KR101282924B1

KR101282924B1 - 살모넬라의 동시 검출을 위한 ｐｃｒ 프라이머

Info

Publication number: KR101282924B1
Application number: KR1020110118733A
Authority: KR
Inventors: 장형관; 박인재; 차세연; 강민; 장상호
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2013-07-05
Also published as: KR20130055040A

Abstract

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 4종의 살모넬라를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 한번의 PCR을 통해, 특정 시료로부터 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 4종의 살모넬라를 확인할 수 있어, 신속하고 정확한 진단이 가능하다.

Description

살모넬라의 동시 검출을 위한 ＰＣＲ 프라이머 {PCR primer for detecting Salmonella}

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 4종의 살모넬라를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)와 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium)은 소, 돼지, 닭 등 가축들에서 설사를 주 증상으로 하며, 심한 경우에는 탈수로 인한 폐사를 일으키고, 사람에게서 식중독을 유발하는 세균으로 공중보건상에서 매우 중요한 세균이다. 또한, 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)과 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)은 운동성이 없는 세균으로 닭에 특이적으로 감염하여 각각 가금티푸스와 추백리를 유발한다.

많은 연구자들은 가축에서 설사를 일으키는 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움과 닭에 특이적으로 감염하는 살모넬라 갈리나룸, 풀로룸의 특성을 밝히기 위하여 살모넬라가 갖고 있는 O, H 항원을 이용하여 분류를 시도하였다. 이 방법은 동물 및 사람에서 질병을 일으키는 살모넬라를 분리하고 혈청형을 조사한 분류 방법이었다. 그러나 기존의 혈청형 분류방법은 시험시간이 많이 소요되며, 항혈청을 필히 보유해야 해 번거로운 단점을 가지고 있다.

최근 분자생물학적 기법의 발달로, 게놈 DNA 중의 특정부위의 유전자만을 증폭시키는 것이 가능해졌으며, 증폭된 유전자 산물을 전기영동을 통하여 확인함으로써 특정 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 프라이머(primer)라 불리우는 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편을 이용하는 연쇄중합반응(PCR, polymerase chain reaction)에 기초한 것으로서, 민감도 및 특이성이 뛰어나며, 시료의 처리과정 및 수행과정이 비교적 간편하다.

최근 이러한 PCR 기법을 도입한 살모넬라 진단법들이 개발되고 있다. 1999년에 살모넬라 엔테리티디스와 티피뮤리움을 동시에 구별할 수 있는 PCR 기법이 개발되어 논문에 발표 되었으나, 이는 재현성이 없는 것으로 나타났다. 2000년에 살모넬라 티피뮤리움을 단독으로 검출할 수 있는 PCR 기법이 개발 되었으나, 이는 살모넬라 티피뮤리움만을 검출하는 진단법으로 진단에 한계를 가지고 있다. 2008년에 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸을 동시에 구별할 수 있는 리얼타임 PCR(Real-Time PCR)기법이 개발되었으나, 이 개발된 기법에서는 살모넬라 갈리나룸과 살모넬라 두블린(Salmonella dublin)이 구별되지 않아 살모넬라 갈리나룸 진단에는 적합하지 않다. 또한, 2011년에 마찬가지로 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸을 진단할 수 있는 PCR 기법이 개발되었으나, 이는 각각 단독으로 PCR을 수행하여 진단해야 하며 그로 인한 진단 비용과 시간이 증가하는 단점을 가지고 있다. 또 다른 2011년에 개발된 PCR 기법은 살모넬라 갈리나룸을 단독으로 검출할 수 있는 기법이나, 상기 개발 기법들과 마찬가지로 진단에 한계성을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸, 풀로룸의 6종의 특이 유전자 각각에 대한 PCR용 프라이머를 개발하고자 연구를 수행하였으며, 나아가 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있도록 공통의 반응조건을 갖는 프라이머의 개발에 주력하여 왔다. 그 결과, 6종의 특이 유전자 각각의 PCR용 프라이머를 합성하였으며, 6쌍의 프라이머 모두를 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하여 1회의 PCR 수행으로 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

국내특허출원번호 :10-2008-0101620

본 발명의 목적은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은, (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계 및 (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 한번의 PCR을 통해, 특정 시료로부터 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)의 4종의 살모넬라를 확인할 수 있어, 신속하고 정확한 진단이 가능하다.

