CN116814817A - 一种用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病原体检测技术领域，具体涉及一种用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。本发明所述引物和探针组合可以同时对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行检测，进而对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行有效区分和鉴别，大大节约了检测时间和成本。同时所述引物和探针组合的特异性强，与其他常见的病原菌如丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和马兽疫链球菌等均无法进行特异性扩增；所述引物和探针组合的灵敏度较高，其检测下限可以达到102拷贝/μL；且所述引物和探针组合的重复性好，重复之间的变异较低。进而为绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的鉴定和诊断提供技术基础。

Description

一种用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体检测的引物和探针 组合、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病原体检测技术领域，具体涉及一种用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。
背景技术
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引起绵羊、山羊传染性肺炎的主要病原体，患病羊临床表现为咳嗽、流涕、气喘、渐进性消瘦以及肺脏间质增生性炎症，常呈隐蔽性、持续性感染。羊支原体肺炎是高度接触性传染病，MO通过空气飞沫传播，进入宿主机体，通过黏附作用定植于呼吸道黏膜，造成持续性感染，羔羊尤为易感，发病率和死亡率均较高，患病羔羊肺脏呈典型的胸膜肺炎病变，肺脏炎性渗出增加，肺脏与心包膜、膈膜、胸腔壁内膜黏连，肺脏病灶萎缩呈暗红色，伴有呼吸道支气管炎症状。妊娠期、哺乳期母羊感染MO，呈现持续性混合感染，因而造成羔羊感染率上升，增加羔羊发病率和死亡率。MO使成年羊持续性感染、羔羊病死率增加，严重影响羊生产性能，造成较为严重的经济损失，MO引起的羊支原体肺炎是影响养羊业健康发展的重要呼吸道疫病。
精氨酸支原体(Mycoplasma arginini，MA)牛羊呼吸道常在菌，属于条件性致病菌，对免疫功能低下的动物致病，甚至可导致死亡。当动物运输应激以及其他因素刺激导致机体的防御机制下降时，MA常与其他病原菌混合感染引起呼吸道疾病，病畜中MA的分离率明显高于健康畜，目前已经从患呼吸道病的绵羊、山羊呼吸道分离到该病原菌，并且精氨酸支原体与MO经常呈现混合感染，可能是进一步加重呼吸道症状的原因之一。由于MA的存在，为MO的分离鉴定及诊断造成一定的干扰。且因MO和MA难于分离培养，呼吸道载菌量有限，无法对二者进行快速、灵敏且准确地鉴别和诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用，所述双重实时荧光定量PCR的引物和探针组合可以同时对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行检测，进而对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行有效鉴别，且特异性强，灵敏度高，重复性好。
本发明提供了一种引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测绵羊肺炎支原体的引物和探针以及检测精氨酸支原体的引物和探针；
所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
所述检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述荧光探针mo-113q1-probe的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
所述荧光探针arg-q2-probe的5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物和探针组合在制备鉴定和/或诊断绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体鉴定和/或诊断的双重实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述技术方案所述的引物和探针组合，以及荧光定量PCR试剂。
优选的，还包括绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品。
优选的，所述绵羊肺炎支原体质粒标准品的制备引物的上游引物MO_p113F和下游引物MO_p113R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
所述精氨酸支原体质粒标准品的制备引物的上游引物arg-F和下游引物arg-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
优选的，绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品的浓度分别为1×(102～107)拷贝/μL。
优选，所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R以及检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的浓度分别为2.5～10μM；所述检测绵羊肺炎支原体的探针和检测精氨酸支原体的探针的浓度分别为0.1～0.4μM。
本发明还提供了一种非诊断目的的绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的双重实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
以上述技术方案所述的引物和探针组合对待测样本的DNA进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
优选的，所述判断的原则为：当待测样本中绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的Ct值小于35，且扩增曲线有明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阳性样本；
