CN103131760A

CN103131760A - 一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法

Info

Publication number: CN103131760A
Application number: CN2011103968928A
Authority: CN
Inventors: 高志贤; 孙智勇; 宁保安; 彭媛; 白家磊; 孙思明; 苏璞
Original assignee: Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Current assignee: Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2011-12-05
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明公开了一种可同时检测六种致病菌的悬浮芯片方法，所述方法包括：从Gene bank上下载大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌特有基因序列，设计相应的引物、探针，采用液态悬浮杂交方法，把特异性的核酸探针共价结合到用彩色荧光编码的微球表面。生物素标记扩增产物，杂交到与它互补的探针序列，通过结合的链霉亲和素藻红蛋白，检测目标物，实验证明所设计探针没有交叉反应，单通道检测检出限达到8nM，多通道检测的检出限为1.6nM，实际样品单通道检出限在10-4000CFU/mL，多通道检出限为100CFU/mL。

Description

一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法

技术领域

本发明提供一种可以对六种致病菌同时检测的悬浮芯片方法，涉及致病菌特有基因的引物及特异性探针的设计，还对悬浮芯片检测条件进行了优化。

背景技术

全球食源性疾病发病率不断上升，且有严重暴发流行。据报道，发达国家每年大约有30％的人患食源性疾病。这些国家食源性疾病的种类较多，常见的有霍乱、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌感染等，腹泻发病率和死亡率较高。世界卫生组织统计报告表明，全球因食物污染而致病者已达数亿人，每年约有几亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70％是因生物性污染的食品所致。在发展中国家，估计每年腹泻及其相关疾病有2.7亿病例，导致240万5岁以下儿童死亡。尤其是今年5月在德国爆发的由出血性大肠杆菌O104:H4引发的“毒蔬菜”事件，经过一个多月的排查后，终于确定了造成此次大肠杆菌疫情的罪魁祸首元凶是产于德国北部的一家有机农场生产的豆芽。目前，此次疫情已造成约4000人感染，三十余人死亡。近日，感染了单核增生李斯特菌的甜瓜事件，在美国已经蔓延超过26个州，共造成133人感染，28人死亡的严重后果。可以说食源性致病菌污染问题已经迫在眉睫。

食源性致病菌的检测，除了常规的生化培养，血清学鉴定以外，近年来涌现除了许多新方法，包括以免疫学为基础的检验法(如免疫磁珠法、ELISA法等)；以分子生物学为基础的检验法(如PCR法、荧光PCR法、Nucleic acidsequence based amplification、基因芯片法等)，上述各方法不论是常规的生化培养鉴定还是新兴的快速检测方法，虽然已经能够成功的在种属和基因型的水平上对致病菌进行鉴定，但是如果把这些技术应用在常规诊断实验室上要么费时、费力、费钱，要么检测的敏感性差，漏检、错检多，急需有一种能够多通道、快速、准确、敏感地检测致病菌的方法，因此本发明提出了一种利用悬浮芯片快速、简便的检测方法，它能够实现同时检测多种致病菌的目的。

悬浮芯片是由许多羧基化微球为主要基质构成的，这些乳胶微球是由聚苯乙烯制成的大小均一的圆形微球，在其制作过程中按照严格比例掺入两种荧光染料，使得每个球形基质都有独特的光谱地址。微球表面可以共价结合各种各样的核酸或蛋白质检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。通过微流体技术将微球排成单列快速流经Luminex检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球基质中的颜色，可根据微球的光谱地址而定性；而绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。最后，通过软件，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度。这使得悬浮芯片技术不但具有高通量的特性，而且具有重复性好、灵敏度高、信噪比好、灵活性大的优势，已经广泛应用于病原体检测、遗传性疾病筛检、基因表达分析、细胞因子等的测定。

发明内容

本专利的目的是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高、特异性好，可同时检测六种常见致病菌(大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌)的悬浮芯片检测方法。

本专利提供的技术方案是一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法，其中包括针对六种致病菌特有基因分别设计的引物，下游引物末端使用生物素标记，根据PCR扩增区内核酸序列设计特异性捕获探针，探针末端氨基C12修饰；所设计探针分别与Luminex编码微球偶联，偶联探针后的微球在一定条件下可以特异性地捕获生物素化的PCR产物，通过结合的链霉亲和素藻红蛋白，经Luminex检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球基质中的颜色，可根据微球的光谱地址而定性；而绿色激光则激发结合在待测样本上的链霉亲和素藻红蛋白进行定量。最后，通过软件，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度。

