JP5934043B2 - ケトミウム・フニコラの検出方法 - Google Patents
ケトミウム・フニコラの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5934043B2 JP5934043B2 JP2012156860A JP2012156860A JP5934043B2 JP 5934043 B2 JP5934043 B2 JP 5934043B2 JP 2012156860 A JP2012156860 A JP 2012156860A JP 2012156860 A JP2012156860 A JP 2012156860A JP 5934043 B2 JP5934043 B2 JP 5934043B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- funicola
- oligonucleotide
- seq
- base sequence
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 66
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 131
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 51
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 43
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 31
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000002314 Dichotomopilus funicola Species 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 25
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 22
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 14
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 14
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000012371 Aseptic Filling Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 241001277387 Chaetomium grande Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000002335 Dichotomopilus indicus Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000002049 Amesia atrobrunnea Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000002059 Botryotrichum murorum Species 0.000 description 1
- 241001017676 Chaetomium carinthiacum Species 0.000 description 1
- 241001017675 Chaetomium crispatum Species 0.000 description 1
- 241001017677 Chaetomium cruentum Species 0.000 description 1
- 241000221877 Chaetomium elatum Species 0.000 description 1
- 241001515917 Chaetomium globosum Species 0.000 description 1
- 241001017753 Chaetomium interruptum Species 0.000 description 1
- 241001017690 Chaetomium megalocarpum Species 0.000 description 1
- 241001277383 Chaetomium rectangulare Species 0.000 description 1
- 241001017686 Chaetomium subaffine Species 0.000 description 1
- 241001017750 Chaetomium truncatulum Species 0.000 description 1
- 241001277381 Chaetomium undulatulum Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 238000013398 bayesian method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010252 digital analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 235000021147 sweet food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、ケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出方法に関する。
糸状菌の一種であるケトミウム（Chaetomium）属の菌類は、自然界に広く分布し、食品や飲料の変敗に関与することが知られている。このうち、ケトミウム属菌類の１種であるケトミウム・フニコラは飲食品事故の原因菌として知られている。
飲食品製造において、内容物（飲食品自体）やその原材料だけではなく、製造装置、製造環境、包装容器等に関しても殺菌処理が行われる。内容物やその原材料に関しては加熱殺菌を行うが、製造環境、製造設備、包装容器等に関しては薬剤による殺菌等種々の殺菌法が提案されている。その１つである無菌充填方式は、製造環境、製造設備、包装容器等を過酢酸等を用いて殺菌し、加熱殺菌を行った内容物を充填し製品の商業的無菌性を担保するものである。ここで、ケトミウム・フニコラは、無菌充填方式で用いられる殺菌剤の１種である過酢酸に対し耐性を有することが知られており、過酢酸を用いて滅菌、殺菌を行う飲食品製造においてケトミウム・フニコラは最重要危害菌に位置付けられている。よって、ケトミウム・フニコラの検出が極めて重要である。
飲食品製造において、内容物（飲食品自体）やその原材料だけではなく、製造装置、製造環境、包装容器等に関しても殺菌処理が行われる。内容物やその原材料に関しては加熱殺菌を行うが、製造環境、製造設備、包装容器等に関しては薬剤による殺菌等種々の殺菌法が提案されている。その１つである無菌充填方式は、製造環境、製造設備、包装容器等を過酢酸等を用いて殺菌し、加熱殺菌を行った内容物を充填し製品の商業的無菌性を担保するものである。ここで、ケトミウム・フニコラは、無菌充填方式で用いられる殺菌剤の１種である過酢酸に対し耐性を有することが知られており、過酢酸を用いて滅菌、殺菌を行う飲食品製造においてケトミウム・フニコラは最重要危害菌に位置付けられている。よって、ケトミウム・フニコラの検出が極めて重要である。
ケトミウム・フニコラの検出方法、及び他の種との識別方法は、培養を用いた形態学的な種分類が主となっている。この方法は形態学的な特徴が確認できるまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などによる損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出・識別結果の正確性に問題があった。
このように真菌の検出に長期間を要し、さらには他の種との識別結果の正確性に問題がある形態学的な方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
このように真菌の検出に長期間を要し、さらには他の種との識別結果の正確性に問題がある形態学的な方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
特許文献１には、ケトミウム・フニコラを含むケトミウム属の菌類のゲノムＤＮＡ中の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅することにより、ケトミウム属の菌類を検出する方法が記載されている。しかし、特許文献１記載の方法はケトミウム属の菌類を属レベルで検出することはできるが、ケトミウム属の菌類のうちケトミウム・フニコラのみを検出することができない。
