CN110499374B - 一种检测肺炎克雷伯菌的三重pcr引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测肺炎克雷伯菌的三重pcr引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测肺炎克雷伯菌的三重PCR引物组、试剂盒及应用。本发明针对肺炎克雷伯氏菌中编码荚膜血清型K2、rmpA(粘液表型调节基因A)、菌素基因，分别设计针对荚膜血清型K2基因片段的特异性引物SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、针对rmpA基因片段的特异性引物SEQ ID No.3/SEQ ID No.4和针对菌素基因片段的特异性引物SEQ ID No.5/SEQ ID No.6。最终建立了检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR方法，本发明方法具有特异性更强、敏感性高的优点，可以快速准确地进行肺炎克雷伯氏菌的检测。

Description

一种检测肺炎克雷伯菌的三重PCR引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种快速检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR引物组、试剂盒及应用，属于细菌分子生物学领域。
背景技术
肺炎克雷伯菌，是一种可引起多种动物患病的条件性致病菌，也是常见的人兽共患病病原。属于肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧型，有丰富的荚膜，在自然界中人和动物的体内普遍存在，寄生于人和动物的呼吸道、消化道和泌尿生殖道以及鼻咽部、皮肤、肠道等处。一般情况下，该菌不会导致动物发病，然而当机体的抵抗力下降或者菌大量增殖时，就会引起动物的发病甚至导致暴发性流行。但近年来，肺炎克雷伯氏菌对水貂养殖业的危害越来越严重，主要导致水貂发生肺炎、子宫炎、乳腺炎及其它化脓性炎症，发病率呈上升趋势，造成了很大的经济损失。
目前，国内外用来检测肺炎克雷伯菌的手段有很多，细菌分离培养是检测肺炎克雷伯菌的常用方法，但易造成环境污染，同时对人类的健康造成潜在的威胁；血清学检测也是检测该菌常用的方法，但检测结果只有统计学意义，不能确诊，且灵敏度不高。PCR技术能将微量的DNA大幅增加，特异性好、敏感度高、简单快速，而且对纯度要求低，近年来受到普遍关注，已被广泛应用于细菌等病原微生物的检测，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病原微生物标本的快速检测。有关于PCR技术应用于克雷伯氏菌血清型和毒力基因检测的文献报道很少，即便是有也基本上局限于采用常规PCR技术检测克雷伯菌的其中1～2种基因。
传统的克雷伯菌检测方法已经不能满足对克雷伯菌检测的高效、精准的需求，因此需要更方便、快捷高效的检测方法。本研究建立了快速检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2基因、RmpA基因、菌素基因的三重PCR方法，为肺炎克雷伯氏菌的快速鉴定和鉴别提供了一种更有效的检测方法。本研究所建立的三重PCR法，其特异性更高，可同时检测肺炎克雷伯菌的荚膜三种基因，更加节约试剂，同时减少对于废物处理的成本以及降低实验人员的工作量。
发明内容
本发明针对肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因，设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR方法，特异性更强、敏感性高，可以快速准确地进行肺炎克雷伯氏菌的检测。
因此，本发明第一个目的在于提供一种检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR引物组。
本发明另一个目的是提供一种含上述引物组的PCR试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种快速检测肺炎克雷伯菌的PCR方法。
具体地，本发明的技术方案如下：一种检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR引物组，包括下列三对引物：
引物对1：
SEQ ID No.1：5’-ACAGCCTCTCCTTCGGCTT-3’，
SEQ ID No.2：5’-TAGCGACTTGGTCCCAACAGT-3’；
引物对1用于扩增K2基因；
引物对2：
SEQ ID No.3：5’-ACTGGGCTACCTCTGCTTCA-3’，
SEQ ID No.4：5’-CTTGCATGAGCCATCTTTCATCA-3’；
引物对2用于扩增rmpA基因；
引物对3：
SEQ ID No.5:5’-ACATCGATGAACACGAGCGC-3’，
SEQ ID No.6：5’-TGCGTGACGAGCGGCTATT-3’；
引物对3用于扩增菌素基因。
本发明还提供一种检测肺炎克雷伯菌的PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组，还包括Taq酶、PCRbuffer、dNTPs。
本发明提供的一种快速检测肺炎克雷伯菌荚膜血清型K2、RmpA、菌素基因的三重PCR方法，包括以下步骤：
A、提取待测组织总DNA，作为模板；
B、三重PCR反应：将权利要求1所述三重PCR引物组SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物等比例混合加入PCR反应体系中，进行PCR反应；