本专利还包括一种多重悬浮芯片的检测方法，其中该方法包括步骤：1)单一、多重PCR的反应体系、反应条件；2)偶联探针的微球与目标物杂交温度的摸索；3)探针特异性验证方法；4)单一、多重检测的标准曲线绘制、检测范围及最低检出限的确定；5)方法检测灵敏度测定；6)方法特异性验证。

偶联探针的微球与目标物杂交检测方法：分别添加5μL-17μL检测目标物，至微球工作液中(包含32μL TMAC、5000个微球/μL)，添加TE至50μL，95℃变性5分钟，42℃的杂交温度下杂交20分钟，12000g离心5分钟，弃上清，添加含100μg/mL SA-PE 50μL，吹打混匀，在42℃杂交温度下，孵育15分钟，使用LuminexCS1000悬浮芯片系统检测。

本专利的有益效果在于：

1.针对六种病原菌特有基因设计的探针偶联微球，稳定性好，4℃可保存一年以上，经探针特异性验证，所设计探针特异性较好，没有交叉反应。

2.检测灵敏度高，与常规单一PCR或多重PCR相比，灵敏度要高1到2个数量级。

3.与常规检测致病菌方法相比，弥补了不容易实现多元检测的不足，大大提高了检测效率。

4.利用本专利建立的方法进行检测，具备简便、快速、灵敏、准确、低成本等优点，符合现代检测技术的要求。

附图说明

图1为探针特异性验证图。对6条探针的特异性验证结果显示6条探针间均无交叉反应。横坐标为模拟检测目标物浓度，纵坐标为检测荧光信号的中位荧光值(MFI)。

图2为六种致病菌单通道检测标准曲线。结果显示，单通道检测最低检出限为8nM。横坐标为检测目标物的浓度，纵坐标为检测荧光信号的中位荧光值(MFI)。

图3为六种致病菌多通道检测标准曲线。结果显示，多通道检测最低检出限为1.6nM。横坐标为检测目标物的浓度，纵坐标为检测荧光信号的中位荧光值(MFI)。

图4为单通道检测灵敏度检测结果。从图中可以看出，目标产物的扩增与基因组DNA的浓度成正比，但悬浮芯片的检测限要低于PCR检测。实际样品单通道检出限大肠杆菌O157:H78×10²CFU/mL，志贺氏菌9×10²CFU/mL，沙门氏菌1×10¹CFU/mL，副溶血性弧菌2×10¹CFU/mL，金黄色葡萄球菌4×10³CFU/mL，单核增生李斯特菌8×10²CFU/mL。

图5为多通道检测灵敏度检测结果。由图可得，多通道检测最低检出限为100CFU/mL。

图6方法特异性验证试验结果。为了验证本方法的特异性，挑选了12种致病菌按建立的检测体系分别进行检测，结果如图可知，本研究设计的六种探针，在与其它种属或血清型的菌株进行反应时，会有一定的交叉反应，但这种交叉反应仅出现在亲缘性比较近的或者具有同样毒力因子的菌株间发生，因此本方法可以应用于同一类致病菌或者具有相同毒力基因的菌株检测。

具体实施方式

实施例1：单一、多重PCR检测大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌

首先确定六种致病菌特有基因，大肠杆菌O157:H7选择rfbE基因，志贺氏菌选择ipaH基因，沙门氏菌选择InvA基因，副溶血性弧菌选择tdh基因，金黄色葡萄球菌选择femA基因，单核增生李斯特菌选择iap基因。从gene bank上下载特有基因序列，使用DNASTAR(LaserGene公司)的MegAlign程序中的ClustalW算法进行序列分析，选取特异部分序列，使用DNASTAR(LaserGene公司)PrimerSelect，设计引物。将所有引物进行Blast分析，选取高特异性的引物序列。根据特有基因设计、合成引物，并对下游引物末端进行生物素标记；在引物扩增区设计探针。应用Primer Select设计探针，设定探针的大小为20-35碱基左右，GC含量为40-45％，退火温度为55-60℃，筛选符合条件的所有探针序列，然后经BLAST分析特异性，筛选出高度特异的探针，并在5端进行H2N-C12修饰，以便与微球偶联。见表1。

表1六种病菌特有基因的引物与探针序列

六种病原菌特有基因的扩增使用TAKARA公司Multiplex PCR Assay Kit(DRR060A)进行扩增，单一、多重PCR扩增体系组分见表2。单一PCR反应程序是：94℃预变性30秒，94℃变性30秒，57℃退火15秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后72℃温育10min；多重PCR反应程序是：94℃预变性60秒，94℃变性30秒，57℃退火90秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后72℃温育10min。