飲食品の無菌充填方式はホットパック充填方式と異なり、包装容器を加熱しないため、包装容器には耐熱性が求められない。したがって、過酢酸や過酸化水素を用いて製造環境、製造設備、包装容器等を殺菌する無菌充填方式を導入することにより、包装容器の肉薄化が可能になり、生産コストの減少や、包装容器運搬に係るコストの低減及びＣＯ2排出量の低下が実現できる。したがって、過酢酸耐性を有し、無菌充填方式における危害菌であるケトミウム・フニコラの迅速かつ正確な検出が、特に飲食品業界において強く望まれている。
さらに、ケトミウム・フニコラを始めとする真菌の過酢酸耐性は、菌種により強さ、すなわち無菌充填方式における危害性が大きく異なる。したがって、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することが重要となる。
さらに、ケトミウム・フニコラを始めとする真菌の過酢酸耐性は、菌種により強さ、すなわち無菌充填方式における危害性が大きく異なる。したがって、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することが重要となる。
本発明は、飲食品業界などにおいて危害菌とされているケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出し、他の種の真菌と識別しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
上述のようにケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたＰＣＲ法ではケトミウム・フニコラに対する特異性が低く、擬陽性や擬陰性の結果となる可能性が高い点が挙げられる。これは、ケトミウム・フニコラの遺伝子のデータベースが現在のところ脆弱であり、ケトミウム・フニコラの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確に解析されていないために、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることなどが原因であると考えた。
このような課題に鑑み、本発明者等は、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ検出キットに関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ検出キットに関する。
本発明の検出方法は、飲食品の汚染事故の原因菌の１種であるケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出し、他の属の真菌と識別することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。
本発明は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの検出を行い、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。
本発明における「ケトミウム・フニコラ」とは、担子菌類の１種で、酸性食品、乳製品、甘味食品からの検出例の報告の多い過酢酸耐性菌類である。
本明細書において、「過酢酸耐性菌類」とは、無菌充填飲食品の事故報告がある菌種又は無菌充填飲食品の事故を起こし得る菌種であり、かつ１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも生残する菌類を指す。具体的には、前記条件下の過酢酸殺菌によっても、食品業界において商業的無菌を担保する殺菌である６Ｄ殺菌（初発菌数を1／1000000に低減する殺菌）を確保することが出来ない菌類を指す。本発明者らは、ケトミウム・フニコラNBRC6555株について、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理によるＤ値（初期の菌数を1／10にするのに必要な滅菌処理単位）を測定したところ、Ｄ値＝０．２Ｄであった。すなわち、ケトミウム・フニコラは、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも、初発菌数が1／1000000まで低減せず、６Ｄに満たなかった。
本明細書において、「過酢酸耐性菌類」とは、無菌充填飲食品の事故報告がある菌種又は無菌充填飲食品の事故を起こし得る菌種であり、かつ１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも生残する菌類を指す。具体的には、前記条件下の過酢酸殺菌によっても、食品業界において商業的無菌を担保する殺菌である６Ｄ殺菌（初発菌数を1／1000000に低減する殺菌）を確保することが出来ない菌類を指す。本発明者らは、ケトミウム・フニコラNBRC6555株について、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理によるＤ値（初期の菌数を1／10にするのに必要な滅菌処理単位）を測定したところ、Ｄ値＝０．２Ｄであった。すなわち、ケトミウム・フニコラは、１０００ｐｐｍの過酢酸殺菌（４０℃、１分間）処理でも、初発菌数が1／1000000まで低減せず、６Ｄに満たなかった。
本明細書において、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
本明細書における「種」とは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列について分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹に基づいて分類した菌種群を意味する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining method）、最大節約法（Maximum parsimony）、最尤法（Maximum likelihood estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining method）、最大節約法（Maximum parsimony）、最尤法（Maximum likelihood estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
本発明の検出方法は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
発明者等は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中に同一種内では保存性が高いが異なる種間で塩基配列の保存性が低く、種によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてケトミウム・フニコラは種固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
発明者等は、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中に同一種内では保存性が高いが異なる種間で塩基配列の保存性が低く、種によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてケトミウム・フニコラは種固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
本発明の検出方法は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
前記オリゴヌクレオチド対を使用してケトミウム・フニコラを種レベルで検出し、同定することにより、ケトミウム・フニコラの検出が可能となる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
前記オリゴヌクレオチド対を使用してケトミウム・フニコラを種レベルで検出し、同定することにより、ケトミウム・フニコラの検出が可能となる。
ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位を図２、及び配列番号３に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、図２は、ケトミウム・フニコラC73株(DDBJ getentry 検索：http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/top-j.htmlアクセッションナンバーHM365300)及びケトミウム・インディカムC57株（DDBJ getentry 検索：http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/top-j.htmlアクセッションナンバーHM365273株）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、並びにケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す。また、配列番号３に記載の塩基配列は、ケトミウム・フニコラ C73株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示す。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_F2ともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_R2ともいう）はそれぞれ、配列番号３に記載の塩基配列のうち１９位〜４３位までの領域及び２８９位〜３１０位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はケトミウム・フニコラが固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればケトミウム・フニコラに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりケトミウム・フニコラを検出することが可能となる。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_F2ともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Cfu_R2ともいう）はそれぞれ、配列番号３に記載の塩基配列のうち１９位〜４３位までの領域及び２８９位〜３１０位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はケトミウム・フニコラが固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればケトミウム・フニコラに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりケトミウム・フニコラを検出することが可能となる。
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
本発明の検出方法に用いる前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出に使用できれば、配列番号１又は２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１又は２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつケトミウム・フニコラの種レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。本発明においては、本発明の方法により検出するケトミウム・フニコラと、ケトミウム・インディカムとを区別するために、ケトミウム・インディカムのβ−チューブリン遺伝子に本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端側でハイブリダイズしないよう、本発明のオリゴヌクレオチドを設計するのが好ましい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、ケトミウム・フニコラの遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、ケトミウム・フニコラを種レベルで検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでケトミウム・フニコラを種レベルで検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
本発明の検出方法において、ケトミウム・フニコラを種レベルで検出するために、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
被検体中のケトミウム・フニコラを種レベルで検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のケトミウム・フニコラを迅速かつ正確に種レベルで検出することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
本発明の検出方法において、ケトミウム・フニコラの検出を行うため、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いケトミウム・フニコラの検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いケトミウム・フニコラの検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、本発明における「ケトミウム・フニコラ」は、分類学上の分類に関わらず、配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号３に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列、又は、配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をβ−チューブリン遺伝子に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をケトミウム・フニコラ検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をケトミウム・フニコラ検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９℃以上（好ましくは６１℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５９℃以上（好ましくは６１℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にケトミウム・フニコラが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約300bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にケトミウム・フニコラが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約300bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。
本発明において、前記オリゴヌクレオチド対を用いて被検体のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかに含まれるか否かを確認することで、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・フニコラを種レベルで検出することもできる。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、その一致又は相違に基づいて前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しケトミウム・フニコラの種レベルの検出を行うものである。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかとを比較し、前記（ｃ）及び（ｄ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をケトミウム・フニコラと同定することができる。このようにして、ケトミウム・フニコラを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、ケトミウム・フニコラの検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、ケトミウム・フニコラの検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
本発明のケトミウム・フニコラ検出キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のケトミウム・フニコラの検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、ケトミウム・フニコラ検出キット、使用並びに方法を開示する。
＜１＞下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
＜２＞検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、前記＜１＞項記載の検出方法。
＜３＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞前記ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
＜３＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞前記ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
＜５＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
