CN105603091A - 一种霍乱弧菌多重荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用 - Google Patents

一种霍乱弧菌多重荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒中含有包括霍乱弧菌溶血素基因检测引物及探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。

Description

一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。
背景技术
霍乱是一种烈性肠道传染病，是我国的法定报告传染病之一，病原体为霍乱弧菌(Vibriocholerae)。霍乱发病急骤，传播迅速，患者有剧烈的腹泻和呕吐症状，会导致脱水、休克等一系列严重的综合征，未及时确诊和治疗者死亡率较高。
目前，根据菌体抗原的不同，霍乱弧菌可分为210多个血清群，其中仅O1群和O139群会导致霍乱流行。O1群又分为古典生物型(Classicalbiotype)和埃尔托生物型(ElTorbiotype)。霍乱曾发生7次世界性大流行，前6次均由O1群古典生物型引起，而自1961年起发生的第7次世界性大流行则由O1群埃尔托生物型引起，波及140多个国家和地区，至今未见平息，近年来疫情还有所增加。O139群主要流行于亚洲。其他血清群的霍乱弧菌仅导致偶然的散发病例或聚餐引起的很小规模的爆发，统称为非O1/非O139群。霍乱弧菌的致病因素之一为霍乱毒素(choleratoxin，CT)，产生毒素的霍乱弧菌致病力强，能引起霍乱暴发和流行。而不产毒的O1群和O139群则不会引起大流行。因此，准确快速地鉴定霍乱弧菌的血清群类型和产毒能力对评价霍乱疫情风险，及时制定有效的防控策略有重要意义。
霍乱弧菌的传统检测方法有：细菌分离培养法、粪便涂片镜检法、生化特征检测法、血清学凝集分型法、噬菌体分型法等。虽然细菌培养、生化和血清学鉴定方法一度是实验室诊断霍乱弧菌的“金标准”，但传统的检测方法均存在周期长，工作量大，易受培养条件及操作人员经验等主客观因素影响等不足，不能满足疾病预防和控制快速反应体系的需要。近年来，分子生物学技术因其操作简单、灵敏度高、反馈快速、结果准确等优点，越来越广泛地应用于霍乱弧菌的检测和分型研究中。
在分子生物学检测方法中，普通的PCR法检测霍乱弧菌的灵敏度和特异性虽然很高，但每次只能检测一个基因，效率较低；用凝胶电泳对扩增产物进行分析时，容易造成交叉污染；电泳结果往往需要实验人员主观进行判断，准确度欠佳。相较而言，多重荧光PCR方法可在一次反应中检测多个基因，节约了时间和成本；用仪器来识别荧光信号，提高了检测灵敏度，降低了检测限，减少了人工误差；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，大大降低了样本间交叉污染的风险。
锁核酸(Lockednucleicacid，LNA)是新型的核酸类似物，它包含了2'-氧4'碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，能够提高引物/探针的杂交效率和稳定性；同时还可以提高目标序列杂交的特异性。使得由非所需激活的荧光背景大量减少，从而增大信号对背景噪音的比例，提高分辨度。与普通的Taqman探针相比，其双链在相同的盐溶液中，每增加一个单体LNA分子将导致其熔点提高8℃，这样强化后的杂交性能可以显著扩大实验检测的环境限制，即通过调整LNA碱基在探针序列中的位置来调节Tm值和杂交特异性。此外，由于LNA强化的杂交特征和对熔点温度的影响，含有LNA的实时定量PCR探针，长度较短，可以增加设计的灵活性，从而减少或消除普通DNA探针某些设计的局限或无法解决的问题。
发明内容
针对传统检测手段中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒及其制备与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括霍乱弧菌溶血素基因检测引物及探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物及探针，所述霍乱弧菌溶血素基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，霍乱弧菌溶血素基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的下游引物，所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；所述霍乱弧菌肠毒素基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的下游引物，所述霍乱弧菌肠毒素基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针和霍乱弧菌肠毒素基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针和霍乱弧菌肠毒素基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步优选地，所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
进一步优选地，所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
进一步优选地，所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
进一步优选地，所述霍乱弧菌肠毒素基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CalRed610荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-2。
