JP5548386B2 - ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出方法 - Google Patents
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Description
また、クラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類は住環境や食品工場に広く分布する黒色カビであり、分生子が空気中に飛散することが知られている。クラドスポリウム属に属する菌類の菌体が加熱殺菌後の食品に接触すると増殖し腐敗事故を引き起こす。従って、クラドスポリウム属に属する菌類の迅速な検出方法の確立も求められている。
本発明者等は、この問題を克服し特定の耐熱性菌類を特異的に検出・識別しうる新たなDNA領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域(以下、「可変領域」ともいう)が存在することを見出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的かつ迅速に検出・識別できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
(g)配列番号5に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
また、本発明は、前記(g)又は(h)の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、ハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出用オリゴヌクレオチドに関するものである。
(a)配列番号1に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の(c)及び(d)で示されたハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
(c)配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、下記の(e)及び(f)で示されたハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対に関するものである。
(e)配列番号7に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、前述したオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類検出用のキットに関するものである。
本発明は、ハミゲラ属(Hamigera)に属する菌類又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列、すなわちハミゲラ属に属する菌類又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子領域中におけるハミゲラ属及び/又はクラドスポリウム属に特異的な領域又は種特異的領域(可変領域)の塩基配列で表される核酸を用いてハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の同定を行い、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・検出する方法である。
本発明における「ハミゲラ属に属する菌類」とは、マユハキタケ科(Trichocomaceae)に属する不整子嚢菌類を意味する。ハミゲラ属に属する菌類は、75℃、30分間の加熱処理後であっても生存可能な子のう胞子を形成する。ハミゲラ属に属する菌類の例として、ハミゲラ アベラネア(Hamigera avellanea)、ハミゲラ ストリアータ(Hamigera striata)が挙げられる。また、「クラドスポリウム属に属する菌類」は糸状不完全菌類であり、耐熱性の高い子のう胞子を形成しない。また、住環境や食品工場などに広く分布し、メラニン色素を合成するため、黒色汚れの原因菌である。クラドスポリウム属に属する菌類の例として、クラドスポリウム クラドスポロイデス(Cladosporium cladosporioides)、クラドスポリウム スファエロスファーマム(Cladosporium sphaerospermum)が挙げられる。
(g)配列番号5に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列
発明者らは、ハミゲラ属に属する菌類、クラドスポリウム属に属する菌類及びハミゲラ属に属する菌類に近縁な菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、ハミゲラ属と近縁な属とハミゲラ属との間、ハミゲラ属内、及びクラドスポリウム属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン遺伝子配列の相同性解析をおこなった。その結果、当該配列中にハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類は固有の塩基配列を有しているため、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を識別・同定することが可能となる。本発明は、この可変領域及び可変領域に由来する核酸、オリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。
配列番号6に記載の塩基配列及びその相補配列は、クラドスポリウム クラドスポロイデスから単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。当該配列はクラドスポリウム属に属する菌類に特異的であり、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、クラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号6に記載の塩基配列若しくはその相補配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できる塩基配列で表される核酸を用いても、同様にクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に識別・同定することが可能である。これらの塩基配列で表される核酸は、特にクラドスポリウム クラドスポロイデスを検出するために好適に用いられる。
以下、前記(g)及び(h)の塩基配列を「本発明の可変領域の塩基配列」ともいう。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているRNA又はDNAシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものであればよい。すなわち、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば後述の条件が挙げられる。
上記(1)において「ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が10塩基前後連続して現れる領域」とは、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の中でも、異なる属間での塩基配列の保存性が特に低く(すなわち、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の特異性が特に高く)、10塩基前後にわたってハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の塩基配列が連続して現れる領域を意味する。
また、上記(3)において「オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い」とは、プライマーの塩基配列からプライマー同士が結合しないことが予想されることを言う。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数としては、特に限定されないが、13塩基〜30塩基であることが好ましく、18塩基〜23塩基であることがより好ましい。ハイブリダイズ時のオリゴヌクレオチドのTm値は、55℃〜65℃の範囲内であることが好ましく、59℃〜62℃の範囲内であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドのGC含量は、30%〜80%が好ましく、45%〜65%がより好ましく、55%前後であることが最も好ましい。
(a)配列番号1に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、ハミゲラ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチドとしては、前記(c)〜(f)のいずれかのオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。