＜６＞前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、前記＜５＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜７＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜５＞又は＜６＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜８＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜７＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜７＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜５＞又は＜６＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜８＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜７＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜９＞前記＜５＞〜＜８＞のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ検出キット。
＜１０＞ケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーとしての、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１１＞ケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１２＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーとして使用する方法。
＜１１＞ケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１２＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをケトミウム・フニコラ検出用核酸プライマーとして使用する方法。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１ ケトミウム属に属する菌類の分子系統樹の作成
下記の方法により、ケトミウム属に属する菌類各種（ケトミウム・フニコラ、ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）、ケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）、ケトミウム・インディカム、ケトミウム・クリスパタム（Chaetomium crispatum）、ケトミウム・トランカチュラム（Chaetomium truncatulum）、ケトミウム・カリンチアカム（Chaetomium carinthiacum）、ケトミウム・アトロブランネウム（Chaetomium atrobrunneum）及びケトミウム・ムロラム（Chaetomium murorum））のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
下記の方法により、ケトミウム属に属する菌類各種（ケトミウム・フニコラ、ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）、ケトミウム・クルエンタム（Chaetomium cruentum）、ケトミウム・アンデュラチュラム（Chaetomium undulatulum）、ケトミウム・スバフィン（Chaetomium subaffine）、ケトミウム・レクタングラー（Chaetomium rectangulare）、ケトミウム・エラタム（Chaetomium elatum）、ケトミウム・インターラプタム（Chaetomium interruptum）、ケトミウム・メガロカルパム（Chaetomium megalocarpum）、ケトミウム・グランデ（Chaetomium grande）、ケトミウム・インディカム、ケトミウム・クリスパタム（Chaetomium crispatum）、ケトミウム・トランカチュラム（Chaetomium truncatulum）、ケトミウム・カリンチアカム（Chaetomium carinthiacum）、ケトミウム・アトロブランネウム（Chaetomium atrobrunneum）及びケトミウム・ムロラム（Chaetomium murorum））のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
ポテトデキストロース寒天培地（PDA培地、Difco社製）を用いて、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、及びThe CABI Bioscience Fungal Reference Collectionが保管しIMIナンバーにより管理されている株を適温（２５〜３７℃）で２〜５日間暗所培養を行った。
培養後の菌体１白金耳量をPrepman UltraReagent（商品名、Applied Biosystems社製）を使用し、マニュアルに準じた操作手順でＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度はNanoDrop（商品名、エル・エム・エス社製）を用いて測定し、ultra PURE Distilled Water（商品名、インビトロジェン社製）を用いて５ｎｇ／μＬとなるように希釈調製した。
各菌種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列をDNA data bank of Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）のARSA検索、及びBt2aプライマー（5’-aataggtgccgctttctgg-3’：配列番号４）とBt2bプライマー（5’-agttgtcgggacggaagag-3’：配列番号５）（Glass and Donaldson，Appl Environ Microbiol 61：1323−1330，1995）を用いたＰＣＲ（変性温度９５℃１分、アニーリング温度５５℃１分、伸長温度７２℃１分の３５サイクル）で得られたＰＣＲ産物の解析により得た。ＰＣＲ産物は、BigDye terminator Ver．1.1（商品名、Applied Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
得られた塩基配列をClustal W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を使用してアライメント解析を行い、ソフトウェアNJPLOTを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
培養後の菌体１白金耳量をPrepman UltraReagent（商品名、Applied Biosystems社製）を使用し、マニュアルに準じた操作手順でＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度はNanoDrop（商品名、エル・エム・エス社製）を用いて測定し、ultra PURE Distilled Water（商品名、インビトロジェン社製）を用いて５ｎｇ／μＬとなるように希釈調製した。
各菌種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列をDNA data bank of Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）のARSA検索、及びBt2aプライマー（5’-aataggtgccgctttctgg-3’：配列番号４）とBt2bプライマー（5’-agttgtcgggacggaagag-3’：配列番号５）（Glass and Donaldson，Appl Environ Microbiol 61：1323−1330，1995）を用いたＰＣＲ（変性温度９５℃１分、アニーリング温度５５℃１分、伸長温度７２℃１分の３５サイクル）で得られたＰＣＲ産物の解析により得た。ＰＣＲ産物は、BigDye terminator Ver．1.1（商品名、Applied Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
得られた塩基配列をClustal W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を使用してアライメント解析を行い、ソフトウェアNJPLOTを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
