CN114934045A

CN114934045A - 一种食品微生物检测的探针、芯片、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN114934045A
Application number: CN202210629575.4A
Authority: CN
Inventors: 盖桂林; 缪宜祥; 黄登雄
Original assignee: Fujian Changding Panpan Foods Co ltd
Current assignee: Fujian Changding Panpan Foods Co ltd
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2042-06-06

Abstract

本发明提供了针对常见焙烤食品微生物大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)的检测引物和探针。通过筛选低同源性序列，分别设计针对这六种食品微生物的特异性引物和特异性探针，采用多重PCR技术，实现对这六种食品微生物的快速有效检测。本发明提供了一种简单、样品需求量小，快速、灵敏度高、易于推广的多种食品微生物的检测方法，并且该试剂盒成本低、适用范围广。本发明还利用液相芯片技术和扫描芯片技术，建立了能特异性检测上述六种食品微生物检测方法，该检测方法能够对目标基因进行快速检测，其检测灵敏度高，特异性好。

Description

一种食品微生物检测的探针、芯片、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于食品微生物检测和分子生物学领域，具体涉及一种食品微生物大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)的检测探针、芯片、试剂盒及方法。

背景技术

微生物与人类活动密切相关，微生物技术广泛用于食品和药品生产、新型材料、能源的开发及环境治理等方面。但另一方面，微生物污染也是引发食源性疾病的主要因素之一，而食品安全是直接关系到人民群众生命、健康和社会稳定的重大公共安全问题。微生物污染存在食品生产、加工、储存、运输、销售到食用的整个过程的每个环节中。食品微生物检验是保证食品安全的技术手段，微生物指标可真实反映食品原料、生产加工过程以及加工环境是否得到有效控制，也是判定食品能否安全食用的科学依据之一。

目前食品中微生物检测主要依据GB 4789系列标准，采用平板计数的方法进行检验。对于非致病菌的检验，按照此种检验方法，耗时较长，例如:菌落总数仅培养时间就需48h，霉菌及酵母菌检验至少则需要5d。而对于致病菌的检测耗时则更长，包括预增菌、增菌、分离、生化试验、镜检以及血清学验证等一系列的检测程序，一般需要5～7d。此外，传统平板计数法对实验室条件(设备设施和环境)、对人员专业技能和人员数量要求高。繁琐的检测程序不仅占用了大量的检测资源，更重要的是冗长的检测周期既不利于生产者对食品的即时监控和在线控制，也不利于监管部门对问题食品的快速反应，尤其是在一些短保质期产品，如部分乳制品、糕点类制品和豆制品的微生物控制方面，其局限性日益显现。

焙烤食品是指以粮、油、糖、蛋、乳等为主料，添加适量辅料，并经调制、成型、焙烤工序制成的食品，常见的包括面包、饼干、糕点等。焙烤食品富含营养，微生物污染后有可能大量增殖引发疾病。焙烤食品引发的食物中毒事件的原因食物包括裱花蛋糕、夹心蛋糕、泡芙面包等，致病因子包括金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门菌等。目前对焙烤食品微生物污染的专门检测试剂盒和检测方法较少，为提高焙烤食品微生物检测精准度和速度特设计本申请的。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测多种食品微生物的引物探针组合、试剂盒以及方法，从而解决现有技术中缺乏能够快速有效同时检测大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)，本发明采用如下技术方案：

1.一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合，该引物探针组合包括：用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)的如SEQ ID NO：1-2所示的特异性引物对，如SEQIDNO：3所示的特异性探针；用于检测斯特菌(Listeria monocytogenes)的如SEQ ID NO：4-5所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：6所示的特异性探针；用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的如SEQ ID NO：7-8所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：9所示的特异性探针；用于检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的如SEQ ID NO：10-11所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：12所示的特异性探针；用于检测创伤弧菌(vibrio vulnificus)的如SEQID NO：13-14所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：15所示的特异性探针；以及用于检测副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的如SEQ ID NO：16-17所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：18所示的特异性探针。

优选地，所述特异性探针的5’端修饰的活性有机基团为氨基或羟基。

优选地，所述上游特异性引物的5’端修饰为生物素标记(如序列表SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16)。

优选地，所述特异性引物和探针的靶基因序列如序列表SEQ ID NO：19-24所示。

2.一种同时检测多种焙烤食品微生物的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的同时检测多种食品微生物的引物和探针组合。

优选地，其中12条特异性引物如SEQ ID NO.1-2，4-5，7-8，10-11，13-14，16-17所示；引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18。

