CN101768636A

CN101768636A - 检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法

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Publication number: CN101768636A
Application number: CN200910076535A
Authority: CN
Inventors: 蔡剑平; 龚成; 吴丽娟; 杨辉; 胡继红
Original assignee: 蔡剑平
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2010-07-07
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: CN101768636B

Abstract

本发明涉及检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法，该组合物中可含有针对O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb-O1、O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb-O139和产生霍乱毒素的致病毒素基因ctxA的特异性引物。利用本发明的组合物或试剂盒，可快速鉴别样品中是否存在O1和/或O139群霍乱弧菌，同时检测其产生霍乱毒素的能力。本发明的组合物和试剂盒能够灵敏地检测出样品存在的产毒型O1和/或O139群霍乱弧菌，其检测敏感度为1.0×10²拷贝每反应体系。对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10^-1pg每反应体系，O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10⁰pg每反应体系。整个反应可在2小时内完成，并且在检测19种其他致病菌时不存在非特异性扩增。

Description

检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法，特别涉及产毒型霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio chlorae)引起的烈性肠道传染疾病，患者的临床症状常表现为大量米汤状排泄，造成迅速脱水。如不及时治疗，可导致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。目前人类历史上只有O1群和O139群霍乱弧菌引起过全球霍乱大流行(Kaper JB，Morris JG，Levine MM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev，1995，8：48-86)。因此1951年霍乱被WHO列为三种重大的流行病之一，中华人民共和国传染病法也将其列为甲类法定传染病。

研究发现，霍乱的强致病作用主要是因为霍乱弧菌分泌的霍乱毒素导致的腹泻所致。不管是早期发现的O1群还是后期出现的O139群霍乱弧菌，都含有霍乱毒素基因，具有产生霍乱毒素的能力，所以霍乱毒素的检测一直是霍乱弧菌致病性检测中的重要组成部分。霍乱毒素的检测不仅仅用于对现有致病性霍乱弧菌O1群和O139群的检测，还由于其与霍乱的流行和致病密切相关，而对于监测新的致病性霍乱弧菌菌株的出现具有重大意义。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以生化培养和血清学检测为主的传统的霍乱弧菌检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，一对特异性引物是其检测的特异性和敏感性的基础。所以，需要一种更加特异性的引物来更加准确地检测样品中霍乱弧菌产生霍乱毒素的能力。

此外，对于已知的致病性霍乱弧菌的检测，因为发现有一些非O139群也非O1群的霍乱弧菌也表达霍乱毒素CT，但是并不会引发霍乱的爆发。同时，在偶然情况下O1和O139群霍乱弧菌由于缺失ctx基因而不表达霍乱毒素，同时也不会引发霍乱的爆发。所以，要准确检测目前已知的致病性霍乱弧菌的存在需要同时检测两个指标：霍乱毒素CT和血清型指标(Chakraborty S，Mukhopadhyay AK，Bhadra RK，et al.Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae.Appl.Environ.Microbiol，2000，66：4022-4028)。

实际检测过程中，对于一个待测的样品，如果仅仅检测其中是否有O1群霍乱弧菌，或者相反，仅仅检测其中是否有O139群霍乱弧菌，并不能完全排除其致病性的危险。而分别进行两次检测的话，显然，其检测成本会大大升高。所以，还需要一种能够同时检测两种致病性霍乱弧菌是否存在的试剂和/或方法，以便在简化检测过程的同时节省检测成本。

发明内容

为了特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力，发明人针对霍乱毒素ctxA基因设计了特异性引物，经过预实验选择出其中特异性最好的一对，从而提供了一种特异性检测样品中菌株产生霍乱毒素的能力的组合物、试剂盒及其方法。

本发明的一个实施方式提供一种用于特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的组合物，其中包括下列引物：

上游引物：5′-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3′(序列号：1)，

下游引物：5′-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3′(序列号：2)。

利用该组合物，可以特异性地检测出样品中的菌株产生霍乱毒素的能力，除了可用于检测检测目前已知的致病性霍乱弧菌O1群和O139群外，还可以作为监测新的致病性霍乱弧菌的产生的重要指标的一部分。该组合物中还可以进一步包括探针：5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT(序列号：3)-荧光淬灭基团-3′，含有该探针的组合物可使用荧光实时PCR(real time PCR)来检测，其检测过程省去了后续的电泳等检测过程，使检测更加简便。其中所述荧光基团可为FAM，荧光淬灭基团可为ECLIPSE。