도 1은 표 1에 기재된 각 프라이머 세트의 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸의 게놈상 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 표 1에 기재된 프라이머 세트 1 내지 3을 이용하여 단독 PCR을 수행한 결과이다.
도 3은 표 1에 기재된 프라이머 세트 4 내지 6을 이용하여 단독 PCR을 수행한 결과이다.
도 4는 표 1에 기재된 프라이머 세트 1 내지 6을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과이다.
도 5는 표 1에 기재된 프라이머 세트 1 내지 6을 이용하여 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸과 닭을 포함하는 가축의 세균성 질병 주요 원인균들에 적용한 멀티플렉스 PCR 결과이다.
도 6은 표 1에 기재된 프라이머 세트 1 내지 6을 이용하여 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸과 상기 4종의 살모넬라와 같은 서브스페시스(Subspecies)에 속하는 살모넬라 하이델베르그(Heidelberg), 센프텐베르그(Senftenberg) 및 인판티스(Infantis) 에 적용한 멀티플렉스 PCR 결과이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 구체적인 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머세트	서열번호	5'→ 3' 염기서열	증폭산물의 크기
1	1	AATTATCGCCACGTTCGGGC	694bp
	2	TTTAGGTTTGGCGGCGCTAC
2	3	GCGCGTCCACCACAGATAAC	517bp
	4	CGGTCCATCATCCGACGGAA
3	5	TGTAGCGGGTCATAGTGGCTG	432bp
	6	CCAGTCACCTCCGCCAAACT
4	7	TGAAAAACAGCAGAAGAAGC	326bp
	8	GAACAGTGTTTCCCTGTCCT
5	9	TGGTGGTGTAGCCACTGTCC	204bp
	10	GCAGTGAAAGTACCTGCTGGC
6	11	GGACGTCATTGTCACTAACC	103bp
	12	TATTAATCCAGCCCCCTTC

본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명의 프라이머는 본 분야에서 올리고뉴클레오타이를 합성할 수 있는 것으로 공지된 임의의 방법, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템^TM 등으로 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수도 있다.

본 발명에 따른 프라이머는 세균에서 변이가 쉬운 유전영역인 플라스미드(Plasmid)를 제외하고, 잘 보존된 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸의 게놈을 기초하여 합성된 것으로, 특이적으로 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 검출할 수 있다.

특정 유전자 검출을 위한 PCR기법은 한 쌍의 프라이머(Forward 프라이머와 Reverse 프라이머)를 이용하게 되는데, 이들 프라이머의 설계 시 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머의 복합체(dimer)형성 방지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다. 특히, 본 발명과 같이, 여러 쌍의 PCR 프라이머를 혼합하여 한번의 PCR을 수행함으로써, 시료로부터 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸를 동시에 확인하는 멀티플렉스 PCR 반응에서는, 6쌍의 프라이머 모두 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로 프라이머의 설계 시 단독 PCR의 경우보다 적정 조건이 더욱 엄격하게 요구되며, 반응완료 후 겔상에서 증폭된 유전자산물의 구별을 위해 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 제약이 존재한다. 특히, 반응조건의 설정에 있어서 6쌍의 프라이머 모두에 대한 비특이 증폭을 제거하기 위한 온도 설정과 프라이머 접촉시간 설정이 매우 어려운 과정이며, 멀티플렉스 PCR 수행을 위한 조성 조건에서 각 조성물의 농도 설정이 매우 어려운 과정이다.