図１に示すように、ケトミウム・フニコラが存在するクレイド（C. indicum clade）にはケトミウム・フニコラ以外にもケトミウム・インディカムが含まれることが明らかとなった（Asgari B，Zare R.，The genus Chaetomium in Iran，a phylogenic study including six new species.，Mycologia，2011，vol．103(4)，p．863-882参照）。
ケトミウム・フニコラとケトミウム・インディカムとでは子のう胞子の形態に違いは認められないが、頂毛（子のう殻孔口周辺の付属糸）の形態に大きな違いが認められる。具体的には、ケトミウム・フニコラは頂毛が部分的に剛毛もしくは枝分しているのに対してケトミウム・インディカムは頂毛が全て枝分している。さらには、β−チューブリン遺伝子の塩基配列の比較から分子系統的に別種と考えることが妥当である。従って、食品分野では事故事例報告のあるケトミウム・フニコラを選択的に検出することがより好ましい。
ケトミウム・フニコラとケトミウム・インディカムとでは子のう胞子の形態に違いは認められないが、頂毛（子のう殻孔口周辺の付属糸）の形態に大きな違いが認められる。具体的には、ケトミウム・フニコラは頂毛が部分的に剛毛もしくは枝分しているのに対してケトミウム・インディカムは頂毛が全て枝分している。さらには、β−チューブリン遺伝子の塩基配列の比較から分子系統的に別種と考えることが妥当である。従って、食品分野では事故事例報告のあるケトミウム・フニコラを選択的に検出することがより好ましい。
試験例２ ケトミウム・フニコラに特異的なβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の解析
上記の方法により決定したケトミウム属真菌各種や、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、ケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列（Cfu_F2：agttgtagccgaaacaaggacgtgt（配列番号１）、Cfu_R2：ttgccggaggcctgaagtaggg（配列番号２））を決定した。
上記の方法により決定したケトミウム属真菌各種や、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、ケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列（Cfu_F2：agttgtagccgaaacaaggacgtgt（配列番号１）、Cfu_R2：ttgccggaggcctgaagtaggg（配列番号２））を決定した。
実施例
（１）プライマーの設計
上記で決定したケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_F2プライマー）及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_R2プライマー）を設計し、シグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
（１）プライマーの設計
上記で決定したケトミウム・フニコラに特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_F2プライマー）及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Cfu_R2プライマー）を設計し、シグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちケトミウム・フニコラとその他のケトミウム属菌類、及び飲食品での事故事例で報告されている真菌等としては、表１〜４に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、千葉県立中央博物館が保管しCBM-FAナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが保管しIAMナンバーにより管理されている株、財団法人発酵研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び国立医薬品食品衛生研究所が保管しNIHSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて各菌の至適温度で７日間培養した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちケトミウム・フニコラとその他のケトミウム属菌類、及び飲食品での事故事例で報告されている真菌等としては、表１〜４に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、千葉県立中央博物館が保管しCBM-FAナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが保管しIAMナンバーにより管理されている株、財団法人発酵研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び国立医薬品食品衛生研究所が保管しNIHSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて各菌の至適温度で７日間培養した。
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。
（３）ケトミウム・フニコラの検出
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre Mix Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Cfu_F2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びCfu_R2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre Mix Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Cfu_F2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びCfu_R2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３５サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic Acid sample loading buffer ５×（BIO RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図３〜６に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図３は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図４は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図５は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図６は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ Load 100bp molecular Ruler（商品名、BIO RAD社製）を用いた。
その結果、ケトミウム・フニコラのゲノムＤＮＡを含む試料では、約300bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、ケトミウム・フニコラ以外のケトミウム属及び、その他食品の製造環境から広く検出される菌類のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、ケトミウム・フニコラを種レベルで特異的に検出することができる。
上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の存在を確認することができ、ケトミウム・フニコラを種レベルで特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、種レベルでより迅速かつより正確にケトミウム・フニコラを検出することが可能である。
Claims (9)
- 下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の種レベルでの検出を行う、ケトミウム・フニコラの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 検出を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いてケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、請求項１記載の検出方法。