为了同时检测样品中是否含有O1群和O139群霍乱弧菌，来确定样品的致病性威胁，本发明还提供了一种除了包括上述引物外，还进一步包括针对O1群和O139群霍乱弧菌的O抗原编码基因rfb-O1和rfb-O139的特异性引物的组合物，该组合物中除了上述引物还包括下列引物：

rfb-O1引物：

上游引物：5′-ATATTgATCCgACAAgCCCAAATg-3′(序列号：4)，

下游引物：5′-CgATgTTgAggCgAAgTTTAgg-3′(序列号：5)；和

rfb-O139引物：

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′(序列号：7)，

下游引物：5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′(序列号：8)。利用该组合物，不仅可以检测样品中菌株产生霍乱毒素的能力，还可以在一次检测中就检测出其中的霍乱弧菌是O1群、O139群、二者都有、还是二者都不存在，可以基本彻底地确定该样品是否具有致病性。这大大简化了检测流程，节省了检测成本。该组合物中可进一步包括探针：5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，5′-荧光基团-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT(序列号：6)-荧光淬灭基团-3′，和5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA(序列号：9)-荧光淬灭基团-3′，并且在三个探针中分别使用不同的荧光基团。包括探针的该组合物可用于实时荧光PCR中，从而使检测不再需要后续的电泳等检测过程，而直接读取结果，更进一步地简化了检测过程，提高了检测效率。上述探针的三对荧光基团和荧光淬灭基团可以分别是：Cy5和BHQ、Tet和ECLIPSE、以及FAM和ECLIPSE。

本发明还提供了一种用于特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的试剂盒，其中包括PCR反应体系，和上述任一种组合物。优选所述PCR反应体系为实时定量PCR反应体系，其中优选使用TaqMan探针体系进行标记和检测。该试剂盒除了具有上述组合物所具有的效果之外，还由于所需试剂等的配套配置，更加方便了使用者的使用。

本发明进一步提供了一种特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的方法，该方法包括：提取样品中的细菌基因组DNA；使用上述的组合物中的任一种，或使用上述试剂盒中的任一种，用PCR法扩增所述细菌基因组DNA；对PCR反应的结果进行分析。可采用本领域技术人员根据所使用的引物等而确定的PCR反应条件，优选为：95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环，最后可选地在72±2℃下延伸超过2min。当上述PCR法为普通PCR时，其反应条件进一步优选为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃延伸1min，共反应40个循环，最后72℃延伸7min。当采用实时定量PCR法时，其条件进一步优选为：94℃预变性2min，94℃变性10s，60℃延伸30s，共反应45个循环。

上述PCR法中优选使用荧光实时定量PCR法检测。在上述荧光实时定量PCR中，优选使用TaqMan探针法。

本检测体系所检测标本无需活菌，在样品处理的第一步DNA提取的裂解过程中就可使霍乱弧菌迅速死亡，减少了对操作人员的生物危害。本方法无需增菌，整个反应在2小时内完成，大大节省了人力与时间，可用于快速检测。由于使用了上述组合物，该检测方法还具有上述组合物所能够达到的所有技术效果。

并且，利用本发明的一些优选实施方式，例如，如上所述同时使用上述三对引物进行PCR时，可以一次性地特异性检测出样品中的产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌的存在，从而可以一次性检测其致病危险性，如果三种基因的检测结果均为阴性(ctxA(-)/rfb-O1(-)/rfb-O139(-))，则可以一次性排除其致病性威胁。如果有一种存在，则可以一次区分下列几种情况：只有致病性O1群霍乱弧菌(ctxA(+)/rfb-O1(+)/rfb-O139(-))、只有致病性O139群霍乱弧菌(ctxA(+)/rfb-O1(-)/rfb-O139(+))、只有非致病性O1群霍乱弧菌(ctxA(-)/rfb-O1(+)/rfb-O139(-))、只有非致病性O139群霍乱弧菌(ctxA(-)/rfb-O1(-)/rfb-O139(+))、既有致病性O1群又有致病性O139群霍乱弧菌(ctxA(+)/rfb-O1(+)/rfb-O139(+))和含有能够产生霍乱毒素的非O1也非O139的霍乱弧菌。如果检测到最后一种情况的结果，则可将其用于进一步实验或检测，以便监测新型致病性霍乱弧菌的产生。