また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドには、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものであれば、配列番号1〜4又は7〜8のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに対し、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号1〜4又は7〜8のいずれかに記載の塩基配列に対し、塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾が施された塩基配列からなオリゴヌクレオチドには、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとしてハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類の検出に使用できるものや、ストリンジェントな条件でハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能な塩基配列も包含される。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられ、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M 塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。そのような塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、配列番号1〜4又は7〜8のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドにおいて1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1〜2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾されたオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号1〜4又は7〜8のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
また、前記(d)、(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチドは、ハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子の可変領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、前記ハミゲラ属に属する菌類を特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。
前記(a)及び(b)で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号5に記載の塩基配列のうち、それぞれ358位から377位まで、440位から459位までの領域に対応する。また、図1に示すように、ハミゲラ アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の358位から377位まで及び440位から459位までの領域と相同性の高い領域がクラドスポリウム クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子にも存在する。
前記(c)及び(d)で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号5に記載の塩基配列のうち、それぞれ2位から22位まで、181位から200位までの領域に対応する。また、前記(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号5に記載の塩基配列のうち、それぞれ172位から191位まで、397位から416位までの領域に対応する。また、ハミゲラ アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の2位から22位までの領域と相同性の高い領域がクラドスポリウム クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子にも存在する。したがって、前記(a)、(b)、及び(c)で示されたオリゴヌクレオチドをハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出することができる。また、前記(d)、(e)、及び(f)で示されたオリゴヌクレオチドをハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
(a1)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b1)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(c1)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d1)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e1)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f1)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して70%以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明のハミゲラ属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対は、前記(c)のオリゴヌクレオチドと前記(d)のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対、又は前記(e)のオリゴヌクレオチドと前記(f)のオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド対である。前記(c)及び(d)で示されたオリゴヌクレオチド対又は前記(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチド対を用いることで、ハミゲラ アベラネア、ハミゲラ ストリアータを特異的に検出することができる。
上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
このようにして標識化された本発明の検出用オリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類を検出することができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、前述した条件を挙げることができる。また、核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法(FISH法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等)を用いることができる。
なかでも、前記(g)又は(h)の塩基配列で表される核酸中の領域であって、(1)ハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類に固有の遺伝子の塩基配列が10塩基前後連続して現れる領域を含む、(2)オリゴヌクレオチドのGC含量がおよそ30%〜80%となる、(3)オリゴヌクレオチドの自己アニールの可能性が低い、(4)オリゴヌクレオチドのTm値がおよそ55℃〜65℃となる、の4つの条件を満たす領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましい。さらに、前記(a)〜(f)のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることが好ましく、前記(a1)〜(f1)のいずれかの検出用オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることがより好ましく、配列番号1〜4及び7〜8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。また、前記(a)及び(b)で示されたオリゴヌクレオチド対、前記(c)及び(d)で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることが好ましく、前記(a1)及び(b1)で示されたオリゴヌクレオチド対、前記(c1)及び(d1)で示されたオリゴヌクレオチド対、又は前記(e1)及び(f1)で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがより好ましく、配列番号1及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、配列番号3及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対、又は配列番号7及び配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。
特に、検出感度の点からは、前記(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのが好ましく、前記(e1)及び(f1)で示されたオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いるのがより好ましく、配列番号7及び配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマー対として用いることがさらに好ましい。
本発明の核酸プライマーは、前記オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとして用いることもできるし、前記オリゴヌクレオチドを標識物で標識化して核酸プライマーとして用いることができる。標識物及び標識方法の例としては、核酸プローブの場合と同様のものが挙げられる。