3.一种食品微生物基因检测芯片，采用交联引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18所示的平面扫描芯片。

4.一种食品微生物基因检测芯片，采用交联引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18所示的微球探针芯片。

5.一种芯片扫描的食品微生物检测方法，包括：(1)芯片设计与制备，(2)细菌DNA特异性PCR扩增和杂交，(3)芯片杂交与扫描。

6.一种液相芯片检测微生物的方法，包括：(1)微球探针的交联，(2)探针杂交，(3)液相芯片检测。

有益效果：本发明针对大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)的基因序列，分别设计针对这六种特异性引物和特异性探针，采用多重PCR技术，实现对这六种食品体的快速有效同时检测，样品需求量小，提供了一种简单、快速、灵敏度高、易于推广的多种食品微生物的检测方法，并且该试剂盒成本低、适用范围广。本发明还利用液相芯片技术和扫描芯片技术，建立了能特异性检测大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)六种食品微生物检测方法，该检测方法能够对目标基因进行快速检测，其检测灵敏度达50拷贝/反应，特异性好。

附图说明

图1为特异性PCR扩增电泳图。其中1和7为大肠杆菌(Escherichia coli)、2和8为斯特菌(Listeria monocytogenes)、3和9为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、4和10为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、5和11为创伤弧菌(vibrio vulnificus)、6和12为副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)。1-6为单重PCR，7-12为多重PCR。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供引物及探针的制备方法，具体如下：

1.筛选靶序列

根据焙烤食品最常见的微生物确定大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)6种微生物为检测微生物。从GenBank下载全部6种微生物的全长序列，构建本地检索隐马尔可夫检索程序，筛选6种微生物基因组中同源性最低的区段。最终确定大肠杆菌(Escherichia coli)采用NC_025021.1如序列表SEQ ID No.19所示、斯特菌(Listeria monocytogenes)采用NC_003210.1如序列表SEQ ID No.20所示、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)采用NC_007795.1如序列表SEQ ID No.21所示、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)采用NZ_CP017060.1如序列表SEQ ID No.22所示、创伤弧菌(vibriovulnificus)采用NZ_CP016321.1如序列表SEQ ID No.23所示、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)采用NC_004603.1如序列表SEQ ID No.24所示，上述序列作为检测靶序列。

2.引物和探针设计

应用NCBI和Primer 5.0序列分析软件进行引物和探针设计，如下表所示，包括：SEQ ID NO：1-18，其中，引物SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16的5’带有生物素标记，探针的5’段均带有多聚T的长臂，同时进行氨基修饰，由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1引物及探针序列

实施例2

该实施例提供实施例1所述引物的扩增特异性检测方法，包括：

1.实验用6菌种为本实验是分离并保存，并采用上海生工试剂盒提取菌液DNA。

2.单对引物PCR反应液的配制配方为：分6管分别加入菌液DNA 10ng，10×buffer(Mg2+)2.5μL，dNTP(2.5mol/L)1.0μL，引物1.0μL，模板2.0μL，HotstarTaq 0.5U，补充ddH2O至25μL。

3.多重PCR反应液的配制配方为：分6管分别加入菌液DNA 10ng，10×buffer(Mg2+)2.5μL，dNTP(2.5mol/L)1.0μL，引物1.5μL(各引物浓度均为1.5)，模板2.0μL，HotstarTaq0.5U，补充ddH2O至25μL。

3.上述两种PCR扩增程序：95℃预变性10min，变性95℃30s，退火59.5℃30s，延伸72℃20s，35个循环，72℃4终止延伸1min。反应结束后，取5μL PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上行电泳检测。结果显示，分别采用单对引物、多重引物对检测目标区域参考品的扩增电泳结果清晰，扩增产物大小从1-6为单重PCR依次为大肠杆菌169bp、斯特菌152bp、金黄色葡萄球菌171bp、蜡样芽胞杆菌163bp、创伤弧菌155bp、副溶血性弧菌164bp，7-12为多重PCR依次为大肠杆菌169bp、斯特菌152bp、金黄色葡萄球菌171bp、蜡样芽胞杆菌163bp、创伤弧菌155bp、副溶血性弧菌164bp均与设计大小一致，引物特异性良好。