表2单一、多重PCR扩增体系组分表

实施例2：编码微球与特异性探针采用碳二亚胺法(EDC法)进行偶联。

1).稀释探针至0.1mmol/L；

2).取200μL各自编码的微球振荡，转移到棕色EP管中12000g离心，弃上清

3).加入50μL浓度为0.1mol/L的MES(pH 4.5)，震荡20s以重悬微球；

4).向悬浮微球中加入2μL探针；

5).向微球溶液中加入2.5μL新鲜配制的10mg/m EDC溶液，振荡混匀；

6).室温蔽光温育30min；

7).再次向微球溶液中加入新配制的10mg/mL EDC，振荡；

8).室温蔽光温育30min；

9).向微球溶液中加入1mL 0.02％Tween20，12000g离心2min，弃上清；

10).加入1mL 0.1％的SDS重悬微球，8000g离心2min，弃上清；

11).加入100μL TE Buffer(pH 8.0)，震荡混匀重悬微球，4℃，避光保存。

实施例3：探针特异性验证。设计并合成了与探针序列完全互补的一段核苷酸序列作为模拟检测的目标物，序列末端用生物素标记，将模拟检测目标物5倍稀释八个梯度。在一个反应体系内分别添加偶联了不同探针的微球及一种目标物，验证探针的特异性。验证结果如图1，6条探针间均无交叉反应。

实施例4：悬浮芯片单通道、多通道检测标准曲线的绘制，检测范围、最低检出限的确定。方法：以合成的寡核苷酸片段为模拟检测目标物，梯度稀释0.5mM-5×10^-8mM，进行检测，绘制标准曲线。采用不添加检测目标物为空白对照。为确定多通道检测范围及最低检出限，将稀释的寡核苷酸目标物分别混合，检测，绘制标准曲线，不添加检测目标物作为空白对照。单通道、多通道检测参数见表3。

表3单通道、多通道检测标准曲线参数

实施例5：悬浮芯片与单一PCR技术相结合检测实际样品。将六种致病菌培养18h后，计数，提取病原菌基因组DNA，10倍稀释6个梯度，按照摸索好的PCR条件，分别扩增目的基因，将PCR扩增产物与相应的微球杂交，验证悬浮芯片检测实际样品的能力。结果如图4。从图中可以看出，目标产物的扩增与基因组DNA的浓度成正比，但悬浮芯片的检测限要低于PCR检测。实际样品单通道检出限大肠杆菌O157:H7 8×10²CFU/mL，志贺氏菌9×10²CFU/mL，沙门氏菌1×10¹CFU/mL，副溶血性弧菌2×10¹CFU/mL，金黄色葡萄球菌4×10³CFU/mL，单核增生李斯特菌8×10²CFU/mL。

实施例6：悬浮芯片与多重PCR技术结合检测六种致病菌。六种致病菌基因组混合后稀释7个梯度，同实施例1的反应，进行多重PCR反应，取15μL扩增产物进行悬浮芯片检测，结果如图5。悬浮芯片与多重PCR技术相结合，检出浓度为100CFU/mL。

实施例7：方法特异性的验证试验。为了验证本方法的特异性，我们又挑选了12种致病菌按建立的检测体系分别进行检测，结果如图6可知，本研究设计的六种探针，在与其它种属或血清型的菌株进行反应时，会有一定的交叉反应，但这种交叉反应仅出现在亲缘性比较近的或者具有同样毒力因子的菌株间发生，因此本实验所建立的方法对于同一类致病菌或者具有相同毒力基因的菌株检测同样有效。

Claims

1.一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法，其中包括针对六种致病菌特有基因分别设计的引物，下游引物末端使用生物素标记，根据PCR扩增区内核酸序列设计特异性捕获探针，探针末端氨基C12修饰；所设计探针分别与Luminex编码微球偶联，偶联探针后的微球在一定条件下可以特异性地捕获生物素化的PCR产物，通过结合的链霉亲和素藻红蛋白，经Luminex检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球基质中的颜色，可根据微球的光谱地址而定性；而绿色激光则激发结合在待测样本上的链霉亲和素藻红蛋白进行定量。最后，通过软件，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度。

2.权利1所述的检测方法，其中该方法包括步骤：1)单一、多重PCR的反应体系、反应条件；2)偶联探针的微球与目标物杂交温度的摸索；3)探针特异性验证方法；4)单一、多重检测的标准曲线绘制、检测范围及最低检出限的确定；5)方法检测灵敏度测定；6)方法特异性验证。