본 발명의 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 프라이머 세트는 멀티플렉스 PCR 기법에 적합하도록 개발된 것으로서, 1회의 PCR 수행으로 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 동시에 고감도로 검출할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어인 “검출”은 시료에서 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum)을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 검출용 조성물은 당 분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가로 포함하여 PERV 검출용 키트로 응용, 제작될 수 있다. 구체적인 예로서, 프라이머 세트 및, 추가적으로 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, 멸균수 등을 포함하여 PCR용 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩용 키트로 제작될 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트 및 검출용 조성물은 DNA를 증폭시킬 수 있는 모든 반응 방법에 이용될 수 있다. 그 예로, PCR (polymerase chain reaction), TMA(transcription-mediated amplification), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), 3SR (self-sustained sequence replication), LCR (ligase chain reaction), SDA (strand displacement amplification) 및 고리매개등온증폭 (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 검출 방법 중 (a) 단계의 게놈 DNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 본 발명의 검출 방법 중 (b)단계에서는, 당업계에 공지된 PCR (Polymerase Chain Reaction)방법을 모두 이용할 수 있다. PCR은 예를 들면, 미국특허 제4,683,195호; 미국특허 제4,683,194호; Saiki et al. Science, 1985, vol.230, pp.1350-1354; Scharf et al. Science, 1986, vol.324, pp.163-166; Kogan et al. New Engl. J. Med., vol.317, pp.986-990 등에 개시되어 있다. PCR은 통상적으로 (1) DNA의 변성 (denaturation); (2) 프라이머의 결합 (annealing); (3) DNA의 합성 (polymerization or elongation) 단계로 이루어져 있다. 본 발명에서 DAN의 변성은 당업계에 공지된 바와 같이 약 80 내지 96℃에서 가열함으로써 달성될 수 있으며 높은 온도일수록 단일 가닥 DNA 로의 분리(변성)가 용이하지만, 온도가 지나치게 높으면 DNA 중합효소의 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 적합한 온도를 설정하여야 한다. 이렇게 분리된 단일가닥 DNA (즉, 주형)에 대한 프라이머의 결합은 통상적으로 37 내지 65℃에서 진행되지만, 상기 온도는 프라이머의 GC 함량 및 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. 주형에 프라이머가 결합하게 되면 상기 프라이머의 말단으로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드가 순차적으로 결합하여 DNA 합성이 일어나게 되는데, 통상적으로 60 내지 75℃에서 실행한다. 본 발명에서 DNA의 변성, 어닐링, DNA의 합성 단계를 25 내지 40회, 바람직하게는 30회 수행하는 것이 적합하다.

본 발명에 있어서, PCR은 DNA의 합성에 적합한 조건에서 수행하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로 PCR은 약 pH 7 내지 9, 바람직하게는 약 pH 8의 완충용액에서 수행한다. 본 발명에서는 HEPES 또는 글리신-NaOH를 포함하는 완충용액 및 인산완충용액 등이 이용될 수 있으며, Tris-HCl을 10 내지 100mM의 농도로 함유하는 완충용액을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 상기 완충용액은 1가의 염(salt)을 약 10mM 내지 60mM의 농도로 함유할 수도 있다. 일반적으로 이용되는 1가의 염에는 KCl, NaCl 및 (NH4)2SO4 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PCR 반응물의 한 성분으로서 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP는 목적한 특정 유전자의 서열을 목적한 양까지 증폭하기에 충분한 양으로 PCR 반응물에 첨가되어야 한다. dNTPs는 바람직하게는 약 0.75 내지 4.0mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 2.0 내지 3.0mM의 농도로 PCR 반응물에 첨가할 수 있다.

상기 PCR 반응물에는 프라이머의 말단으로부터 주형 DNA의 염기서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 순차적으로 연결시키는 반응을 촉매하는 DNA 중합효소가 포함되어야 할 것이다. 본 발명에서는 당업계에 공지된 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, 그러한 예에는 E.coli DNA 중합효소, E.coli DNA 중합효소의 Klenow 단편, T4 DNA 중합효소 등이 포함된다. 그러나 통상적으로 PCR은 고온에서 실행되기 때문에 본 발명에서 이용되는 DNA 중합효소는 고온에서 안정한 성질을 보유한 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 PCR에서는 당업계에 공지된 열에 안정한 DNA 중합효소가 모두 이용될 수 있으며, Taq 중합효소, 예를 들면 Amplitaq-gold 효소를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