实施例3

该实施例提供采用芯片扫描的食品微生物检测方法，包括：

1.芯片设计与制备

采用Spot Array 72点样仪，美国Perkin Elmer的Scan Array Gx Plus扫描仪，美国Hoefer的UVC 5000紫外交联仪jinxin进行实验。寡核苷酸探针用40％二甲基亚砜(DMSO)溶解成40μmol/L后用于点样，每种样品重复点样3次，在每个矩阵顶端和底端均有阳性对照探针。点样后的芯片于湿盒放置5h，室温晾干后用紫外交联仪以600MJ/cm2交联2次。

2.细菌DNA特异性PCR扩增和杂交

按照实施例1所述6种细菌的标准方法进行接种、分离培养，采用天根(Tiangen)公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书提取基因组DNA。细菌DNA进行Klenow酶处理，取13μl基因组DNA，加入1μl表1中探针EcP、LmP、SaP、BcP、VvP、VpP(浓度为100μmol/L)，94℃变性3min，冰浴3min，加入dNTP Mixture(2.5mmol/L)2.5μl，Klenow酶(5U/μl)1μl，10×Klenow Buffer 2.5μl，纯化水5μl，37℃孵育1h，75℃20min使酶失活，处理后的模板取6μl用表1引物进行扩增(带F和R的引物)，在扩增过程中掺入aa-dUTP对PCR产物进行标记。扩增产物用QIA quick PCR产物纯化试剂盒纯化，加入已掺入aad UTP的阳性对照特异PCR产物，进行Cy3染料的偶联，反应完毕的产物经过纯化后用于芯片杂交。

3.芯片杂交与扫描

在芯片点样区域滴加预杂交液(6×SSC、5×Denhardt's、0.3％SDS、400μg/ml鲑精DNA、50％甲酰胺、200μg/ml酵母tRNA)，置于杂交盒中，42℃水浴中预杂交1h。取出芯片，蒸馏水中浸提20次，离心甩干。将扩增产物杂交混合液(3×SSC，5×Denhardt's，0.2％SDS，40％甲酰胺)加入探针区域，杂交盒在42℃水浴中过夜杂交。取出芯片，置于42℃预热的1.8×SSC，0.1％SDS摇洗5min，再依次在0.5×SSC，0.1％SDS、0.5×SSC中各摇洗5min，最后在95％乙醇中浸提10次，离心甩干。用Scan Array Gx Plus扫描仪进行扫描(532nm单色荧光通道，PMT 70％，分辨率10μm)，扫描图片用Gene Pix Pro 5.1软件分析探针信号值。阳性信号判断采用探针信号总强度值≥1.5倍背景强度值，即信噪比(signal noise ratio，SNR)≥1.5，同时荧光信号平均值>800或扫描图片上杂交斑点明显可见为判断标准。

结果显示：阳性信号探针均属于靶细菌位置,表明该芯片可用于细菌混合样本检测。同时采用平板计数发计算大肠杆菌(Escherichia coli)原始浓度为11.2×10⁸cfu/ml、斯特菌(Listeria monocytogenes)原始浓度为8.3×10⁸cfu/ml、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)原始浓度为6.5×10⁸cfu/ml、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)原始浓度为9.5×10⁸cfu/ml、创伤弧菌(vibrio vulnificus)原始浓度为6.4×10⁸cfu/ml、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)原始浓度为7.1×10⁸cfu/ml。

实施例4

该实施例提供采用微球交联液相分析的食品微生物检测方法，包括：

1.微球探针的交联

取中科雷鸣荧光微球100μL，5000rpm离心10min后弃上清，并用双蒸水洗涤2次；用100μL 0.1mol/L pH6.0的MES重新悬浮后，加入0.2nmol/μL的探针3μL，充分混匀后，加入15％EDC，37℃避光孵育30分钟；离心弃上清，用0.1％SDS洗涤3次后，用50μL TE缓冲液(pH8.0)重新悬浮后，4℃避光保存备用。

2.探针杂交

取PCR产物5μL，加入微球溶液25μL(每种微球按照1500个/25μL)，充分混合均匀后先94℃变性3min，然后再50℃孵育30min；接着加入SA-PE(浓度0.2μg/μL)60μL，继续孵育20min，将Luminex 200加热板加热到55℃，并调整至度数状态。孵育结束后直接上机读取信号。

探针特异性的检测按照每个反应25.0μL体系，将六种微球混合，对每一对单一引物进行杂交，检测探针的特异性。结果显示，混合的六种探针针对单对引物扩增片段能有效进行识别捕获，且每种探针对其余两种目的产物没有明显的非特异性杂交信号，其平均荧光强度(Medianfluorenscent intensity，MFI)均低于75。显示设计的探针序列针对六种扩增产物具有较好的特异性。