本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行霍乱弧菌溶血素基因、霍乱弧菌O1群抗原基因、霍乱弧菌O139群抗原基因、霍乱弧菌肠毒素基因的检测，根据扩增及检测情况可分析判断霍乱弧菌感染情况、并对所感染霍乱弧菌进行准确分型、鉴定致病毒力基因。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。
基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、无菌水(ddH2O)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。
所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、无菌水(ddH2O)。加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得PCR反应体系。
所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有霍乱弧菌溶血素、霍乱弧菌O1、O139群特异性抗原和肠毒素基因上特异性扩增片段的质粒。
所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等。
本发明的第二方面，提供了前述霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述霍乱弧菌多重荧光PCR检测引物及探针；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
优选地，步骤(2)中，各反应管中，PCR反应体系的体积为25ul，含样品基因组DNA4ul，多重荧光PCR检测混合液18ul，TaqDNA聚合酶0.4ul，无菌水(ddH2O)补足至25ul。
优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：①94℃2min；②93℃5sec；③60℃30sec；步骤②-③循环40次。
本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备霍乱弧菌检测产品中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用多重荧光PCR法，设计了霍乱弧菌溶血素基因检测引物及探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物及探针，可以在单个PCR反应管中同时检测4个基因，在检测霍乱弧菌的存在并进行准确分型的同时鉴定其是否具有致病的毒力基因，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断霍乱弧菌的类型和致病性提供了有力工具。
本发明所采用的荧光PCR检测方法灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，所用引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异性好；操作简便，无需对PCR产物进行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行，全程处于封闭状态，大大降低了样本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对粪便、水体和食物样品进行检测，无需富集培养。
附图说明
图1：本发明试剂盒灵敏度检测结果(以溶血素基因为例)，不同浓度的待检阳性对照样品(1×106copy/ml～1×103copy/ml)均能被很好地检测到。
图2：阳性对照品检测结果，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右，第三条曲线)、霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右，第四条曲线)、霍乱弧菌O139群抗原基因(从左自右，第二条曲线)以及霍乱弧菌肠毒素基因(从左自右，第一条曲线)均能很好地检测到，说明实验过程无误，检测系统正常；检测结果准确。
图3：阴性对照检测结果：40个循环后，所有的荧光曲线均在阈值以下，说明实验过程没有外来DNA污染。
图4：3号霍乱弧菌样本检测结果显示，只有霍乱弧菌溶血素基因检测结果为阳性，说明此样本为非O1非139群且不产毒的霍乱弧菌感染。
图5：4号霍乱弧菌样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第一条曲线)和霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右第二条曲线)的检测结果都为阳性，但霍乱弧菌肠毒素基因检测结果为阴性，说明此样本为一不携带霍乱弧菌肠毒素基因的O1群霍乱弧菌感染。
图6：5号样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第二条曲线)、霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右第一条曲线)以及霍乱弧菌肠毒素基因(从左自右第三条曲线)均为阳性，说明此样本为携带霍乱弧菌肠毒素基因的O1群霍乱弧菌感染。
图7：6号样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第一条曲线)、和霍乱弧菌O139群抗原基因(从左自右第二条曲线)检测结果为阳性，说明此样本为一不携带霍乱弧菌肠毒素基因的O139群霍乱弧菌感染。