또한 본 발명의 검출 방법은, (c) 상기 (b)단계에서 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기 및 형태별로 분리할 수 있으며, 바람직하게는 전기영동을 이용하여 검출한다. '전기영동'은 전기장에서 특정 물질을 크기 및 전하에 따라 분리하는 방법을 의미하는 것으로, 통상적으로 특정 물질을 음극에 로딩하고 전기장을 적용시켜서 상기 물질이 양극으로 이동하면서 분리되도록 유도한다. 뉴클레오타이드로 이루어진 물질의 전기영동에는 일반적으로 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 전술한 전기영동에 이용되는 겔의 제조 및 염색방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어서 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide)를 이용한 아가로스 겔의 염색방법은 Boerwinkle et al. PNAS, 1989, vol.86, pp.212-216에 개시되어 있다. 또한, 은을 이용한 폴리아크릴아미드 겔의 염색방법은 (1) Goldman et al. Electrophoresis, 1982, vol.3, pp.24-26; (2) Marshall, Electrophoresis, 1983, vol.4, pp.269-272; (3) Tegelstrom, Electrophoresis, vol.7, pp.226-229 및 (4) Allen et al. Bio Technique, 1989, vol.7, pp.736-744 등에 개시되어 있다.

본 발명의 검출 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리 (또는 정제)는 증폭과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 프라이머 디자인

National Center for Biotechnology Information 홈페이지에 등록되어있는 살모넬라들의 게놈 서열을 분석하여, 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 효과적이고, 신속하게 검출하기 위한 특이적인 PCR 프라이머를 디자인하였다 (표1).

실시예 2. 프라이머 특이도 확인

살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 검출하기 위한 PCR 프라이머의 특이도 확인을 위하여, 표 1에서 제시한 각 프라이머 세트별로 PCR을 수행하였다. 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸 각각을 메콩키아가 배지(McConkey agar medium)에서 배양한 후, 게놈 DNA를 추출하였다. 표 2에 명기된 PCR 조성으로 PCR 반응은 95℃에서 5분간 열처리를 한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation); 58℃에서 5초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing); 72℃에서 40초간 DNA를 합성하는 단계(extension)를 총 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하며, 마지막 DNA 합성단계는 72℃에서 5분간 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 브로모에티듐(EtBr)이 포함된 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하여 증폭산물을 확인하였다 (도 2 및 도 3). 증폭산물의 크기는 표 1에 제시되어 있다.

반응 혼합물
10 × buffer (25mM MgCl₂)		2
dNTP (각 2mM)		2
프라이머 세트	1	10 pmol
	2
	3
	4
	5
	6
주형 DNA		50 ng
Taq 폴리머라제		1 unit
총 20㎕

도 2의 레인 1은 100 bp 크기의 표지 DNA size marker, 레인 2 내지 5는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 1에 의해 증폭된 694 bp 크기의 증폭산물, 레인 6 내지 9는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 2에 의해 증폭된 517 bp 크기의 증폭산물, 레인 10 내지 13은 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 3에 의해 증폭된 432 bp 크기의 증폭산물을 나타낸 것이다. 또한, 도 3의 레인 1은 100 bp 크기의 표지 DNA size marker, 레인 2 내지 5는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 4에 의해 증폭된 326 bp 크기의 증폭산물, 레인 6 내지 9는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 5에 의해 증폭된 204 bp 크기의 증폭산물, 레인 10 내지 13은 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021), 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184), 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 프라이머 세트 6에 의해 증폭된 103 bp 크기의 증폭산물을 나타낸 것이다

이러한 실험 결과는 도 1에 나타난 모식도와 일치하며, 이를 통해 각 PCR 프라이머 세트가 매우 특이적으로 작용하는 것을 확인하였다.

실시예 3. 멀티플렉스 PCR 을 통한 특이성 확인

살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸을 한번에 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR을 표1에서 제시한 각 프라이머 세트를 이용하여, 표 3에 기재된 PCR 조성으로 수행하였다. 멀티플렉스 PCR 반응은 95℃에서 5분간 열처리를 한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation); 58℃에서 5초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing); 72℃에서 40초간 DNA를 합성하는 단계(extension)를 총 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하며, 마지막 DNA 합성단계는 72℃에서 5분간 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 브로모에티듐(EtBr)이 포함된 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하여 증폭산물을 확인하였다 (도 4). 증폭산물의 크기는 표 1에 제시되어 있다.