3.液相芯片检测

液相芯片检测体系的建立将特异性好的探针与多重PCR产物混匀杂交，设置仪器为同时检测6种荧光编码微球。采用建立的液相芯片法进行检测，在Luminex仪器中读取信号，计算每种特异性检测微球平均荧光强度(median fluorescent intensity，MFI)的均数和标准差，以均数+3倍标准差所得的值作为对应检测指标的cut-off值，确定阈值，高于cut-off值就视为阳性。

结果显示，阴性对照采用蒸馏水、引物DNA和阳性样品DNA(酵母)，经PCR扩增。所得到的PCR产物用于液相芯片的检测，用液相芯片法测得MFI的均数和标准差，计算阈值为65.24。用建立的液相芯片法进行杂交检测，采用10、50、100拷贝/反应，大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)进行液相芯片检测灵敏度分析，结果如表2所示。当样品浓度为50拷贝/反应时，

表2液相芯片检测灵敏度分析

特异性检测结果表明建立的液相芯片检测方法对大肠杆菌(Escherichia coli)、斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)有特异性杂交反应，均为阳性，表明该方法有良好的特异性。所建立的液相芯片检测体系的检测的灵敏度大致为50拷贝/反应。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

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<120>一种食品微生物检测的探针、芯片、试剂盒及方法

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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

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<213> 斯特菌（Listeria monocytogenes）

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1501 aaacacgtga ataagctatc ggtctaccaa ggtaaaaata tgcgtatctt gcgcgaagcc

