JP5799139B2 - パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号1に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号2に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号5に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(f)配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
(g)配列番号6に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
(e)配列番号5に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(f)配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
(g)配列番号6に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドとしては、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられ、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
本発明において、PCR法により増幅反応を行いパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行う場合について説明する。
また、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
前記(a)及び(b)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号5に記載の塩基配列のうち、それぞれ80位〜97位まで、324位〜343位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に検出することができる。
また、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
前記(c)及び(d)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号6に記載の塩基配列のうち、それぞれ59位〜78位まで、192位〜211位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出することができる。
検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してPCR反応を行い、得られたPCR反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的なDNA断片の増幅が認められる。具体的には、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約250bpのDNA断片の増幅が認められ、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約150bpのDNA断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれているかを確認することができる。
検体からDNAを調製する方法としては、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行うのに十分な精製度及び量のDNAが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のRNAを逆転写して得られるDNAを用いることもできる。
例えば、本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用キットは、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対又は前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、PCR法によりパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスを検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素等)、酵素基質(dNTP,rNTP等)等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってPCR反応が正常に進行することを確認するための陽性対照(ポジティブコントロール)を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだDNAが挙げられる。
(1)プライマーの調製
PDA(ポテトデキストロース寒天)斜面培地にて25℃、7日間暗所培養した各種菌体から、Genとるくん(商品名、タカラバイオ社)を使用し、DNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型とし、PuRe Taq(商品名)Ready−To−Go PCR Beads(GE Health Care UK LTD)、並びにプライマーとして、Bt2aプライマー(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’:配列番号7)及びBt2bプライマー(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’:配列番号8)を用いて、Glass and Donaldson,1995を参考にPCR法により遺伝子断片の増幅を行った。PCR反応条件は、変性温度95℃で1分、アニーリング温度59℃で1分及び伸長温度72℃で1分行い、これらを1サイクルとしたものを35サイクル行った。PCR産物は、Auto Seg(商品名)G−50(Amersham Pharmacia Biotech)により精製し、ラベル化は、BigDye(商品名)terminator Ver.1.1(Applied Biosystems)を使用して行い、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(商品名、Applied Biosystems)でPCR産物の解析を実施した。塩基配列の決定には、ソフトウエア‘ATGC Ver.4’(Genetyx社)を使用した。
上記のように決定した各種菌類(パエシロマイセス サトゥラタス、パエシロマイセス バリオッティー(Paecilomyces variotii)、パエシロマイセス フォーモサス(Paecilomyces formosus)、パエシロマイセス ディバリカタス、ビソクラミス ニベア(Byssochlamys nivea))のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、DNA解析ソフトウエア(商品名:DNAsis pro、日立ソフトウエア社製)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス サトゥラタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号1及び2に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
パエシロマイセス属及びパエシロマイセス属に類縁のビソクラミス属に属する耐熱性菌としては表1に記載した菌株を使用した。その他飲食品の製造環境に分布するカビとしては表2に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが管理しJCMナンバーで管理された株、財団法人発行研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び化学品原料から単離された株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いての各菌の最適温度で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地(組成:培地1000L当り馬鈴薯抽出液200g、ブドウ糖20g及び寒天15g、栄研化学株式会社)に播種した。25℃の培養条件下で2〜5日間培養し、1白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は5ng/μLに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μL、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μL、無菌蒸留水10μLを混合し、配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(PaeB1Fプライマー、20pmol/μL)0.5μL及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(PaeB1Rプライマー、20pmol/μL)0.5μLを加え、25μLのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)98℃、1分秒間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、および(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μLを分取してローディングバッファーと十分に混和し、2%アガロースゲルを用いて電気泳動(135V、20分間)を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果を図1及び図2に示す。なお、図1は表1に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図2は表2に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図中の記号Mは、分子量マーカー(商品名:EZ Load TM 100bp、BIO RAD社)のレーンを示す。
(1)プライマーの調製
実施例1で決定した各種菌類(パエシロマイセス ディバリカタス、パエシロマイセス バリオッティー、パエシロマイセス フォーモサス、パエシロマイセス サトゥラタス、ビソクラミス ニベア)のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、DNA解析ソフトウエア(商品名:DNAsis pro、日立ソフトウエア社製)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス ディバリカタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号3および4に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
パエシロマイセス ディバリカタスとその他飲食品の製造環境に分布する耐熱性菌としては表3に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、及びThe Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いての各菌の最適温度で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地(組成:培地1000L当り馬鈴薯抽出液200g、ブドウ糖20g及び寒天15g、栄研化学株式会社)に播種した。25℃の培養条件下で2〜7日間培養し、1白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は5ng/μLに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μL、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μL、無菌蒸留水10μLを混合し、配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae5Fプライマー、20pmol/μL)0.5μL及び配列番号4記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae5Rプライマー、20pmol/μL)0.5μLを加え、25μLのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、および(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μLを分取してローディングバッファーと十分に混和し、2%アガロースゲルを用いて電気泳動(135V、20分間)を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果を図3に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、電気泳動において、分子量マーカーとしてBIO RAD社製のEZ LoadTM 100bp(商品名)を用いた。
Claims (5)
- 下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認して同定を行い、パエシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)を検出する、パエシロマイセス・ディバリカタスの検出方法。
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1に記載の検出方法。
- 下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなる、パエシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)検出用オリゴヌクレオチド対。
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 下記(g)及び(h)のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセス・ディバリカタスを特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項3に記載の検出用オリゴヌクレオチド対。
(g)配列番号6に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス・ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列 - 請求項3又は4に記載のオリゴヌクレオチド対を含む、パエシロマイセス・ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)検出キット。
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