- 前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、ケトミウム・フニコラの種レベルでの検出を行う、請求項２記載の検出方法。
- 前記ケトミウム・フニコラのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列 - 下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチドが核酸プライマーである、請求項５記載のオリゴヌクレオチド対。
- 前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項５又は６記載のオリゴヌクレオチド対。
（ｃ）配列番号３に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつケトミウム・フニコラの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列 - 前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｃ）及び／又は（ｄ）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、ケトミウム・フニコラを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項７記載のオリゴヌクレオチド対。
- 請求項５〜８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド対を含むケトミウム・フニコラ（Chaetomium funicola）検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012156860A JP5934043B2 (ja) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | ケトミウム・フニコラの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012156860A JP5934043B2 (ja) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | ケトミウム・フニコラの検出方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014018091A JP2014018091A (ja) | 2014-02-03 |
| JP2014018091A5 JP2014018091A5 (ja) | 2015-07-30 |
| JP5934043B2 true JP5934043B2 (ja) | 2016-06-15 |
Family
ID=50193697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012156860A Active JP5934043B2 (ja) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | ケトミウム・フニコラの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5934043B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5548345B2 (ja) * | 2008-05-29 | 2014-07-16 | 花王株式会社 | 耐熱性菌類の検出方法 |
| JP5548357B2 (ja) * | 2008-11-11 | 2014-07-16 | 花王株式会社 | アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法 |
-
2012
- 2012-07-12 JP JP2012156860A patent/JP5934043B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014018091A (ja) | 2014-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2009145279A1 (ja) | 耐熱性菌類の検出方法 | |
| KR20140007575A (ko) | 십자화과 흑부병원균의 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| JP5934038B2 (ja) | サーモアスカス属真菌の検出方法 | |
| JP5654265B2 (ja) | ビソクラミス属に属する菌類の検出方法 | |
| JP6200133B2 (ja) | ケトミウム・グロボーサム関連種群の検出方法 | |
| JP5562007B2 (ja) | ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）属に属する菌類の検出方法 | |
| JP5548388B2 (ja) | ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルスフミガタスの検出方法 | |
| JP5956389B2 (ja) | 耐熱性ペニシリウム属真菌の検出方法 | |
| JP5956265B2 (ja) | ケトミウム・グロボーサム・クレードの検出方法 | |
| JP5548387B2 (ja) | タラロマイセス属に属する菌類の検出方法 | |
| JP5934043B2 (ja) | ケトミウム・フニコラの検出方法 | |
| JP5548389B2 (ja) | ビソクラミス属に属する菌類の検出方法 | |
| JP5912425B2 (ja) | タラロマイセス属真菌の検出方法 | |
| JP5873356B2 (ja) | モニリエラ属真菌の検出方法 | |
| JP5548385B2 (ja) | 耐熱性菌類の検出方法 | |
| JP6200134B2 (ja) | ケトミウム・インディカム・クレードの検出方法 | |
| JP5697881B2 (ja) | パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 | |
| JP5548357B2 (ja) | アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法 | |
| JP5548386B2 (ja) | ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法 | |
| JP5820658B2 (ja) | ネオサルトリア属真菌の検出方法 | |
| JP5799139B2 (ja) | パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法 | |
| JP2015195774A (ja) | アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法 | |
| JP2015195773A (ja) | アスペルギルス・カーボナリウスの検出方法 | |
| JP5764619B2 (ja) | アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法 | |
| Harrison | Species-specific PCR primers for the rapid and reliable identification of yeast species |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20150511 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150610 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150610 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150610 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20151209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160222 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160412 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160506 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5934043 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |