JP5799139B2 - パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、パエシロマイセス サトゥラタス（Paecilomyces saturatus）及びパエシロマイセス ディバリカタス（Paecilomyces divaricatus）の検出方法に関する。

パエシロマイセス サトゥラタス（Paecilomyces saturatus）及びパエシロマイセス ディバリカタス（Paecilomyces divaricatus）は自然界に広く分布する不完全真菌である。パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスは食品の重大な危害菌であるパエシロマイセス バリオッティ（Paecilomyces variotii）に形態学的に極めて類似しており、長年パエシロマイセス バリオッティであると考えられてきた。しかしながら、近年の遺伝学的な解析により、パエシロマイセス サトゥラタスとパエシロマイセス ディバリカタスはパエシロマイセス バリオッティと別種であることが明らかとなった。これら３種のパエシロマイセスは、生活環の中で厚膜胞子と呼ばれる二重の細胞壁からなる無性胞子を形成する。パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの厚膜胞子はストレス耐性が極めて高いことが知られており、一般的な真菌菌糸の熱及び薬剤での殺菌条件でも生存・増殖することが知られている。従って、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスは食品業界やトイレタリー業界において危害菌として重要視されている。このため、防腐・防黴体制の確立において、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出・同定が極めて重要であると認識されている。

パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出及び同定法は、培養による形態学的な種分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには、損傷菌などの菌体の状態によっては培養を続けても種特異的な形態が形成されないことがあるため、従来の同定法による解析結果の信頼性に問題が指摘されてきた。従って、迅速性及び信頼性の問題を解決した検出・同定方法の確立が求められている。

菌類の迅速かつ信頼性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法（たとえばＰＣＲ法やＬＡＭＰ法）が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスに特異的な遺伝子領域が解明されていない。従って、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。

特表平１１−５０５７２８号公報 特開２００６−６１１５２号公報 特開２００６−３０４７６３号公報 特開２００７−１７４９０３号公報

本発明は、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを課題とする。また、本発明の課題は、この方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することにある。

上述のようにパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法では擬陽性や擬陰性の結果が出る点である。そしてこれは、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの遺伝子のデータベースが現在のところ貧弱であり、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確にわかっていないために、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出・識別するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることが原因であると考えた。

このような課題に鑑み、本発明者等は、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出・識別しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見出した。また、この可変領域をターゲットとすることでパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。

本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行う工程を含むことを特徴とするパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド

また、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの塩基配列で表される核酸の全部又は一部が含まれるかを確認することを特徴とするパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出方法に関する。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

また、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドに関する。

また、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対又は下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対で示されたパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチド対に関する。

また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド対を含むパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出キットに関する。

本発明の検出方法は、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的、簡便かつ迅速に検出することができる。また、本発明オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。

実施例１における、本発明の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。 実施例１における、本発明の（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。 実施例２における、本発明の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

本発明は、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわちパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子配列中に存在するパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスにそれぞれ特異的な領域（可変領域）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行い、パエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に識別・検出する方法である。ここで、「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は他の真菌との間で大きく異なる。本発明における「パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタス」及び「パエシロマイセス ディバリカタス」は、ぞれぞれ糸状不完全菌類のパエシロマイセス（Paecilomyces）に属する。また、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。

パエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域を配列番号５に基づき説明する。なお、配列番号５で示された塩基配列は、パエシロマイセス サトゥラタスＩＦＭ５０２９５株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。配列番号５で示された塩基配列のうち、７０位〜１００位までの領域、及び３１０位〜３５０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有する可変領域であることを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を対象としたものである。

前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５で示された塩基配列のうち８０位〜９７位までの領域及び３２４位〜３４３位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。したがって、前記（ａ）及び／又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に識別・同定することができる。

本発明において、前記（ａ）及び／又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｅ）又は（ｆ）の塩基配列で表される核酸の全部又は一部（好ましくは、前記可変領域）が含まれるかを確認することが好ましい。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

パエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域を配列番号６に基づき説明する。なお、配列番号６で示された塩基配列は、パエシロマイセス ディバリカタスＩＦＭ５０２９１株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。配列番号６で示された塩基配列のうち、５０位〜９０位までの領域、及び１８０位〜２２０位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有する可変領域であることを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を対象としたものである。

前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６で示された塩基配列のうち５９位〜７８位までの領域及び１９２位〜２１１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。したがって、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に識別・同定することができる。

本発明において、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｇ）又は（ｈ）の塩基配列で表される核酸の全部又は一部（好ましくは、前記可変領域）が含まれるかを確認することが好ましい。
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

前記（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。

本発明の検出方法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定し検出を行うために、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いる。
本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドとしては、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列において１つの塩基配列中、１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。

上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。

本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プライマー及び核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。

本発明の検出法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定、検出するために、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのがさらに好ましい。パエシロマイセス サトゥラタスを同定、検出するためには、前記（ａ）及び／又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのが好ましい。パエシロマイセス ディバリカタスを同定、検出するためには、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのが好ましい。

被検体中のパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを検出するためには、前記（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出法により検出すればよい。上記核酸プローブはパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスを迅速かつ簡便に検出することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。

本発明の検出方法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行うため、前記（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを用いて、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの塩基配列の全部又は一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。当該領域を含むＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行う場合について説明する。

本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行い、パエシロマイセス サトゥラタスを検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、前記（ａ）及び（ｂ）オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがより好ましく、前記配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。
また、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。

配列番号１及び配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス サトゥラタスのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ａ）及び（ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号５に記載の塩基配列のうち、それぞれ８０位〜９７位まで、３２４位〜３４３位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に検出することができる。

本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行い、パエシロマイセス ディバリカタスを検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、前記（ｃ）及び（ｄ）オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがより好ましく、前記配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。
また、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。

配列番号３及び配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス ディバリカタスのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号６に記載の塩基配列のうち、それぞれ５９位〜７８位まで、１９２位〜２１１位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出することができる。

本発明におけるＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてＰＣＲ法を行う場合、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６０℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。また、前記（ｃ）及び（ｄ）オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてＰＣＲ法を行う場合、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６３℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。

本発明において、ＰＣＲ法により増幅した遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められる。具体的には、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約２５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められ、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれているかを確認することができる。

本発明において、標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅のために用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。

本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、パエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。

本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び／又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。
例えば、本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用キットは、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド対又は前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、ＰＣＲ法によりパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスを検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＰＣＲ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。

本発明の方法によれば、検体の調製工程から菌類の検出工程までを約６０〜１２０分という短時間で行うことが可能である。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ パエシロマイセス サトゥラタスの検出
（１）プライマーの調製
ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）斜面培地にて２５℃、７日間暗所培養した各種菌体から、Genとるくん（商品名、タカラバイオ社）を使用し、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰｕＲｅ Ｔａｑ（商品名）Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ ＵＫ ＬＴＤ）、並びにプライマーとして、Bt2aプライマー（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号７）及びBt2bプライマー（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号８）を用いて、Ｇｌａｓｓ ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，１９９５を参考にＰＣＲ法により遺伝子断片の増幅を行った。ＰＣＲ反応条件は、変性温度９５℃で１分、アニーリング温度５９℃で１分及び伸長温度７２℃で１分行い、これらを１サイクルとしたものを３５サイクル行った。ＰＣＲ産物は、Ａｕｔｏ Ｓｅｇ（商品名）Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により精製し、ラベル化は、ＢｉｇＤｙｅ（商品名）ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒ．１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲ産物の解析を実施した。塩基配列の決定には、ソフトウエア‘ＡＴＧＣ Ｖｅｒ．４’（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）を使用した。
上記のように決定した各種菌類（パエシロマイセス サトゥラタス、パエシロマイセス バリオッティー（Paecilomyces variotii）、パエシロマイセス フォーモサス（Paecilomyces formosus）、パエシロマイセス ディバリカタス、ビソクラミス ニベア（Byssochlamys nivea））のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス サトゥラタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号１及び２に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。