图8：样本1为阴性，无霍乱弧菌感染；样本2为霍乱弧菌阳性，非O1，非O139群，不产肠毒素；样本3为阴性，无霍乱弧菌感染；样本4为霍乱弧菌阳性(从左自右，第二条曲线)，O1群(从左自右，第一条曲线)，不产肠毒素；样本5为霍乱弧菌阳性(从左自右，第一条曲线)，O139群(从左自右，第二条曲线)，不产肠毒素；样本6为霍乱弧菌阳性(从左自右，第一条曲线)，O139群(从左自右，第二条曲线)，不产肠毒素。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1试剂盒的制备
分别合成霍乱弧菌溶血素基因检测引物及探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物及探针，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合配成多重荧光PCR检测混合液。所述多重荧光PCR检测混合液中，上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可以是含有配置好的含有各组引物对及探针的多重荧光PCR检测混合液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、无菌水(ddH2O)、样品基因组DNA提取试剂等试剂。
实施例2试剂盒的灵敏度评价
实验目的：确定本发明(实施例1)多重荧光PCR试剂盒的检出限(最低检测浓度)
实验方法：
1.阳性对照品的准备：
构建含有霍乱弧菌溶血素、霍乱弧菌O1、O139群特异性抗原和肠毒素基因上特异性扩增片段的pMD8质粒作为阳性对照品。所述pMD8质粒上连接了霍乱弧菌溶血素基因检测引物、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物这4组引物的扩增子片段，可以被上述的4种引物和探针共同识别。经测序验证，阳性质粒构建成功。
其中，霍乱弧菌溶血素基因扩增子片段的核苷酸序列如SEQIDNO.13，具体为：
TGTCGATAACATTAACGAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTTCAGGTTTTGAGCTTGGGGTGACTGGTGGGGTTGAAGTCAGTGGAGATGGCCCGAAAGCTAAACTGGAGG。
霍乱弧菌O1群抗原基因扩增子片段的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，具体为：GTCAGAGAAGGTGGATAAAATTACCTTTAATCGAGATATCGCCTCAGTATTGGGTATTTCTCCTGATGATGTTGTGGATATCTATGGTTTCACTGAACAGATGG。
霍乱弧菌O139群抗原基因扩增子片段的核苷酸序列如EQIDNO.15所示，具体为：GGGTTGATGATGACTTTGGTGTCTGTTTAGCGCACGCACGCTTATCAATACAGGATTTAAGTTCAGCTGGGCATCAGCCGATGCATTCAAAATCTGAGCGCTATGTTATGATTTTTAATGGTGAAATATACAATCATTTAACATTGCGTGAAGA。
霍乱弧菌肠毒素基因扩增子片段的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，具体为：GGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAA。
取1×106copy/ml的阳性质粒作为阳性对照品，分为4份，分别按1、10、100、1000的比例做梯度稀释，最终获得待检阳性对照样品S1、S2、S3、S4，浓度分别为1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml。
2.PCR扩增反应
首先，配置多重荧光PCR检测混合液，具体组成成分及含量可如下表2所示：
表2
成分 含量
PCR buffer(10×) 2.5ul
MgCl2(25mM) 2.5ul
四种引物(20uM) 0.5ul(×8)
四种探针(20uM) 0.3ul(×4)
dNTP(10mM each) 0.8ul
ddH2O 补足至18ul
总计 18ul
然后，配制PCR反应体系，如下表3所示：
表3
成分 用量
多重荧光PCR检测混合液 18ul
Taq DNA聚合酶 0.4ul
不同浓度阳性质粒 4ul
ddH2O 2.6ul
共 25ul
此次灵敏度检测共设4个浓度梯度，对应上述待检阳性对照样品S1、S2、S3、S4，加阴性对照(ddH2O)一管，共进行5个PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液5×18ul，TaqDNA聚合酶5×0.4ul，ddH2O5×2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于5个PCR反应管中。然后向1～4号管中分别加入4ul浓度依次为1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml的待检阳性对照样品S1、S2、S3、S4，最后向5号管中加入4ulddH2O作为阴性对照。
3.PCR反应
此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，按说明书中推荐的参数将反应条件设置为：
①94℃2min
②93℃5sec
③60℃30sec(进行单点荧光检测)
步骤②-③循环40次。
4.结果分析
以霍乱弧菌溶血素基因为例，不同浓度待检阳性对照样品中霍乱弧菌溶血素基因检测结果如图1所示。
各样品的CT值如下表4所示：
表4
样品编号 样品浓度 CT值
1 1×106copy/ml 18.29
2 1×105copy/ml 21.79
3 1×104copy/ml 25.29
4 1×103copy/ml 28.69
该实验结果表明：不同浓度的待检阳性对照样品S1～S4在荧光检测过程中均为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1×103copy/ml。
实施例3试剂盒检测结果特异性评价
实验目的：选取已经过Sanger法测序验证的霍乱弧菌样本核酸提取液，以检验多重荧光PCR检测结果的特异性及可靠程度。
实验方法：
1.样本处理：从标本库中选取不同类型样本的核酸提取液，室温下解冻后取4ul用于后续实验。
粪便样本：挑取米粒大小的粪便，放入已预先加入0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，13000rpm离心2分钟，去尽上清；向沉淀中加入100ul试剂盒中提供的核酸抽提液，充分混匀。沸水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清即为样本核酸提取液，可直接用于PCR反应或置于-20℃保存备用。
水样本：取水样3ml，13000rpm离心2分钟，弃去上清；向沉淀中加入100ul试剂盒中提供的核酸抽提液，充分混匀。沸水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清即为样本核酸提取液，可直接用于PCR反应或置于-20℃保存。
食物样本：取可疑食物1g，放于已预先加入1ml生理盐水的离心管中，颠倒混匀后静置2min，将上清转移到另一洁净的离心管中，13000rpm离心2分钟，弃上清，向沉淀中加入100ul试剂盒中提供的核酸抽提液，充分混匀。沸水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清即为样本核酸提取液，可直接用于PCR反应或置于-20℃保存备用。
2.配制PCR反应体系，如下表5所示：
表5
成分 用量
多重荧光PCR检测混合液(同实施例2) 18ul
Taq DNA聚合酶 0.4ul
霍乱弧菌核酸提取液 4ul
ddH2O 2.6ul
共 25ul
此次选取不同类型的样本共4个，加阴性对照/阳性对照反应各一，共需进行6管PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液6×18ul，TaqDNA聚合酶6×0.4ul，ddH2O6×2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于6个PCR反应管中，最后向1号管中加入2ul阳性对照品(同实施例2中的阳性对照品，浓度为1×106copy/ml)和2ulddH2O，2号管中仅加入4ulddH2O作为阴性对照，3～6号管中分别加入不同类型样本的霍乱弧菌核酸提取液。立即盖紧管盖，做好标记，准备进行PCR反应。
3.PCR扩增
此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，按上述推荐的参数将反应条件设置为：
①94℃2min
②93℃5sec
③60℃30sec(进行单点荧光检测)
步骤②-③循环40次。
阈值设定原则为：阈值线刚好超过阴性对照(ddH2O)的最高点。
4.结果分析：
阳性对照品检测结果如附图2所示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右，第三条曲线)、霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右，第四条曲线)、霍乱弧菌O139群抗原基因(从左自右，第二条曲线)以及霍乱弧菌肠毒素基因(从左自右，第一条曲线)均能很好地检测到，说明实验过程无误，检测系统正常；本发明的检测试剂盒检测准确。
阴性对照品检测结果如图3所示，40个循环后，所有的荧光曲线均在阈值以下，说明实验过程没有外来DNA污染。
其余各样本的检测结果曲线见图4～7。
如图4所示，3号霍乱弧菌样本检测结果显示，只有霍乱弧菌溶血素基因检测结果为阳性，说明此样本为非O1非139群且不产毒的霍乱弧菌感染。
如图5所示，4号霍乱弧菌样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第一条曲线)和霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右第二条曲线)的检测结果都为阳性，但霍乱弧菌肠毒素基因检测结果为阴性，说明此样本为一不携带霍乱弧菌肠毒素基因的O1群霍乱弧菌感染。
如图6所示，5号样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第二条曲线)、霍乱弧菌O1群抗原基因(从左自右第一条曲线)以及霍乱弧菌肠毒素基因(从左自右第三条曲线)均为阳性，说明此样本为携带霍乱弧菌肠毒素基因的O1群霍乱弧菌感染。
如图7所示，6号样本检测结果显示，霍乱弧菌溶血素基因(从左自右第一条曲线)、和霍乱弧菌O139群抗原基因(从左自右第二条曲线)检测结果为阳性，说明此样本为一不携带霍乱弧菌肠毒素基因的O139群霍乱弧菌感染。
上述4个样本均经由传统检测方法(Sanger测序法)复检，所有样本的多重荧光PCR检测结果均与传统检测方法(Sanger测序法)所得结果相一致，说明本发明多重荧光PCR法没有漏检或误检，其准确度和特异性都很好，均高达100％。
实施例4试剂盒检测粪便样本的效果评价
实验方法：
1.样本处理：
从每份粪便样本中挑取米粒大小的颗粒，置于预先加入0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，13000rpm离心2分钟，去尽上清；向沉淀中加入100ul试剂盒中提供的核酸抽提液，充分混匀。沸水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，取上清(即核酸抽提物)。取4ul直接用于PCR扩增，其余放-20℃冰箱保存。
2.配制PCR反应体系，如下表6所示：
表6