1561 aaaacaccaa ttactacatg gtatcaattt agcattggtg gtaaagtaat tggttgggtc

1621 gatacccgag cacttaacac attctacaaa caaagcatgg aaaagccaac ccgtttaact

1681 cgttatgtca gcgccaataa agctggcgaa tcgtactata aagtcccggt agcagataat

1741 ccagtcaaaa ggggtacttt agccaagtat aaaaatcaaa agttaattgt tgattgtcaa

1801 gcaaccatcg aaggtcaact ttggtaccga ataaggacta gttccacttt cattggttgg

1861 acgaaagcag ctaatttaag ggcacagaaa taa

<210> 21

<211> 1551

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 21

1 ttgaaaaaga aaaacattta ttcaattcgt aaactaggtg taggtattgc atctgtaact

61 ttaggtacat tacttatatc tggtggcgta acacctgctg caaatgctgc gcaacacgat

121 gaagctcaac aaaatgcttt ttatcaagtc ttaaatatgc ctaacttaaa tgctgatcaa

181 cgcaatggtt ttatccaaag ccttaaagat gatccaagcc aaagtgctaa cgttttaggt

241 gaagctcaaa aacttaatga ctctcaagct ccaaaagctg atgcgcaaca aaataacttc

301 aacaaagatc aacaaagcgc cttctatgaa atcttgaaca tgcctaactt aaacgaagcg

361 caacgtaacg gcttcattca aagtcttaaa gacgacccaa gccaaagcac taacgtttta

421 ggtgaagcta aaaaattaaa cgaatctcaa gcaccgaaag ctgataacaa tttcaacaaa

481 gaacaacaaa atgctttcta tgaaatcttg aatatgccta acttaaacga agaacaacgc

541 aatggtttca tccaaagctt aaaagatgac ccaagccaaa gtgctaacct attgtcagaa

601 gctaaaaagt taaatgaatc tcaagcaccg aaagcggata acaaattcaa caaagaacaa

661 caaaatgctt tctatgaaat cttacattta cctaacttaa acgaagaaca acgcaatggt

721 ttcatccaaa gcctaaaaga tgacccaagc caaagcgcta accttttagc agaagctaaa

781 aagctaaatg atgctcaagc accaaaagct gacaacaaat tcaacaaaga acaacaaaat

841 gctttctatg aaattttaca tttacctaac ttaactgaag aacaacgtaa cggcttcatc

901 caaagcctta aagacgatcc ttcagtgagc aaagaaattt tagcagaagc taaaaagcta

961 aacgatgctc aagcaccaaa agaggaagac aataacaagc ctggcaaaga agacaataac

1021 aagcctggca aagaagacaa caacaagcct ggtaaagaag acaacaacaa gcctggtaaa

1081 gaagacaaca acaagcctgg caaagaagac ggcaacaagc ctggtaaaga agacaacaaa

1141 aaacctggta aagaagatgg caacaagcct ggtaaagaag acaacaaaaa acctggtaaa

1201 gaagacggca acaagcctgg caaagaagat ggcaacaaac ctggtaaaga agatggtaac

1261 ggagtacatg tcgttaaacc tggtgataca gtaaatgaca ttgcaaaagc aaacggcact

1321 actgctgaca aaattgctgc agataacaaa ttagctgata aaaacatgat caaacctggt

1381 caagaacttg ttgttgataa gaagcaacca gcaaaccatg cagatgctaa caaagctcaa

1441 gcattaccag aaactggtga agaaaatcca ttcatcggta caactgtatt tggtggatta

1501 tcattagcct taggtgcagc gttattagct ggacgtcgtc gcgaactata a

<210> 22

<211> 1416

<212> DNA

<213> 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）

<400> 22

1 atgaacaaaa taaaaatgag aaatttcttt aaaattagca tccttacttg tattacacta

61 gcaagtttaa gtacaccatc tactatttta gctgatagtc atccaggtta ctcctacgaa

121 tccaatatag ggtatcaaaa tccatcgtgg atgtcgaaaa tagaaggttc aacaaaaata

181 agtgaaatat ctattccagg gactcacggt acgatggctt tacatggagc gagttttctt

241 gatgaaaatt tgacaagaaa tcaaactatg agtttatccc aacaattaaa ttccggaatt

301 cgatatgtag atatgcgtgt taaacgtgta aaagattctt ttgcaatgta tcatggcgtt

361 gtaaatcaaa aagctgtgtt tgaagatgta ttaaaagaga ccattcaatt tttaaaagat

421 cacccaacag aaacaatatt aatgcgctta aaagaagaaa ctactcctga aagtggatct

481 ctatcatttg aggagatatt tttaaaatat aaaaacgtta atgcttcata tttttgggat

541 cctaattccg taccaacttc agatagaaat aaccctactt taggagatac ccgcgggaaa

601 attgtaatct tacaaaactt tacatccact caattgtacg ggattgatta cgaaggtttg

661 aatatacaag ataaatttga aattggaagc ggaccagacg aaatatatac aaaatggatt

721 gcgataaaaa accatctaca aaatacaaat actaatttta ataatggaaa aatttatctc

781 aaccatttta gtggtacggg gggcgcagcc gcatttttaa ataatgtata tccttggttt

841 gttgcaagcg gaaaagagag cagaaatact gacagtagtc ctaaattgat tcaaacgaat

901 tccactaatg cgtggagtga tttccctcgc gatagaaacg gacaagtata ctatgggggg

961 atgaatacac ttgggaccga actcttacaa caaggcgcaa ttaaacattc tggtatcatc

1021 gcagctgatt ttcccggtcc aggtttaatt gatagtatca ttaaattaaa tggtatacat

1081 tcaaatgaaa aggaaatatt aatttcacaa atatcatctg aatctagtcc tttatcaggg

1141 caacaaaatc gatccagcca aaactttaaa attgatagtt tacctgtagg taccaaagaa

1201 ttaaaatggg ttattgtgcc ttcagaaaaa gattatcctt ctactatttc tttcaatgta

1261 atgattgatg tttccctagg aatagattcc actcgttgga aaaatatttc acatgaatct

1321 aggactgaag cttacacaaa tactaaatat tatattgcaa gtccaattgg tgccactagc

