증류수 3 ml에 부유시킨 후 이중 100ul를 분주하여 준비하고, 바이오라드에서 구매한 chelex resin을 5%(w/v) 농도로 멸균증류수에 첨가한 후 이를 1ml 준비하여 미생물 부유액과 혼합하여 95도 온도에서 30분간 반응시켰다. 원심분리기를 이용하여 resin과 미생물 부유물를 분리하고 상층액을 별도의 튜브에 분주하여 실험 전까지 냉장보관 하였다.
특이도 실험을 위한 균주
순 번 KTCT 번호 균주명
1 7214 Candida parapsilosis
2 17427 Candida dubliniensis
3 7212 Candida tropicalis
4 7219 Candida glabrata
5 6971 Aspergillus niger
6 26426 Aspergillus fumigatus
7 6006 Aspergillus candidus
8 6984 Aspergillus flavus
9 6143 Aspergillus flavus var. flavus
10 16682 Aspergillus flavus
(2) Real - Time PCR 수행( 프라이머 및 프로브의 성능평가)
상기 실시예 1에서 준비한 표 1 및 2의 프라이머 및 프로브와 실시예 2에서 준비한 분양받은 미생물의 유전체 DNA를 이용하여, 하기 표 4의 반응 조성액을 조제하여 사용하였다. 2X Real-time PCR Master Mix는 제이에스바이오테크사의 제품을 사용하였다. 분석기기는 파이오니아사(pioneer, 한국)의 Exicycler 96 real-time PCR 장비를 이용하여 진행하였다. 준비된 반응 조성액은 하기 표 5의 온도 조건으로 37번 반복하여 실험을 진행하였으며, 음/양성 판정은 Ct 값 기준으로 확인하였다.
Real-Time PCR 실험을 위한 반응 조성액
구 성 물 첨 가 량
2X Real-time PCR Master Mix 10 ul
Forward Primer(100uM) 0.1 ul
Revers Primer(100uM) 0.1 ul
Probe (100uM) 0.05 ul
Template DNA 2 ul
Nucelase Free Water 7.75 ul
Total Volume 20 ul
Denaturation 95 ℃, 5 min
37 cycles
Denaturation 95 ℃, 10 sec
Annealing & Extension
(Data collection)		 55 ℃, 45 sec
이에 대한 결과는 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2는 nor-1 유전자에 대한 실험 결과로서 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주인 KCTC 6984, 6143, 16682의 양성을 보였으나, KCTC 7214, 17427, 7212, 7219, 6971, 26426, 6006는 음성으로 확인되었다(그래프의 가장 위의 곡선이 KCTC 6984이며, 중간 곡선은 KCTC 6143, 아래 곡선은 KCTC 16682를 의미한다).
도 3은 omt-1 유전자에 대한 실험 결과로서 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주인 KCTC 6984, 6143, 16682의 양성을 보였으나, KCTC 7214, 17427, 7212, 7219, 6971, 26426, 6006는 음성으로 확인되었다(그래프의 가장 위의 곡선이 KCTC 6984이며, 중간 곡선은 KCTC 6143, 아래 곡선은 KCTC 16682를 의미한다).
도 4는 ITS2 유전자에 대한 실험 결과로서, 도 2 및 도 3과 같이 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주인 KCTC 6984, 6143, 16682의 양성을 보였으나, KCTC 7214, 17427, 7212, 7219, 6971, 26426, 6006는 음성으로 확인되었다(그래프의 가장 위의 곡선이 KCTC 6984이며, 중간 곡선은 KCTC 6143, 아래 곡선은 KCTC 16682를 의미한다).
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Claims (8)

  1. (a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 유전체 DNA, 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및
    (c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하되,
    상기 서열번호 1 및 2는 아플라톡신 생성 유전자인 케토 리덕타아제(ketoreductase) nor-1의 염기 서열을 포함하며,
    상기 서열번호 3 및 4는 아플라톡신 생성 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제(O-Methyltransferase) omt-1의 염기 서열을 포함하고,
    상기 서열번호 5 및 6은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2)의 염기 서열을 포함하며,
    상기 서열번호 7은 아플라톡신 생성 관련 유전자인 nor-1 염기 서열에 특이적으로 결합하고,
    상기 서열번호 8은 아플라톡신 생성 관련 유전자인 omt-1 염기 서열에 특이적으로 결합하며,
    상기 서열번호 9은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2) 서열에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 형광발색제는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 방법.
  7. 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트 및 서열번호 7 내지 9의 프로브를 포함하되,
    상기 서열번호 1 및 2는 아플라톡신 생성 유전자인 케토 리덕타아제(ketoreductase) nor-1의 염기 서열을 포함하며,
    상기 서열번호 3 및 4는 아플라톡신 생성 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제(O-Methyltransferase) omt-1의 염기 서열을 포함하고,
    상기 서열번호 5 및 6은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2)의 염기 서열을 포함하며,
    상기 서열번호 7은 아플라톡신 생성 관련 유전자인 nor-1 염기 서열에 특이적으로 결합하고,
    상기 서열번호 8은 아플라톡신 생성 관련 유전자인 omt-1 염기 서열에 특이적으로 결합하며,
    상기 서열번호 9은 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주의 ITS2(internal transcribed spacer 2) 서열에 특이적으로 결합하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 검출 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 반응용 완충용액, dNTPs, Mg2+이온, 및 DNA 중합효소를 포함하는 아스퍼질러스 플라부스 균주의 존재 및 아플라톡신 생성 유무를 동시에 확인 및 신속 검출을 위한 검출 키트.
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