当待测样本中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的Ct值大于等于35，且扩增曲线无明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阴性样本；
当阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线有明显扩增单峰，所述待测样本为污染样本，重新进行检测。
有益效果：
本发明提供了一种引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测绵羊肺炎支原体的引物和探针以及检测精氨酸支原体的引物和探针；所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；所述检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明所述引物和探针组合可以同时对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行检测，进而对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行有效鉴别，大大节约了检测时间和成本。同时所述引物和探针组合的特异性强，与其他常见的病原菌如丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和马兽疫链球菌等均无法进行特异性扩增；所述引物和探针组合的灵敏度较高，其检测下限可以达到102拷贝/μL；且所述引物和探针组合的重复性好，重复之间的变异较低。进而为绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的鉴定和诊断提供技术基础。
生物保藏信息
精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)Arg_LKD001，于2023年02月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45421。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例3中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR扩增曲线；
图2为实施例3中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR扩增标准曲线；
图3为实施例4中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR方法的特异性分析结果；
图4为实施例5中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR检测方法敏感性分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测绵羊肺炎支原体的引物和探针以及检测精氨酸支原体的引物和探针；
所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
所述检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，所述检测绵羊肺炎支原体的引物和探针优选依据绵羊肺炎支原体p113基因设计得到，所述绵羊肺炎支原体p113基因在GenBank中的基因序列号为KR270152.1。
本发明所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，具体分别为5’-CGGGACTTATTGGAGCTGGTAT-3’和5’-TGAAACACGAGATGCAAAC TGA-3’。本发明所述检测绵羊肺炎支原体的引物的浓度优选为2.5～10μM，进一步优选为2.5μM、5μM或10μM，更优选为5μM，即所述所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的浓度保持一致，且具有所述引物的浓度的优选特征。
本发明所述检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，具体为5’-CGGCCTAACAATCG-3’。本发明所述荧光探针mo-113q1-probe的5’端标记的荧光基团优选为FAM，3’端标记的淬灭基团优选为BHQ1，即5’-FAM-CGGCCTAACAATCG-BHQ1-3’。本发明所述检测绵羊肺炎支原体的探针浓度优选为0.1～0.4μM，进一步优选为0.1μM、0.2μM和0.4μM，更优选为0.2μM。
在本发明中，所述检测精氨酸支原体的引物和探针优选依据精氨酸支原体精氨酸脱氨酶基因arcA设计得到，所述精氨酸脱氨酶基因arcA在GenBank中的基因序列号为EF583462。
本发明所述检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，具体分别为5’-GGCAGGGATCACAAAATACGA-3’和5’-TGGCATTGGGTCAACGATTAA-3’。本发明所述检测精氨酸支原体的引物的浓度优选为2.5～10μM，进一步优选为2.5μM、5μM或10μM，更优选为2.5μM，即所述所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的浓度保持一致，且具有上述所述引物的浓度的优选特征。
本发明所述检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列如SE Q IDNO.6所示，具体为5’-TATCGAAGCAGATCACG-3’；所述荧光探针arg-q2-probe的5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1，即5’-VI C-TATCGAAGCAGATCACG-BHQ1-3’。本发明所述检测精氨酸支原体的探针的浓度优选为0.1～0.4μM，进一步优选为0.1μM、0.2μM和0.4μM，更优选为0.1μM。
本发明所述引物和探针组合可以同时对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行检测，进而对上述二者进行有效鉴别，大大节约了检测时间和成本。同时所述引物和探针组合的特异性强，与其他常见的病原菌如丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和马兽疫链球菌等均无法进行特异性扩增；所述引物和探针组合的灵敏度较高，其检测下限可以达到102拷贝/μL；且所述引物和探针组合的重复性好，重复之间的变异较低。进而为绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的鉴定和诊断提供技术基础。