반응 혼합물
10 × buffer (25mM MgCl₂)		2
dNTP (각 2mM)		2
프라이머 세트	1	5 pmol
	2	각 3 pmol
	3
	4	10 pmol
	5	5 pmol
	6	10 pmol
주형 DNA		50 ng
Taq 폴리머라제		1 unit
총 20㎕

도 4에서, 레인 1은 100 bp 크기의 표지 DNA size marker, 레인 2는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 432, 326, 204, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 3은 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 517, 326, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 4는 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 204 bp 크기의 증폭산물, 레인 5는 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 204 bp 크기의 증폭산물을 나타낸 것이다

이러한 실험 결과는 도 1에 나타난 모식도와 일치하며, 이를 통해 각 PCR 프라이머 세트가 멀티플렉스 PCR 조건에서 매우 특이적으로 작용하는 것을 확인하였다.

실시예 4. 살모넬라 및 기타 세균성질병의 주요 원인균간의 검출 특이성 확인

닭을 포함하는 가축의 세균성질병의 주요 원인균들과 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸 등 상기 4종의 살모넬라와의 구분이 가능한 지 확인하기 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

표1에서 각 프라이머 세트를 이용하여, 표 3에 기재된 PCR 조성으로 수행하였다. 이 때 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 브로모에티듐(EtBr)이 포함된 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하여 증폭산물을 확인하였다 (도 5). 증폭산물의 크기는 표 1에 제시되어 있다.

도 5에서, 레인 1은 100 bp 크기의 표지 DNA size marker, 레인 2는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 432, 326, 204, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 3은 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 517, 326, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 4는 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 204 bp 크기의 증폭산물, 레인 5는 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 204 bp 크기의 증폭산물을 나타낸 것이다. 또한, 레인 6은 에스체리카아 콜라이(Escherichia coli, ATCC 25922), 레인 7은 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes, KCTC 3096), 레인 8은 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida, KVCC-BA0001831), 레인 9는 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입A(Clostridium perfringens Type A, KTCC 3269), 레인 10은 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입C(Clostridium perfringens Type C, ATCC 3628), 레인 11은 마이코플라즈마 갈리나룸(Mycoplasma gallinarum, ATCC 19708), 레인 12는 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae, ATCC 25204) 를 확인한 결과이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 레인 6 내지 레인 12의 세균에서는 본 발명에서 개발된 멀티플렉스 PCR에 의해 증폭산물이 나타나지 않았다. 이를 통해 본 발명의 프라이머가 가축 세균성질병의 주요 원인균들과 구분되어 4종의 살모넬라를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 기타 살모넬라와의 검출 특이성 확인

살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸 등 상기 4종의 살모넬라 및 상기 4종의 살모넬라와 같은 서브스페시스에 속하는 살모넬라들과 구분이 가능한 지 확인하기 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

표1에서 각 프라이머 세트를 이용하여, 표 3에 기재된 PCR 조성으로 수행하였다. 이 때 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 브로모에티듐(EtBr)이 포함된 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하여 증폭산물을 확인하였다 (도 6). 증폭산물의 크기는 표 1에 제시되어 있다.

도 6에서, 레인 1은 100 bp 크기의 표지 DNA size marker, 레인 2는 살모넬라 엔테리티디스(KCCM 12021)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 432, 326, 204, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 3은 살모넬라 티피뮤리움(ATCC 14028)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 517, 326, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 4는 살모넬라 갈리나룸(ATCC 9184)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 204 bp 크기의 증폭산물, 레인 5는 살모넬라 풀로룸(ATCC 19945)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 204 bp 크기의 증폭산물, 레인 6은 살모넬라 하이델베르그(Salmonella heidelberg, KVCC-BA0000506)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 7은 살모넬라 센프텐베르그(Salmonella senftenberg, KVCC-BA0000590)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 103 bp 크기의 증폭산물, 레인 8은 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis, KVCC-BA0000469)의 게놈 유전자로부터 6쌍의 프라이머 세트에 의해 증폭된 694, 326, 103 bp 크기의 증폭산물을 나타낸 것이다

이를 통해 본 발명의 프라이머를 이용할 경우, 살모넬라 엔테리티디스, 티피뮤리움, 갈리나룸 및 풀로룸과 같은 서브스페시스에 속하는 살모넬라들과 구분되어 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 조성물.
제2항의 조성물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출용 키트.
(a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계 및 (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 을 동시에 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, (c) 상기 (b)단계에서 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 을 동시에 검출하는 방법.