1381 aaattcacag tgaaaatata cgctattaca aattag

<210> 23

<211> 720

<212> DNA

<213> 创伤弧菌（vibrio vulnificus）

<400> 23

1 atgcaagaga attttaaaat tttagtggtt gatgatgatg ctcgcttgcg tgcgttgttg

61 gagcgttatc tatcagagca aggtttccaa gtgcgcagtg tcgctaatgg agagcagatg

121 gatcgcctat tgacccgtga aaacttccac ttaatggtac tggatttaat gctgcctggt

181 gaagacggtc tttcgatttg tcgtcgtctg cgtaatgcca acaacatgtt gcctatcctg

241 atgctaacgg ccaaaggcga tgaagttgat cgcatcgttg gtttagaagt gggcgcggat

301 gactacctgc caaaaccgtt caacccacgt gagttacttg cgcgtattaa agcggtgttg

361 cgtcgtcaaa cgatcgagct gcctggtgca ccaagtgcgg aagagaaaat tgtcgagttt

421 ggtgagtttc gtctgaactt gggcacgcgt gagatgttcc gcggtgatga gccgatgcca

481 ctcacctcgg gtgaatttgc ggtactgaaa tcgctagtga ccaatgcgcg tgaaccgatg

541 tcgcgcgaca agttgatgaa catggcgcgc ggacgtgaat actccgcgat ggaacgttcc

601 attgacgtac aaatttctcg ccttcgtcgc atgttggaag aggacccaag caaacctcgc

661 tacatccaaa ctgtatgggg cttaggttat gtgtttgttc ctgatggcaa accagcttaa

<210> 24

<211> 1164

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus）

<400> 24

1 atgatcagtt ttggaaatgt gagtgcattg caagcggcga tgccacaagc tcgtaatgag

61 attctaaatg aaggcaaact cagcattggt ggtaaggaat atacgatcaa tgctgctact

121 caagagttta cacgcgcaaa ccctacaagt ggtgcagtcg cgcgcttctt tgaagctact

181 gggaaattat ttcgtgaagg cagcacgcag tctgtggcaa aagcgatcac aaaagcagtg

241 tttgacaacg aacagggaca agctcagcgt ttgcaaacat cgtcttctgt cgagcatggg

301 cagatgttgt ttaaagacgc gaacctcaaa acgccttcag atgttctgaa tgcgtttgcg

361 aagttggaca gcaaaatggt gaagtctcac gccgctgagc tgagccaact tgccgaacga

421 gccatgacag aagtgatgct agagacggat tctggcaaga acctcaaagc gctgattggt

481 gatgatgccg ttaagtcgct cgcggtgcgt gtggtgaaag attacggtgg tggcgtggcg

541 gctgctcaga aaaatccaga agtacgcatc aaccaaatgc aagctgtctt tgacatggag

601 gtgatgcacc taaaagcagc gcagcgacat attgaagggc tcgcaagtac ggatttaaac

661 caaggtgtgt atgcagaagg tcttcctgaa gacgctttca ataaagctgg cgtgacgaac

721 aatgttgaac gcgcagcggc ttggatcatc aacgcttcaa actcaaaagg gaacgatgcg

781 gaaaacatca cgtcattatt gaaagagtac gcgaccaacg gtaaagactt gctgaatatg

841 gacaacctaa aagagttgca tgctcgtttg gtaccaaatg tagaacgcga ttaccgtggg

901 ccaaatatct ctggtggcac attaccatct agtattggtg gggaaggcat gttgaagcaa

961 cacatcgaag gctttttgaa agagaatcca gttgcggaca aagacctcgg taaacattta

1021 tttgctggtg tgattggtta tcacggcttt accgatggca acggacgcat ggggcgcatg

1081 ctttatgcca tcgctgaact gcgtaatgac tcgttcaatc ctctggcgat gaatgctgaa

1141 aatagccttc acggtatcaa ataa

Claims

1.一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合，其特征在于所述引物探针组合包括：用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)的如SEQ ID NO：1-2所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：3所示的特异性探针；用于检测斯特菌(Listeria monocytogenes)的如SEQID NO：4-5所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：6所示的特异性探针；用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的如SEQ ID NO：7-8所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：9所示的特异性探针；用于检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的如SEQ ID NO：10-11所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：12所示的特异性探针；用于检测创伤弧菌(vibriovulnificus)的如SEQ ID NO：13-14所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：15所示的特异性探针；以及用于检测副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的如SEQ ID NO：16-17所示的特异性引物对，如SEQ ID NO：18所示的特异性探针。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合，其特征在于所述特异性探针的5’端修饰的活性有机基团为氨基或羟基。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合，其特征在于所述如序列表SEQ ID NO：1，5，7，10，13，16上游特异性引物的5’端修饰为生物素标记。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测多种焙烤食品微生物的引物和探针组合，其特征在于所述所述特异性引物和探针的靶基因序列如序列表SEQ ID NO：19-24所示。

5.一种同时检测多种焙烤食品微生物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性引物如SEQ ID NO.1-2，4-5，7-8，10-11，13-14，16-17所示；引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18。

6.一种芯片扫描的食品微生物检测方法，包括：(1)芯片设计与制备，(2)细菌DNA特异性PCR扩增和杂交，(3)芯片杂交与扫描。

7.一种液相芯片检测微生物的方法，包括：(1)微球探针的交联，(2)探针杂交，(3)液相芯片检测。

8.一种食品微生物基因检测芯片，采用交联引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18所示的平面扫描芯片。

9.一种食品微生物基因检测芯片，采用交联引物探针如序列表SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18所示的微球探针芯片。