（２）検体の調製
パエシロマイセス属及びパエシロマイセス属に類縁のビソクラミス属に属する耐熱性菌としては表１に記載した菌株を使用した。その他飲食品の製造環境に分布するカビとしては表２に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが管理しJCMナンバーで管理された株、財団法人発行研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び化学品原料から単離された株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いての各菌の最適温度で７日間培養した。

（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地（組成：培地１０００Ｌ当り馬鈴薯抽出液２００ｇ、ブドウ糖２０ｇ及び寒天１５ｇ、栄研化学株式会社）に播種した。２５℃の培養条件下で２〜５日間培養し、１白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。

（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Ｐｒｅ Ｍｉｘ Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ、無菌蒸留水１０μＬを混合し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（PaeB1Fプライマー、２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（PaeB1Rプライマー、２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１分秒間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、および(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。

（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μＬを分取してローディングバッファーと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２０分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ ｉｎ １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図１及び図２に示す。なお、図１は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図２は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図中の記号Ｍは、分子量マーカー（商品名：ＥＺ Ｌｏａｄ ＴＭ １００ｂｐ、ＢＩＯ ＲＡＤ社）のレーンを示す。

その結果、パエシロマイセス サトゥラタスのゲノムＤＮＡを含む試料では、２５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス サトゥラタス以外のパエシロマイセス属、及びその他食品の製造環境に広く分布する真菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に検出し、種レベルで同定することができる。

実施例２ パエシロマイセス ディバリカタスの検出
（１）プライマーの調製
実施例１で決定した各種菌類（パエシロマイセス ディバリカタス、パエシロマイセス バリオッティー、パエシロマイセス フォーモサス、パエシロマイセス サトゥラタス、ビソクラミス ニベア）のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス ディバリカタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号３および４に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。

（２）検体の調製
パエシロマイセス ディバリカタスとその他飲食品の製造環境に分布する耐熱性菌としては表３に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、及びThe Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いての各菌の最適温度で７日間培養した。

（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地（組成：培地１０００Ｌ当り馬鈴薯抽出液２００ｇ、ブドウ糖２０ｇ及び寒天１５ｇ、栄研化学株式会社）に播種した。２５℃の培養条件下で２〜７日間培養し、１白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎ ｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。

（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Ｐｒｅ Ｍｉｘ Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ、無菌蒸留水１０μＬを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae5Fプライマー、２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及び配列番号４記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Pae5Rプライマー、２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、および(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行った。

（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から２μＬを分取してローディングバッファーと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２０分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ ｉｎ １×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図３に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、電気泳動において、分子量マーカーとしてＢＩＯ ＲＡＤ社製のＥＺ ＬｏａｄＴＭ １００ｂｐ（商品名）を用いた。

その結果、パエシロマイセス ディバリカタスのゲノムＤＮＡを含む試料では、１５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス ディバリカタス以外の飲食品の製造環境に広く分布する耐熱性菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出し、種レベルで同定することができる。

実施例１〜２の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを検出することが可能である。

Claims (5)

1. 下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認して同定を行い、パエシロマイセス・ディバリカタス（Paecilomyces divaricatus）を検出する、パエシロマイセス・ディバリカタスの検出方法。
   （ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
   （ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
2. 前記オリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項１に記載の検出方法。
3. 下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなる、パエシロマイセス・ディバリカタス（Paecilomyces divaricatus）検出用オリゴヌクレオチド対。
   （ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
   （ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
4. 下記（ｇ）及び（ｈ）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス・ディバリカタスを特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項３に記載の検出用オリゴヌクレオチド対。
   （ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
   （ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
5. 請求項３又は４に記載のオリゴヌクレオチド対を含む、パエシロマイセス・ディバリカタス（Paecilomyces divaricatus）検出キット。