在更加优选的实施方式中，采用本发明所述的特异性探针，利用TaqMan实时荧光PCR技术进行检测，该方法除了上述效果，还由于自动化程度高，无需开盖检测产物，还减少了产物污染的机会。

利用本发明的组合物、试剂盒和/或方法对样品检测时，能够灵敏地检测出样品存在的产毒型O1和/或O139群霍乱弧菌，其检测敏感度为1.0×10²拷贝每反应体系。对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10^-1pg每反应体系，O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10⁰pg每反应体系。整个反应可在2小时内完成，并且在检测19种其他致病菌时不存在非特异性扩增。

附图说明

图1为普通PCR检测敏感度的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准，“-”为阴性对照，泳道“10⁰”～“10¹⁰”为每个PCR反应所加质粒DNA模板拷贝数分别为10⁰～10¹⁰拷贝每反应体系。

图2为三重实时荧光PCR检测敏感度的扩增曲线图，平滑线为ctxA荧光检测信号，标识“o”曲线为rfb-O1荧光检测信号，标识“*”曲线为rfb-O139荧光检测信号，由左到右每PCR反应的模板量分别为10⁹～10²拷贝质粒DNA；NTC信号线为阴性对照。

图3为普通三重PCR及实时荧光三重PCR检测体系对O1群霍乱弧菌基因组DNA的检测图，其中(A)M为分子标准，泳道“-”为阴性对照，泳道“10^-3”～“10⁵”为每个PCR反应所加基因组DNA模板数分别为1×10^-3pg至1×10⁵pg。(B)平滑线为为ctxA荧光检测信号，标识“o”曲线为rfb-O1荧光检测信号；由左到右每PCR反应所加的模板量分别为：10⁹拷贝质粒阳性对照(“+”)和1×10⁵pg至1×10^-1pg基因组DNA每反应体系(“10⁵”～“10^-1”)；NTC水平信号线为阴性对照。

图4为普通三重PCR及实时荧光三重PCR检测体系对O 139群霍乱弧菌基因组DNA的检测图。(A)M为分子标准，泳道“-”为阴性对照，泳道“10^-2”～“10⁵”为每个PCR反应所加基因组DNA模板数分别为1×10^-2pg至1×10⁵pg每反应体系。(B)平滑线为为ctxA荧光检测信号，标识“*”曲线为rfb-O139荧光检测信号；由左到右每PCR反应所加的模板量分别为：10⁹拷贝质粒阳性对照(“+”)和1×10⁵pg至1×10^-1pg基因组DNA每反应体系(“10⁵”～“10⁰”)；NTC水平信号线为阴性对照。

图5为实时荧光三重PCR检测体系对O1和O139群霍乱弧菌的特异性检测图。平滑线为ctxA为荧光检测信号，标识“o”曲线为rfb-O1荧光检测信号，标识“*”曲线rfb-O139荧光检测信号。(A)左侧“+”为10⁹拷贝质粒阳性对照，右为O1群霍乱弧菌1ng基因组DNA；水平信号线为阴性对照和19种阴性对照菌基因组DNA；(B)左侧“+”为10⁹拷贝质粒阳性对照，右为O139群霍乱弧菌1ng基因组DNA；水平信号线为阴性对照和19种阴性对照菌基因组DNA。

具体实施方式

为了特异性检测样品中菌株产生霍乱毒素的能力，发明人选择了霍乱毒素基因ctxA作为靶标序列，针对该基因设计了特异性引物，并经预实验选择了最具有特异性的一对引物(ctxA-F和ctxA-R，见下表1)用于本发明中。

