JP5002817B2 - コクシジオイデス症病原体検出のためのプライマー - Google Patents
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Description
(1)配列番号1に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
(2)配列番号2に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
(3)配列番号3に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー。
(5)配列番号5に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
(6)配列番号6に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー。
(8)配列番号2に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号5に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
(10)配列番号7に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号8に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
経験上、診断プライマーの構築は、リボソームRNAの保存された酵素をコードする塩基配列に基づいている。しかし、本発明では以下に示す新たな戦略を採用して、診断PCRのための領域を選択した。
C. immitisゲノム配列のテキストファイルを入手した(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/coccidioides_immitis/)。240−720bp長に対応する塩基配列をゲノムデータベースファイルからランダムに選択した。ランダムに選択した領域を増幅するための20merのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計した。
これらの2種のプライマーがCoccidioides属由来の予想されるサイズのDNA断片を増幅できるかどうかを調べた。
工程2でCoccidioidesのDNAを増幅できたプライマーについて、Candida albicans及びAspergillus fumigatus DNAからDNAを増幅することができないかどうかを試験した。
本明細書の実施例では、配列番号7に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号8に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせて用いてPCRを行うことにより、コクシジオイデス属真菌の検出、並びにCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別することに成功した。
配列番号1、配列番号2又は配列番号3に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのフォワードプライマー;及び
配列番号4、配列番号5又は配列番号6に記載の塩基配列のうちの連続する15から30塩基の塩基配列に相補的な塩基配列からなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのリバースプライマー:
上記したように、本発明のプライマーは標識して使用することもできる。このような標識されたプライマーは全て本発明の範囲内に属する。
本発明のプライマーを用いたプライマーセットはキットとして供給することにより、コクシジオイデス属真菌の検出、並びにCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別を簡便に行うことができる。本発明のコクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキットは、本発明のプライマー(又はその標識プライマー)を含むものである。また、本発明のキット中には、PCR用試薬、電気泳動試薬、DNA抽出用試薬などを含めておくことにより、試料中のコクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別をより迅速・簡便・高感度に行うことができる。なおキット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。
本発明のプライマーを用いてコクシジオイデス属真菌を検出する方法としては、本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてDNAポリメラーゼによりDNA鎖の伸長反応を行うことによりコクシジオイデス属真菌のDNAの一部を増幅して検出する方法が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてPCRを行うことにより、コクシジオイデス属真菌のDNAを特異的に増幅し、これによりコクシジオイデス属真菌を検出することができる。
(1)材料及び方法
(i)菌株及びDNAの単離
本実施例で使用した19種のCoccidioides株を表1に示す。
本実施例で設計したプライマーは、
Coi9-1F:5'-TACGGTGTAATCCCGATACA-3'(配列番号7)
Coi9-1R:5'-GGTCTGAATGATCTGACGCA-3'(配列番号8)
である。PCR反応液の組成は以下の通りである。
(i)Coccidioides属の特異的検出
選択したプライマーセットは、C. immitis由来の720bpの産物を増幅するように構築されている。5種のC. immitis及び14種のC. posadasiiについてプライマーを用いて試験した(表1)。Coi9-1F及びCoi9-1Rと命名したプライマーを用いたPCR系により、C. immitisのDNAから予測されるサイズのDNA断片を増幅することができた(図1)。特異性試験のために、49種の菌の125株について試験した(表2)。上記プライマーを用いた場合、これらの株からバンドは検出されなかった。これらの菌からのDNAを用いたPCRの結果、本発明のプライマーは、主要な病原菌及びArthrographis kalrae, Chrysosporium spp., Geotrichum candidum, Malbranchea spp., Paracoccidioides brasiliensis, 及びTrichosporon asahiiなどの関連菌については交差増幅しないことが示された。
日本で入手可能な全てのCoccidioides属のDNAについて本発明のプライマーを試験した場合、意外なことに、DNA断片の移動度に2つの異なるパターンが見られた(図1)。C. posadasiiから増幅したDNA断片は、C. immitisから増幅したものより明らかに短く、C. immitis由来のDNA断片は予想通りの長さであった。増幅DNA断片の塩基配列の分析の結果、C. posadasii由来のアンプリコンは86bpの欠失を有していることが判明した(図2)。以上の結果より、従来は困難であった分類学上非常に近い2菌種であるC. immitisとC. posadasiiとの識別が可能になった。特に、本発明のプライマーを用いたPCRによれば、1回のPCRとアガロースゲル電気泳動により上記2菌種を容易に識別することができるので、簡便な操作でハイスループットな取り扱いが可能である。
(1)方法
Invitrogen社にて下記のプライマーを合成した。
87FU (5'- CATCCAGAGAGCAAACATCCAAA)(配列番号10)(配列番号9の265から288塩基の配列を参照。ただし、2番目のAはなし)。
166RL (5'-CACTTTGCGGCTAGTCAACGAAAGT*G)(配列番号11)(配列番号9の453から472塩基の配列を参照)(3’側から2塩基目のTを蛍光色素FAM (6-carboxy-fluorescein)で修飾した。また、下線は、ヘアピンループを形成させるために付加した配列を示す)。
サンプルDNA 1μl
Takara ExTaq 0.1μl
87FU (100 pmol/μl) 0.04μl
166RL (100 pmol/μl) 0.04μl
ROX dye 0.4μl
Takara LATaqBuffer (Mg plus) 2 μl
dNTP (2.5 mM each) 1.6μl
水 14.82 μl
計 20 μl
(i)増幅の確認
図3に示すように、加えた鋳型DNAのコピー数の対数(Y軸)に比例した増幅が確認できた。また、上記の表1に示す19種類のCoccidioides属のDNAに対し、全ての増幅を確認した。
融解曲線解析は、プライマーダイマーのアーティファクトやコンタミネーションの有無をチェックし、反応の特異性と定量の正確さを確認するための、簡単で直接的な方法である。蛍光分子を含んだ二本鎖DNAの増幅産物に対して、徐々に温度を上げると、ある温度に達したときに二本鎖から一本鎖に融解し、蛍光強度が弱まる。その蛍光強度のプロットの微分曲線のピーク温度は、増幅したDNAの長さや塩基配列によって決定される。
Claims (6)
- 配列番号7に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号8に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。
- 請求項1に記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のDNA断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。
- 配列番号10に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号11に記載の塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせからなる、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのプライマーセット。
- 請求項4に記載のプライマーセットを含む、コクシジオイデス属真菌の検出又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiの識別のためのキット。
- 請求項4に記載のプライマーセットを用いて、コクシジオイデス属真菌のDNA断片を増幅することを含む、コクシジオイデス属真菌を検出する方法、又はCoccidioides immitis およびCoccidioides posadasiiを識別する方法。
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