此次选取不同类型的样本共6个，加阴性对照/阳性对照反应各一，共需进行8管PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液8×18ul，TaqDNA聚合酶8×0.4ul，ddH2O8×2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于8个PCR反应管中，最后向1号管中加入2ul阳性对照品(同实施例2中的阳性对照品，浓度为1×106copy/ml)和2ulddH2O，2号管中仅加入4ulddH2O作为阴性对照，3～8号管中分别加入不同样本的核酸抽提物。立即盖紧管盖，做好标记，进行PCR反应。
3.PCR扩增
此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，按上述推荐的参数将反应条件设置为：
①94℃2min
②93℃5sec
③60℃30sec(进行单点荧光检测)
步骤②-③循环40次
阈值设定原则为：阈值线刚好超过阴性对照(ddH2O)的最高点。
4.结果分析：
实验结果如下表7及图8所示：
表7
样本编号 检测结果
1 阴性
2 霍乱弧菌阳性，非O1，非O139群，不产肠毒素
3 阴性
4 霍乱弧菌阳性，O1群，不产肠毒素
5 霍乱弧菌阳性，O139群，不产肠毒素
6 霍乱弧菌阳性，O139群，不产肠毒素
具体的，如图8所示，样本1为阴性，无霍乱弧菌感染；样本2为霍乱弧菌阳性，非O1，非O139群，不产肠毒素；样本3为阴性，无霍乱弧菌感染；样本4为霍乱弧菌阳性(从左自右，第二条曲线)，O1群(从左自右，第一条曲线)，不产肠毒素；样本5为霍乱弧菌阳性(从左自右，第一条曲线)，O139群(从左自右，第二条曲线)，不产肠毒素；样本6为霍乱弧菌阳性(从左自右，第一条曲线)，O139群(从左自右，第二条曲线)，不产肠毒素。
综上所述，在所检的6例样本中，有2例为霍乱弧菌阴性，1例为非O1非O139型霍乱弧菌而且不产毒素，1例O1群霍乱弧菌不产毒，2例O139型不产毒。所有阳性结果均经Sanger测序验证无误。可见，本发明提供的试剂盒检测结果稳定可靠，阳性率及正确率高达100％，可以用于粪便样本的直接检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括霍乱弧菌溶血素基因检测引物及探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物及探针、霍乱弧菌肠毒素基因检测引物及探针，所述霍乱弧菌溶血素基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，霍乱弧菌溶血素基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的下游引物，所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；所述霍乱弧菌肠毒素基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的下游引物，所述霍乱弧菌肠毒素基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针和霍乱弧菌肠毒素基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针、霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针、霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针和霍乱弧菌肠毒素基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述霍乱弧菌溶血素基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
4.根据权利要求2所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述霍乱弧菌O1群抗原基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
5.根据权利要求2所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述霍乱弧菌O139群抗原基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
6.根据权利要求2所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述霍乱弧菌肠毒素基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CalRed610荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-2。
7.根据权利要求1所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、无菌水(ddH2O)中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
9.如权利要求1～8任一权利要求所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有如权利要求1～5任一权利要求所述霍乱弧菌多重荧光PCR检测引物及探针；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
10.如权利要求1～8任一权利要求所述的霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒在制备霍乱弧菌检测产品中的用途。
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