在本发明的一个实施方式中，选择ctxA-F和ctxA-R作为特异性引物，用PCR方法检测样品中菌株产生霍乱毒素的能力。使用该方法，不但可特异性检测样品中菌株产生霍乱毒素的能力，而且在检测初期就通过裂解使样品中的菌株死亡，不会对实验操作人员造成威胁。优选使用荧光实时PCR法检测，省去了普通PCR的凝胶电泳等时间，使其检测和分析更加简便，缩短了检测的时间。更优选使用TaqMan技术标记的荧光实时PCR法，使用TaqMan技术时，其探针优选为ctxA-探针：5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCg TCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，该探针为针对该靶标序列特异性探针，增强了检测的特异性。其荧光基团和荧光淬灭基团可以分别是FAM和ECLIPSE。

同时，为了在检测样品中菌株产生霍乱毒素能力的同时检测其血清型，即检测其中致病性霍乱弧菌是否存在及其种类，发明人选择了O1和O139群霍乱弧菌的基因组O抗原编码基因rfb-O1和rfb-O139作为靶标序列，针对这两个基因设计了特异性引物，并经预实验选择了最具有特异性的引物(rfbO1-F和rfbO1-R，以及rfbO139-F和rfbO139-R，见下表1)用于本发明中。

在本发明的另一个实施方式中，同时采用上述三对引物rfbO1-F和rfbO1-R、rfbO139-F和rfbO139-R、以及ctxA-F和ctxA-R，用三重PCR的方法检测样品中是否存在O1或O139群霍乱弧菌，并判断其产生霍乱毒素的能力，还可检测出非O1非O139但产生霍乱毒素的菌株，有助于监测霍乱弧菌菌株的变异情况。使用该方法，在一次检测中既可以对霍乱弧菌进行分型检测，又能够判断该菌产生霍乱毒素的能力，可以更准确地特异性检测致病的产毒型O1和O139群霍乱弧菌，从而可以一次就完成样品的霍乱弧菌致病性的检测。优选采用荧光三重实时PCR法检测，更优选采用TaqMan技术标记，所使用的探针为：rfbO1-探针：5′-荧光基团-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-荧光淬灭基团-3′、rfbO139-探针：5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-荧光淬灭基团-3′、和ctxA-探针：5′-荧光基团-TCgTgCCTAAC AAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，其中的三个探针中使用不同的荧光基团。使用该方法，不仅可以准确地检测致病的产毒型O1群霍乱弧菌，而且其操作更加简便，在加入所需试剂开始反应后，不需再次开盖加样和取样，避免了污染的发生。其结果可以直接读出，而不需要后续的诸如凝胶电泳之类的操作，大大节省了检测的时间。而且，这三个探针均为针对相应基因设计的特异性探针，更加增强了其检测的特异性。其中所述荧光基团和荧光淬灭基团对可以分别是：Cy5和BHQ、Tet和ECLIPSE以及FAM和ECLIPSE。但是并不限于这三对荧光基团和荧光淬灭基团，本领域技术人员可以根据需要选择合适的荧光基团及其对应的荧光淬灭基团。

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。

引物和TaqMan探针的设计与合成

利用Genbank的Blast工具对O1群和O139群霍乱弧菌霍的主基因组O抗原编码基因序列和霍乱弧菌肠毒素A亚基的编码基因进行分析，选择其稳定的保守区域rfb-O1、rfb-O139和ctxA作为检测靶标序列，并针对这三个检测靶标序列设计引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中，ctxA基因的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记ELIPSE荧光淬灭基团；rfb-O1基因的检测探针5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ荧光淬灭基团；rfb-O139基因的检测探针5’端标记Tet荧光基团，3’端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。

表1引物及探针序列

检测菌种的准备

本实施例中所使用的O1和O139群霍乱弧菌灭活疫苗由国家生物制品检定所惠赠。19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌：致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、宋内志贺氏菌(Shigella snnei)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、肠炎耶尔森菌(Yersinia enteroxolitica)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、脑膜炎黄杆菌(Chromobacteriummeningosepticum)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter bauamnnii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、洋葱伯克霍德菌(Burkholderia cepacia)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)由卫生部临床检验中心微生物实验室提供。