C、对步骤B得到的PCR产物进行电泳检测，即可判断待测肺炎克雷伯菌是否为强毒力菌株。
具体地，步骤如下：
A、提取待测组织总DNA，作为模板；通过对参考GenBank上已发表的克雷伯菌序列进行比对，选择克雷伯氏菌中编码荚膜血清型K2、rmpA(粘液表型调节基因A)、菌素基因，分别设计针对荚膜血清型K2基因片段的特异性引物SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、针对rmpA基因片段的特异性引物SEQ ID No.3/SEQ ID No.4和针对菌素基因片段的特异性引物SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6。
扩增片段大小分别为903bp、535bp、188bp，所用引物均以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmoL/μL的浓度备用。
B、以肺炎克雷伯氏菌DNA为模板进行PCR反应。反应体系为：16.3μL ddH2O(Rnasefree)，2.5μL Buffer，2μL dNTPs(10.0mM)，引物SEQ ID No.1/SEQ ID No.2各0.5μL；引物SEQ ID No.3/SEQ ID No.4各0.5μL，引物SEQ ID No.5/SEQ ID No.6各0.5μL，1μl DNA模板，0.2μL Taq酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃40s，72℃50s，30个循环；72℃10min，4℃保存。
C、对步骤B得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
如果同时扩增出了903bp、535bp和188bp的产物，则肺炎克雷伯菌强毒力菌株阳性；如果未同时扩增出903bp、535bp和188bp的产物，则肺炎克雷伯菌强毒力菌株阴性。
本发明具有如下有益效果：
本发明的三重PCR方法最低可检测到102个拷贝肺炎克雷伯菌的DNA，表明本方法具有很高的灵敏性。
用建立的三重PCR方法对威海、菏泽、诸城等地32貂场送检的61只肺炎克雷伯菌分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与细菌分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的三重PCR方法适合于肺炎克雷伯菌病的快速检测。
附图说明
图1.本发明三对引物单重PCR的特异性检测结果。
M，DNAMarker DL2000；1-4为用引物对SEQ ID No.1/SEQ ID No.2分别扩增，1.肺炎克雷伯菌2.双球菌3.绿脓杆菌4.健康水貂肺脏组织结果；5-8为用引物对SEQ ID No.3/SEQ ID No.4分别扩增5.肺炎克雷伯菌6.双球菌7.绿脓杆菌8.健康水貂肺脏组织结果；9-12为用引物对SEQ ID No.5/SEQ ID No.6分别扩增9.肺炎克雷伯菌10.双球菌11.绿脓杆菌12.健康水貂肺脏组织结果。
图2.本发明三对引物三重PCR的特异性检测结果。
M，DNAMarker DL2000；1.用引物对SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、SEQ ID No.3/SEQID No.4及SEQ ID No.5/SEQ ID No.6三重PCR扩增肺炎克雷伯菌；2.用引物对SEQ IDNo.1/SEQ ID No.2扩增肺炎克雷伯菌；3.用引物对SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增肺炎克雷伯菌；4.用引物对SEQ ID No.5/SEQ ID No.6扩增肺炎克雷伯菌；5-11为用引物对SEQ IDNo.1/SEQ ID No.2、SEQ ID No.3/SEQ ID No.4及SEQ ID No.5/SEQ ID No.6三重PCR分别扩增，5.双球菌，6.绿脓杆菌，7.巴氏杆菌，8.大肠杆菌9.犬瘟热病毒，10.貂细小病毒，11.健康水貂肺脏组织。
图3.三重PCR针对肺炎克雷伯菌感染水貂肺脏总DNA的敏感性检测结果。
图3A为三重PCR，图3B-3D分别为用SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、SEQ ID No.3/SEQID No.4及SEQ ID No.5/SEQ ID No.6单重PCR；图中M，DNAMarker DL2000；1-7表示所提组织病料模板DNA的浓度对应组织病料的量分别是，1.1mg/μL，2.100ng/μL，3.10ng/μL，4.1ng/μL，5.100pg/μL，6.10pg/μL，7.1pg/μL。
图4.三重PCR针对肺炎克雷伯菌的DNA模板的敏感性检测结果。
M，DNAMarker DL2000；M，DL1000；1-11，分别为1010-100拷贝的肺炎克雷伯菌的DNA模板。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所述方法或试剂，除非特别说明，所述方法均为本领域常用方法，所述试剂均可以从商业途径获得。
实施例一、
1、引物设计
通过对参考GenBank上已发表的克雷伯菌序列进行比对，选择克雷伯氏菌中编码荚膜血清型K2、rmpA、菌素基因，分别设计针对荚膜血清型K2基因片段的特异性引物SEQ IDNo.1/SEQ ID No.2、针对rmpA基因片段的特异性引物SEQ ID No.3/SEQ ID No.4和针对菌素基因片段的特异性引物SEQ ID No.5/SEQ ID No.6。