基于上述技术优势，本发明还提供了上述技术方案所述的引物和探针组合在制备鉴定和/或诊断绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的试剂盒中的应用，进一步优选为在制备鉴定和/或诊断绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的试剂盒中的应用，更优选为在制备鉴定和诊断绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体鉴定和/或诊断的双重实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述技术方案所述的引物和探针组合以及荧光定量PCR试剂。本发明对所述荧光定量PCR试剂的种类和来源均没有特殊限定，任意可实现荧光定量PCR的试剂均属于本发明的保护范围，如商用组合荧光定量PCR试剂，在本发明的一个实施例中采用的是购买于生工生物工程(上海)股份有限公司的2×TaqManFastqPCRMasterMix。
本发明所述双重实时荧光定量PCR试剂盒优选还包括绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品。本发明所述绵羊肺炎支原体质粒标准品浓度优选为1×(102～107)拷贝/μL。本发明所述精氨酸支原体质粒标准品浓度优选为1×(102～107)拷贝/μL。
本发明所述绵羊肺炎支原体质粒标准品的制备引物的上游引物MO_p113F和下游引物MO_p113R的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，具体分别为：5’-ATCATCAAAATCCAAAACCCT-3’和5’-AAATGTCAGATTTGGCGATGT-3’；本发明所述精氨酸支原体质粒标准品的制备引物的上游引物arg-F和下游引物arg-R的核苷酸序列分别优选如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示，具体分别为：5’-CTCCATGATACTACGACCCTT-3’和5’-AAGGGTCGTAGTATCATGGAG-3’。本发明对所述绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品的制备方法没有特殊限定，任意采用所述绵羊肺炎支原体质粒标准品的制备引物和精氨酸支原体质粒标准品的制备引物得到的质粒标准品均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种非诊断目的的绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的双重实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
以上述技术方案所述的引物和探针组合对待测样本的基因组DNA进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
本发明所述判断的原则优选为：当待测样本中绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的Ct值小于35，且扩增曲线有明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阳性样本；
当待测样本中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的Ct值大于等于35，且扩增曲线无明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阴性样本；
当阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线有明显扩增单峰，所述待测样本为污染样本，重新进行检测。
本发明优选提取待测样本的基因组DNA。本发明对提取待测样本的cDNA的方式没有特殊限定，采用本领域常规方法或者试剂盒均可。
得到所述待测样本的基因组DNA后，本发明以所述引物和探针组合对所述待测样本的基因组DNA序列进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线。本发明所述实时荧光定量PCR扩增的体系优选以20μL计，包括：2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、mo-113q1F0.4μL、mo-113q1R 0.4μL、mo-113q1-probe0.2μL、arg-q2F 0.4μL、arg-q2R 0.4μL、arg-q2-probe 0.2μL、待测样本的基因组DNA 2μL和无菌无酶水6μL。本发明所述实时荧光定量PCR扩增的程序优选为95℃3min；95℃5s，55℃30s，40个循环，从55℃开始收集荧光。
得到所述扩增曲线后，本发明对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。本发明所述判断的原则为：待检样本Ct值均小于35，扩增曲线有明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值，扩增曲线无明显扩增，即无明显扩增峰。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中使用的主要试剂和仪器：
主要试剂：2×TaqMan Fast qPCR MasterMix(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Taq PCR Mix预混液(生工生物工程(上海)股份有限公司)；PMD19-T(TaKaRa公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化有限公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
主要仪器：PCR仪(ABI)，荧光定量PCR仪(杭州博日)，Gel DocTMXR+凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，微量移液器(1000μL、200μL、20μL、2.5μL)(德国EPPENDORF公司)。
实施例1
绵羊肺炎支原体(MO)质粒标准品和精氨酸支原体(MA)质粒标准品的制备，步骤如下：
1、实验材料：
1.1绵羊肺炎支原体标准株Y98，保存于内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所家畜传染病研究室。