遺伝子増幅の確認について、前記(a)及び(b)で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた場合、配列番号5に記載の塩基配列において、358位から459位までの塩基数は約100塩基である。したがって、被検体にハミゲラ属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム属に属する菌類が含まれる場合、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してPCR反応を行い、得られたPCR反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約100bpのDNA断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を検出することができる。
特に、検出感度の点からは、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記(e)及び(f)で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることが好ましく、前記(a1)及び(b1)のオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、前記(e1)及び(f1)で示されたオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがより好ましく、配列番号1及び2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法と、配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いた検出方法とを組合わせて用いることがさらに好ましい。
被検体からDNAを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度及び量のDNAが得られるのであれば特に制限されず、通常の方法や市販の調製用キットを用いることができる。また、被検体中のRNAを逆転写して得られるDNAを用いることもできる。
1.βチューブリン部分長の塩基配列決定
下記の方法によりハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にてハミゲラ アベラネアは30℃、クラドスポリウム クラドスポロイデスは25℃で7日間、暗所培養した。菌体からGenとるくんTM(タカラバイオ(株)社製)を使用し、DNAを抽出した。目的とする部位のPCR増幅は、PuRe TaqTM Ready-To-Go PCR Beads(GE Health Care UK LTD製)を用いて、プライマーとしてBt2a(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’:配列番号9)、Bt2b(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’:配列番号10)(Glass and Donaldson,Appl Environ Microbiol 61:1323−1330,1995)を使用した。増幅条件は、βチューブリン部分長は変性温度95℃、アニーリング温度59℃、伸長温度72℃、35サイクルで実施した。PCR産物は、Auto SegTM G−50(Amersham Pharmacia Biotech社製)を使用し精製した。PCR産物は、BigDye terminator Ver. 1.1(商品名:Applied Biosystems社製)を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー“ATGC Ver.4”(Genetyx社製)を使用した。
シークエンシング法により決定したハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報及び、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、DNA解析ソフトウエア(商品名:DNAsis pro、日立ソフトウエア社製)を用いてアライメント解析を行い、ハミゲラ属に属するハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスに特異的な塩基配列を含有するβ−チューブリン遺伝子の中の特定領域(配列番号5及び6)を決定した。
(1)プライマーの設計
上記で得られたハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスに特異的な塩基配列領域のうち、3’末端側で両菌の保存性が特に高い領域から、1)属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、2)GC含量が概ね30%〜80%となる、3)自己アニールの可能性が低い、4)Tm値が概ね55〜65℃程度となる、の4つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして5組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したDNAを鋳型として用いてPCR反応によるハミゲラ属とクラドスポリウム クラドスポロイデスの一括検出の有効性を検討した。すなわち、ハミゲラ属及びクラドスポリウム クラドスポロイデスのDNAを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにDNA増幅反応が認められ、その他のカビのゲノムDNAを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、1対のプライマー対でハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスで特異的にDNA増幅が認められ、その他のカビのゲノムDNAを鋳型とした反応では増幅産物が認められなかった。この結果より、ハミゲラ属とクラドスポリウム クラドスポロイデスの一括検出が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号1及び2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表1に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやTナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて指摘温度、すなわち一般カビは25℃、耐熱性カビは30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号1に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)98℃、10秒間の熱変性反応、(ii)63℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを30サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から10μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図2に示す。図中の番号は表1記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムDNAを含む試料(1レーン)では、100bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類のゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類を特異的に検出することができる。
(2−1) ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類の検出
(a)プライマー
実施例1で設計した、配列番号1及び2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類としては、表2に記載のハミゲラ アベラネア(Hamigera avellanea)及びクラドスポリウム クラドスポリオイデス(Cladosporium cladosporioides)を使用した。前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を示すために、表2に示すその他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーやTナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。なお、ポジティブコントロールとして、Hamigera avellanea(菌株名:T34)を鋳型DNAとして用いた。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて至適温度、すなわち一般カビは25℃、耐熱性カビ及びアスペルギルス フミガタスは30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(商品名 PrepMan ultra、アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号1に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)97℃、10秒間の熱変性反応、(ii)63℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを30サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図3に示す。図中の番号は表2記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のゲノムDNAを含む試料では、100bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類のいずれのゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ハミゲラ属に属する菌類及びクラドスポリウム属に属する菌類を特異的に検出することができる。