其中针对荚膜血清型K2的特异性引物为：
SEQ ID No.1：5’-ACAGCCTCTCCTTCGGCTT-3’
SEQ ID No.2：5’-TAGCGACTTGGTCCCAACAGT-3’；
针对rmpA基因片段的特异性引物为：
SEQ ID No.3：5’-ACTGGGCTACCTCTGCTTCA-3’
SEQ ID No.4：5’-CTTGCATGAGCCATCTTTCATCA-3’；
针对菌素基因片段的特异性引物为：
SEQ ID No.5:5’-ACATCGATGAACACGAGCGC-3’
SEQ ID No.6：5’-TGCGTGACGAGCGGCTATT-3’
扩增片段大小分别为903bp、535bp、188bp，利用常规方法对细菌样品进行扩增，所有引物以无菌ddH2O(Rnase free)配成20pmoL/μL的浓度备用。
2、细菌培养和DNA的提取
取1株实验室分离保存的肺炎克雷伯菌，在普通营养琼脂平板上用三段划线的方法划线培养，37℃培养20h左右，用接种环蘸取单个菌落，置于LB液体培养基中培养。在摇床上震荡培养12小时左右。
用裂解法制备DNA模板：取培养的1mL肺炎克雷伯新鲜菌液于1.5mL离心管中，8000r/4min，离心，弃上清，加入50～100μLddH2O，放入沸水浴中，经100℃10min后，8000×g离心4min，取上清作为PCR扩增模板，-20℃保存。
3、单重PCR反应体系的建立
(1)单重PCR：反应总体系为25μL，包括18.3μL ddH2O(Rnase free)，2.5μL10×PCRBuffer，2.0μL dNTPs(10.0mM)，荚膜血清型K2或rmpA基因或菌素基因上下游引物各0.5μL，1.0μLDNA模板，0.2μLTaq酶。或者反应总体系为25μL，包括9.5μLddH2O(Rnase free)，12.5μLMix，荚膜血清型K2或毒力基因rmpA或菌素上下游引物各1.0μL，1.0μL DNA模板。
PCR反应程序均为：94℃5min；94℃30s，60℃40s，72℃45s，30个循环；72℃10min，4℃保存。
(2)分别用引物SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、SEQ ID No.3/SEQ ID No.4及SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6，分别扩增克雷伯菌、绿脓杆菌、双球菌、健康水貂肺脏组织；采用上述(1)的体系和条件进行单重PCR扩增，以检测引物的特异性。
(3)PCR产物的鉴定：
制备琼脂糖凝胶：量取100mL1×TAE(2ml50×TAE与98mL去离子水充分混合制备)，称取百分之一(1g)的琼脂糖，加到其中，放在微波炉中加热3min左右直至彻底融化，中间拿出摇晃几次防止凝固，待温度降至55℃左右至液体澄清，然后拿出放入万分之一的核酸染料(8～10ul)，迅速摇晃，液体均匀后倒板，插上梳子，等待半个小时左右冷却，待胶凝固后上样。
将PCR产物与DNA电泳上样缓冲液混合，在1％浓度的琼脂糖凝胶中，以7～10V/cm电压在1×TAE中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相。
结果表明，引物对SEQ ID No.1/SEQ ID No.2只能扩增出克雷伯菌的荚膜血清型K2基因片段，PCR产物大小为903bp，而对其他模板扩增阴性；引物对SEQ ID No.3/SEQ IDNo.4只能扩增出克雷伯氏菌的rmpA基因片段，PCR产物大小为535bp，而对其他模板扩增阴性；引物对SEQ ID No.5/SEQ ID No.6只能扩增出克雷伯菌的菌素基因片段，PCR产物大小为188bp，而对其他模板扩增阴性(见图1)。结果表明，本发明引物对SEQ ID No.1/SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3/SEQ ID No.4及SEQ ID No.5/SEQ ID No.6具有很强的特异性，只能分别针对克雷伯菌相应基因进行特异性扩增。
4、多重PCR反应体系的建立
在单重PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到三重PCR最佳反应体系和反应程序。
三重PCR：以肺炎克雷伯氏菌DNA为模板，反应总体积为25μL，最佳反应体系为：16.3μL ddH2O(Rnase free)，2.5μL 10×PCR Buffer，2.0μL dNTPMixture(10.0mM)，血清型K2基因引物K2-F/K2-R各0.5μL，RmpA基因引物RmpA-F/RmpA-R各0.5μL，菌素基因引物Aer-F/Aer-R各0.5μL，1.0μLDNA模板，0.2μL Taq酶。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，60℃40s，72℃50s，30个循环；72℃10min，4℃保存。
依照前述步骤制备琼脂糖凝胶，将PCR产物与DNA电泳上样缓冲液混合，在1％浓度的琼脂糖凝胶中，以7～10V/cm电压在1×TAE中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相。(如图2)
5、特异性检测