1.2精氨酸支原体分离株Arg_LKD001精氨酸支原体宁夏奶山羊肺脏分离株，保藏编号为GCMCC No.45421。
1.3绵羊肺炎支原体质粒标准品制备引物：上游引物MO_p113F：5’-ATCATCAAAATCCAAAACCCT-3’(SEQ ID NO.7)，下游引物MO_p113R：5’-AAATGTCAGATTTGGCGATGT-3’(SEQ ID NO.8)。
1.4精氨酸支原体质粒标准品制备引物：上游引物arg-F：5’-CTCCATGATACTACGACCCTT-3’(SEQ ID NO.9)，下游引物arg-R：5’-AAGGGTCGTAGTATCATGGAG-3’(SEQ ID NO.10)。
2、实验方法和结果：
2.1构建标准品质粒：用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取绵羊肺炎支原体分离株MO_BM13D001和精氨酸支原体体分离株Arg_LKD001精氨酸支原体宁夏奶山羊肺脏分离株的基因组DNA，存放于-80℃备用。
2.1.1MO标准品质粒构建：以MO_BM13D001基因组DNA为模板，PCR扩增得到P113基因片段，P113基因片段的长度为455bp；
PCR反应体系为：TaqPCRMix 25μL，上游引物MO_p113F(10μmol/μL)
2μL，下游引物MO_p113R(10μmol/μL)2μL，MO基因组DNA 1μL，DEPC水补足至50μL。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃延伸30s，72℃退火30s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。
胶回收纯化PCR产物，连接PMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过PCR及双酶切鉴定，确定阳性质粒为MO-p113-T，阳性质粒菌扩大培养至5mL，提取MO-p113-T质粒用于制备标准品。
2.1.2MA标准品质粒构建：以Arg_LKD001精氨酸支原体基因组DNA为模板，PCR扩增arcA基因片段，arcA基因片段的长度为319bp；
PCR反应体系为：Taq PCRMix 25μL，上游引物arg-F(10μmol/μL)2μL，下游引物arg-R(10μmol/μL)2μL，MA基因组DNA 1μL，DEPC水补足至50μL。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃延伸30s，72℃退火30s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保温。
胶回收纯化PCR产物，连接PMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过PCR及双酶切鉴定，确定阳性质粒MA-arg1-T，阳性质粒菌扩大培养至5ml，提取MA-arg1-T质粒用于制备标准品。
2.2荧光定量PCR标准品制备
分别将步骤2.1中鉴定为阳性的克隆菌中提取质粒，并进行定量，分别得到绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品并计算拷贝数。用无菌无酶水将上述质粒标准品分别10倍梯度稀释，终浓度调整为1×102拷贝/μL～1×107拷贝/μL。
实施例2
荧光定量PCR反应体系及扩增条件，步骤如下：
检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R分别为5’-CGGGACTTATTGGAGCTGGTAT-3’和5’-TGAAACACGAGATGCAA ACTGA-3’；检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列为5’-FAM-CGGCCTAACAATCG-BHQ1-3’。
检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别为5’-GGCAGGGATCACAAAATACGA-3’和5’-TGGCATTGGGTC AACGATTAA-3’；检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列为5’-VIC-TATCGAAGCAGATCACG-BHQ1-3’。
以标准品质粒为模板，检测绵羊肺炎支原体的引物浓度为5μM，探针浓度为0.2μM；检测精氨酸支原体引物浓度为2.5μM，探针浓度为0.1μM，最佳退火温度为56℃。
实施例3
双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立，步骤如下：
双重实时荧光定量PCR质粒标准品分别为实施例1中制备得到的MO-p113-T和MA-arg1-T，标准品浓度为1×102拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×105拷贝/μL和1×106拷贝/μL。
反应体系为：
2×TaqMan Fast qPCR Master Mix：10μL；mo-113q1F(10μM)：0.4μL；mo-113q1R(10μM)：0.4μL；mo-113q1-probe(10μM)：0.2μL；arg-q2F(10μM)：0.4μL；arg-q2R(10μM)：0.4μL；arg-q2-probe(10μM)：0.2μL；MO-p113-T标准品：1μL；MA-arg1-T标准品：1μL；无菌无酶水：4.4μL。
反应条件为：
95℃3min；95℃5s，55℃30s(收集荧光)，40个循环。荧光通道选择FAM和VIC。
绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR扩增曲线见图1，其中质粒标准品浓度与循环数结果见表1。
表1质粒标准品浓度与循环数结果
根据表1结果获得图2的标准曲线(纵坐标为标准品Ct值，横坐标为质粒标准品浓度的对数)，其中，绿色标准曲线为绵羊肺炎支原体MO标准曲线，紫色为精氨酸支原体MA标准曲线，绵羊肺炎支原体质粒标准品浓度与循环数的相关系数为-0.997，精氨酸支原体质粒标准品浓度与循环数的相关系数为-0.994。
实施例4
双重实时荧光定量PCR检测方法特异性分析，步骤如下：
应用本发明建立的双重实时荧光定量PCR检测方法，分别对绵羊肺炎支原体(标准株Y98)、精氨酸支原体(精氨酸支原体分离株Arg_LKD001精氨酸支原体宁夏奶山羊肺脏分离株，保藏编号为GCMCC No.45421)、丝状支原体山羊亚种(标准株PG1)、大肠杆菌(CVCC1532)、金黄色葡萄球菌(CVCC45)、多杀性巴氏杆菌(CVCC402))、马兽疫链球菌(CVCC55001)、无模板阴性对照进行检测，验证建立双重实时荧光定量PCR方法的特异性，结果显示如图3所示，其中先起峰扩增曲线表示精氨酸支原体MA，后起峰扩增曲线表示绵羊肺炎支原体MO。