(a)プライマーの設計
配列番号5及び6記載のハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスを含めたその他のカビのβ‐チューブリン塩基配列領域のアライメント解析(DNAsis Pro)を行い、有意な塩基配差の存在する部位を特定した。その部位の中で、3’末端側でハミゲラ アベラネアの特異性が特に高い領域から、1)属固有の塩基配列が数塩基前後存在している、2)GC含量が概ね30%〜80%となる、3)自己アニールの可能性が低い、4)Tm値が概ね55〜65℃程度となる、の4つの条件を満たす部分領域の検討を行った。この塩基配列を基にして7組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したDNAを鋳型として用いてPCR反応によるハミゲラ属とクラドスポリウム クラドスポロイデスの識別法の有効性を検討した。すなわち、ハミゲラ属のDNAを鋳型とした反応では設計したプライマー対から予想されるサイズにDNA増幅反応が認められ、その他のカビDNAを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、2対のプライマー対でハミゲラ アベラネアを含むハミゲラ属で特異的にDNA増幅が認められ、その他のカビのゲノムDNAを鋳型とした反応では増幅産物が認めらかった。この結果より、ハミゲラ属とクラドスポリウム クラドスポロイデスの識別が可能であることを確認した。有効性が確認できたプライマー対は、配列番号3及び4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対及び配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちハミゲラ属とその他の耐熱性カビ及び一般カビとしては、表3に記載の菌を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いて至適温度、すなわち一般カビは25℃、耐熱性カビは30℃で7日間培養した。
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムDNA調製用キット(商品名 PrepMan ultra、アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したハミゲラ アベラネア及びクラドスポリウム クラドスポロイデスのゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号3に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)97℃、10秒間の熱変性反応、(ii)60℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを30サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図4に示す。図中の番号は表3記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果、ハミゲラ属に属する菌類に属する菌類のゲノムDNAを含む試料(試料番号1〜3)では、200bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、クラドスポリウム属に属する菌類のゲノムDNAを含む試料(試料番号17)及びその他のハミゲラ属に属する菌類のゲノムDNAを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明の(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドを用いることによって、試料に含まれる菌類がハミゲラ属に属する菌類であるかクラドスポリウム属に属する菌類であるかを識別することができる。
(a)プライマー
実施例2で設計した、配列番号3,4,7,8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
前記(c)〜(f)のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図5に示すハミゲラ ストリアータ(Hamigera striata)の各菌株を使用した。
各菌体を実施例1と同様に培養した。
実施例1と同様の方法で、ゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号3に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号7に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号8に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlに変更した以外は上記と同様にしてPCR反応溶液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)61〜59℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から4μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図5に示す。
その結果、配列番号3及び4に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ ストリアータの全ての菌株において、特異的な増幅DNA断片が確認された(9〜16レーン)。また、配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系の方が、検出されたバンドがより鮮明であった(9〜12レーン)。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
(a)プライマー
実施例2で設計した、配列番号3,4,7,8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
前記(c)〜(f)のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に属する菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する特異性を確認するために、ハミゲラ属に属する菌類として、図6に示すハミゲラ アベラネア(Hamigera avellanea)の各菌株を使用した。
各菌体を実施例1と同様に培養した。
実施例1と同様の方法で、ゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号3に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号7に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号8に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlに変更した以外は上記と同様にしてPCR反応溶液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図6に示す。
その結果、配列番号3及び4に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系及び配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系のいずれにおいても、使用したハミゲラ アベラネアの全ての菌株において、特異的な増幅DNA断片が確認された(各1〜8レーン)。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、菌株の種類に左右されることなくハミゲラ属に属する菌類を高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
(a)プライマー
実施例2で設計した、配列番号3,4,7,8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用した。
前記(c)〜(f)のオリゴヌクレオチドのハミゲラ属に対する特異性を確認するために、耐熱性菌類の1種であってハミゲラ属に近縁なビソクラミス属に属する菌類として、図7及び図8に示すビソクラミス ニベア及びビソクラミス フルバの各菌株を使用した。なお、これらの菌類は独立行政法人製品製品評価技術基盤機構によりNBRC番号で管理されているもの及びThe Centraalbureau voor SchimmelculturesによりCBS番号で管理されているもの等を入手し、使用した。
各菌体を実施例1と同様に培養した。
実施例1と同様の方法で、ゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は50ng/μlに調製した。