实施例1采用普通PCR法的检测

细菌基因组DNA的抽提

抽提各细菌基因组DNA(TAKARA公司的MiniBEST试剂盒)。利用紫外分光光度计测定各细菌基因组DNA的纯度和浓度，O1和O139群霍乱弧菌基因组DNA用TE缓冲液稀释至1×10⁵pg/μl到1×10^-3pg/μl的梯度标准品，其余19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌的基因组DNA用TE缓冲液稀释至5×10⁴pg/μl，各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

质粒标准品的构建与制备

采用TA克隆技术构建目的质粒。在经过电泳确认扩增片段分子量后，将rfb-O1、rfb-O139和ctxA特异性序列的PCR产物连至pMD18-T载体(日本TaKaRa公司)上，重组阳性克隆培养后抽提质粒(Omega质粒提取试剂盒)，采用pMD18-T载体的RVM引物进行测序(美国Beckman Coulter公司试剂盒)，利用CEQ8000软件进行序列分析，并与原目的序列进行比对。序列完全正确的目的质粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度计)后，用1×TE(pH8.0)TE缓冲液稀释到10¹⁰拷贝/μl作为储存液，-20℃保存备用，使用时连续10倍稀释至浓度在1.0×10^-1拷贝/μl～1.0×10¹⁰拷贝/μl之间，取10μl标准品作为实时定量PCR的模板，使参加每个PCR反应的质粒数形成1个拷贝到10¹⁰拷贝的梯度分布。

普通三重PCR反应条件

普通三重PCR反应体系为25μl，取10×含镁的缓冲液2.5μl，dNTPs(各2.5mmol/L)2μl，25μmol/L引物各0.5μl(终浓度为500nM)，模板DNA 10.0μl，Blend Taq plus DNA聚合酶1.0U，加灭菌水至终体系25μl。PCR循环参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃延伸1min，共反应40个循环，最后72℃延伸7min。扩增后取5ul PCR产物在3.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后用溴化乙锭(EB)染色，并在凝胶成像系统上观察分析，结果见图1、图3A和图4A。

实施例2采用荧光实时定量PCR反应法检测

采用与实施例相同的细菌基因组DNA和质粒标准品，其区别在于所采用的PCR方法为荧光实时定量PCR，并且使用了上述设计并合成的三种探针。

实时荧光三重PCR反应条件

反应体系为25μl，取10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L各dNTP 2.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、5μmol/L探针各0.5μl、Blend Taq plus DNA聚合酶1U、模板DNA 10ul，加灭菌水至终体系25μl。PCR循环参数：94℃预变性2min，94℃变性10s，60℃延伸30s，共反应45个循环。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。

实施例1和2的检测体系的检测敏感度的评价

取质粒标准品每反应体系10⁰拷贝至10¹⁰拷贝，或以1×10^-3pg/μl到1×10⁵pg/μl梯度浓度的O1和O139群霍乱弧菌细菌基因组DNA为模板，评价了普通三重PCR与实时三重荧光TaqMan PCR检测体系的检测敏感性，结果参见图1～5。

实施例1中对质粒标准品的检测敏感度

三重质粒梯度稀释模板进行普通三重PCR扩增后电泳检测显示，当每反应体系中ctxA基因、rfb-O 1基因、rfb-O139基因的质粒DNA模板数降低至1.0×10¹及以下拷贝时，普通PCR反应后电泳图上未出现目的条带，阴性对照也未见扩增条带(图1)。

实施例2中对质粒标准品的检测敏感度

三质粒梯度稀释模板进行实时荧光PCR检测时显示，当反应体系ctxA基因、rfb-O1基因和rfb-O139的质粒DNA模板数为10²拷贝以上时，其荧光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，其检测范围是1.0×10²～1.0×10⁹拷贝每反应体系(图2)。三种标准品扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，rfb-O1相关性为0.999，扩增效率达到1.0，rfb-O139相关性为0.998，扩增效率达到1.0，ctxA相关性为0.999，扩增效率为0.97，重复实验结果稳定。

实施例1中对细菌基因组DNA的检测敏感度

将O1群霍乱弧菌基因组DNA梯度稀释到1×10⁵pg至1×10^-3pg每反应体系时普通三重PCR扩增后电泳检测显示，当基因组DNA梯度稀释至每反应体系1×10^-1pg时普通三重PCR反应后电泳图上未出现ctxA和rfb-O1目的扩增条带(图3A)。