为检测所建立的多重PCR的特异性，选取常见的病原菌进行检测，其中包括克雷伯菌、绿脓杆菌、双球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂肺脏组织为模板分别用上述优化的条件进行三重PCR反应。对三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察建立的三重PCR方法是否只能特异性的针对克雷伯菌进行扩增，而对其他水貂常发病的病原扩增为阴性，从而判定其是否可作为特异性鉴定克雷伯菌的快速方法。
结果可知，用SEQ ID No.1/SEQ ID No.2、SEQ ID No.3/SEQ ID No.4及SEQ IDNo.5/SEQ ID No.6三对引物建立的三重PCR方法只能特异性的针对克雷伯菌进行扩增，对其他水貂常发病的病原：双球菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂肺脏组织扩增为阴性，均无特异性条带，说明该方法具有很好的特异性，可作为特异性鉴定克雷伯菌的快速方法(见图3)。
6、敏感度检测
(1)三重PCR针对肺炎克雷伯菌感染水貂肺脏总DNA的敏感性检测
提取感染水貂肺脏组织总DNA，所提DNA的浓度对应病料组织的量是1mg/μL，将所提DNA进行10×梯度稀释：1mg/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL，分别用来作为模板，进行单重和三重PCR对克雷伯菌的检测灵敏度测定。结果可知，所建立三重PCR方法与单一PCR的敏感度一致，最低可检测到100pg/μL的组织总DNA(见图4)。
(2)三重PCR针对肺炎克雷伯菌的DNA模板的敏感性检测
三重PCR针对的肺炎克雷伯菌的DNA模板分别为1010-100拷贝，进行三重PCR，对克雷伯菌的DNA检测灵敏度测定。结果表明，所建立检测肺炎克雷伯菌的三重PCR方法最低可检测到102个拷贝的细菌DNA(见图4)。
7、临床样本检测
用建立的三重PCR方法对威海、菏泽、诸城等地32貂场送检的61只分离到克雷伯菌的水貂组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与细菌分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的三重PCR方法适合于克雷伯菌的快速检测。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种检测肺炎克雷伯菌的三重PCR引物组、试剂盒及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acagcctctc cttcggctt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tagcgacttg gtcccaacag t 21
<210> 3
<211> 20
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<211> 23
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<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgcgtgacga gcggctatt 19

Claims (5)

1.一种检测肺炎克雷伯菌的三重PCR引物组，其特征是，所述引物组包括下列三对引物：
引物对1
SEQ ID No.1：5’-ACAGCCTCTCCTTCGGCTT-3’，
SEQ ID No.2：5’-TAGCGACTTGGTCCCAACAGT-3’；
引物对2
SEQ ID No.3：5’-ACTGGGCTACCTCTGCTTCA-3’，
SEQ ID No.4：5’-CTTGCATGAGCCATCTTTCATCA-3’；
引物对3
SEQ ID No.5:5’-ACATCGATGAACACGAGCGC-3’，
SEQ ID No.6：5’-TGCGTGACGAGCGGCTATT-3’。
2.一种检测肺炎克雷伯菌的三重PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求 1所述引物组。
3.如权利要求2所述检测肺炎克雷伯菌的三重PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括Taq酶、PCRbuffer、dNTPs。
4.权利要求1所述检测肺炎克雷伯菌的三重PCR引物组在制备快速检测待测组织肺炎克雷伯菌是否为强毒力菌株的药物中的应用。
5.权利要求2或3所述检测肺炎克雷伯菌的三重PCR试剂盒在制备快速检测待测组织肺炎克雷伯菌是否为强毒力菌株的药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)

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Title
Multiplex PCR Analysis for Rapid Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenem-Resistant (Sequence Type 258 [ST258] and ST11) and Hypervirulent (ST23, ST65, ST86, and ST375) Strains;Fangyou Yu, et al.;《Journal of Clinical Microbiology》;20180620;第56卷(第9期);第e00731-18篇第1-7页 *

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