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μl、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μl、無菌蒸留水10μlを混合し、配列番号3或に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlを加え、25μlのPCR反応液を調製した。同様に、プライマーを配列番号7に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μl及び配列番号8に記載の塩基配列で表されるプライマー(20pmol/μl)0.5μlに変更した以外は上記と同様にしてPCR反応溶液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、及び(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
PCR反応後、PCR反応液から2μlを分取し、2%アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図7及び図8に示す。
その結果、配列番号3及び4に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系ではポジティブコントロールのハミゲラ アベラネア以外にもビソクラミス フルバの一部の菌株NBRC31877株及びNBRC31878株(レーン9、10)で200bpのサイズに遺伝子増幅が認められたものの、他のビソクラミス属に属する菌類に関しては遺伝子増幅が認められなかった。なお、NBRC31877株及び31878株で遺伝子増幅が認められた理由は、これらの株が他の株と比較して遺伝学的にハミゲラ属に近縁であるためと推測される。
一方、配列番号7及び8に記載の塩基配列で表されるプライマーを用いた反応系では、ビソクラミス フルバNBRC31877株及びNBRC31878株では遺伝子増幅が認められなかった。したがって、配列番号7及び8に記載のオリゴヌクレオチドを用いることによって、ビソクラミス属に属する菌類を検出せずハミゲラ属に属する菌類のみを高い精度で特異的に検出することができることがわかる。
Claims (12)
- 下記(a)〜(f)のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも1種を核酸プライマーとして用いてハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の同定を行うことを特徴とするハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出方法。
(a)配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 同定を行うために、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いて遺伝子増幅反応を行い、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項1記載のハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出方法。
- 同定を行うために、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド並びに/又は前記(e)及び(f)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いて遺伝子増幅反応を行い、増幅産物の有無を確認することを特徴とする請求項1記載のハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類の検出方法。
- 前記検出方法において、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド並びに/又は前記(e)及び(f)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマー対として用いて菌種を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項2記載の検出方法。
- 前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって行うことを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項記載のハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出方法。
- 下記(a’)及び(b’)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とする、ハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及びクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出方法。
(a’)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b’)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 下記(c’)及び(d’)のオリゴヌクレオチド並びに/又は下記(e’)及び(f’)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いることを特徴とする、ハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類の検出方法。
(c’)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d’)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e’)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f’)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 前記検出方法において、下記(c’)及び(d’)のオリゴヌクレオチド並びに/又は下記(e’)及び(f’)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて菌種を検出する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項6に記載の検出方法。
(c’)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d’)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e’)配列番号7に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f’)配列番号8に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 下記(a)〜(f)のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる、ハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類の検出用核酸プライマー。
(a)配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 下記の(a)及び(b)で示されたハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及びクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対。
(a)配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 下記の(c)及び(d)又は下記の(e)及び(f)で示されたハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類検出用オリゴヌクレオチド対。
(c)配列番号3に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド - 下記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対、下記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド、及び下記(e)及び(f)のオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも1つを核酸プライマー対として含むハミゲラ(Hamigera)属に属する菌類及び/又はクラドスポリウム(Cladosporium)属に属する菌類検出用キット。
(a)配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号7に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号8に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において1個の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列であってかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
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