将O139群霍乱弧菌基因组DNA梯度稀释至1×10⁵pg到1×10^-2pg进行普通三重PCR扩增后电泳检测显示，当基因组DNA稀释至1×10⁰pg及以下时普通三重PCR反应后电泳图上未出现ctxA和rfb-O139明亮的扩增条带(图4A)。

实施例2中对细菌基因组DNA的检测敏感度

用与实施例1相同梯度浓度的O1群霍乱弧菌基因组DNA进行荧光实时PCR检测时显示，在1.0×10^-1pg及以上时，其荧光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，该结果显示实时荧光三重PCR的检测敏感度比普通三重PCR的检测敏感度高10倍(图3B)。该三重检测体系中，被检测的两种靶基因扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，ctxA相关性为1，扩增效率为0.936；rfb-O1相关性为0.996，扩增效率达到0.9。

用与实施例1相同梯度浓度的O139群霍乱弧菌基因组DNA进行荧光实时PCR检测时，在1.0×10⁰pg以上时，其荧光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)(图4B)。该三重检测体系中，被检测的两种靶基因扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，ctxA相关性为0.997，扩增效率为1.02，rfb-O139相关性为0.999，扩增效率达到0.97。

检测特异性的评价

以上述19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌的基因组DNA为模板评价了三重TaqMan实时荧光PCR反应体系的特异性。

利用实施例2中所述的体系对O1群和O139群霍乱弧菌灭活疫苗基因组DNA的1×10³pg每反应体系进行检测时可见明确的扩增曲线，对上述19种非霍乱弧菌的病原菌基因组DNA的5×10⁵pg每反应体系进行检测时均未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的19种阴性对照菌之间不存在交叉反应。用已知浓度(1.0×10⁹/每反应体系)阳性质粒标准品和阴性对照进行盲检测，未出现假阳性和假阴性结果(图5)。

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如HEX、TAMRA、ROX、BHQ、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测样品中是否存在能够产生霍乱毒素的菌株，检测样品中是否存在产毒型O1群和/或O139群霍乱弧菌，从而可以判断样本的致病危险性。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。

序列表

<110>蔡剑平

<120>检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法

<130>DF10-081417

<160>9

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>atgccaagag gacagagtga gt 22

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tcaaactaat tgaggtggaa acatatcc 28

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tcgtgcctaa caaatcccgt ctgagttcct 30

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>atattgatcc gacaagccca aatg 24

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>cgatgttgag gcgaagttta gg 22

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>cgccgcaata cgagccccaa ggt 23

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tgatgttgtg ggataagcaa tctt 24

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>ctcagcaatg cggtggtcta 20

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>aacccgccct tctaatgaac acgcca 26

Claims

1.一种用于特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的组合物，其中包括下列引物：

上游引物：5′-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3′，

下游引物：5′-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3′。

2.如权利要求1所述的组合物，其中进一步包括探针：

5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

4.如权利要求1所述的组合物，其中进一步包括下列引物：

rfb-O1引物：

上游引物：5′-ATATTgATCCgACAAgCCCAAATg-3′，

下游引物：5′-CgATgTTgAggCgAAgTTTAgg-3′；和

rfb-O139引物：

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′，

下游引物：5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′。

5.如权利要求4所述的组合物，其中进一步包括探针：

5′-荧光基团-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-荧光淬灭基团-3′，

5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-荧光淬灭基团-3′，和

5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，并且在三个探针中分别使用不同的荧光基团。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述的三对荧光基团和荧光淬灭基团分别为：Cy5和BHQ、Tet和ECLIPSE、以及FAM和ECLIPSE。

7.一种用于特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的试剂盒，其中包括PCR反应体系，和权利要求1～6中任一项所述的组合物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述PCR反应体系为实时定量PCR反应体系。

9.一种特异性检测样品中的菌株产生霍乱毒素的能力的方法，包括：

提取样品中的细菌基因组DNA；

使用权利要求1～6中任一项所述的组合物，或使用权利要求7或8所述的试剂盒，用PCR法扩增所述细菌基因组DNA；

对PCR反应的结果进行分析。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述PCR法的反应条件为：

95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环，最后在72±2℃下延伸超过2min；或

95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环。