由图3可以得出：绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体有扩增曲线，余未见扩增信号，本发明所建立的双重实时荧光定量PCR特异性较强。
实施例5
双重实时荧光定量PCR检测方法敏感性分析
使用无菌无酶水分别将绵羊肺炎支原体标准品质粒MO-p113-T和精氨酸支原体标准品质粒MA-arg1-T按10倍梯度稀释成终浓度为1×1010～1×101拷贝/μL，等量混合后作为模板进行扩增，结果如图4所示。
由图4可以得出：本发明建立的双重实时荧光定量PCR方法对绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的检测下限均为102拷贝/μL。
实施例6
双重实时荧光定量PCR检测方法重复性分析
取绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体基因组DNA，稀释10倍，100倍，1000倍后，相同稀释度基因组DNA等量混合，用于组内重复性和组间重复性检测。批内重复性检测每个浓度梯度设置三个重复；批间重复检测分三批次检测，每次每个浓度设置三个重复，共进行三次检测。根据所得的Ct值计算均值、标准差及变异系数，分析双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性，结果如表2所示。
表2双重实时荧光定量PCR重复性检测结果
由表2可以得出：双重荧光定量PCR检测方法组内重复和组内重复变异系数均小于15％，具有较好的重复性。
实施例7
应用所建立的绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重实时荧光定量PCR检测方法对来自内蒙古呼和浩特市、包头市和乌兰察布市绵羊和山羊鼻拭子样品89份进行检测，结果表明，检测出MO阳性率为33.7％(30/89)，检测出MA阳性率为11.2％(10/89)，检测出两种病原混合感染的阳性率为10.1％(9/89)，检测结果与病原分离结果基本一致，如表3所示。
表3双重荧光定量PCR检测临床样本
由以上实施例可以得出：本发明所述双重实时荧光定量PCR的引物和探针组合可以同时对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行检测，进而可以对上述二者进行有效鉴别和区分，且特异性强，灵敏度高，重复性好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括检测绵羊肺炎支原体的引物和探针以及检测精氨酸支原体的引物和探针；
所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述检测绵羊肺炎支原体的荧光探针mo-113q1-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
所述检测精氨酸支原体的荧光探针arg-q2-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光探针mo-113q1-probe的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
所述荧光探针arg-q2-probe的5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
3.权利要求1或2所述的引物和探针组合在制备鉴定和/或诊断绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的试剂盒中的应用。
4.一种用于绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体鉴定和/或诊断的双重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物和探针组合，以及荧光定量PCR试剂。
5.根据权利要求4所述的双重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品。
6.根据权利要求5所述的双重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体质粒标准品的制备引物的上游引物MO_p113F和下游引物MO_p113R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
所述精氨酸支原体质粒标准品的制备引物的上游引物arg-F和下游引物arg-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
7.根据权利要求5或6所述的双重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，绵羊肺炎支原体质粒标准品和精氨酸支原体质粒标准品的浓度分别为1×(102～107)拷贝/μL。
8.根据权利要求4所述的双重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述检测绵羊肺炎支原体的引物的上游引物mo-113q1F和下游引物mo-113q1R以及检测精氨酸支原体的引物的上游引物arg-q2F和下游引物arg-q2R的浓度分别为2.5～10μM；所述检测绵羊肺炎支原体的探针和检测精氨酸支原体的探针的浓度分别为0.1～0.4μM。
9.一种非诊断目的的绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
以权利要求1或2所述的引物和探针组合对待测样本的DNA进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
10.根据权利要求9所述的双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述判断的原则为：
当待测样本中绵羊肺炎支原体和/或精氨酸支原体的Ct值小于35，且扩增曲线有明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阳性样本；
当待测样本中绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的Ct值大于等于35，且扩增曲线无明显的单峰；阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线无明显扩增单峰，所述待测样本为阴性样本；
当阴性对照样本和无模板对照样本无Ct值扩增曲线有明显扩增单峰，所述待测样本为污染样本，重新进行检测。
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