CN104726581A - 一种可避免假阴性检测结果的副溶血弧菌恒温检测引物组、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种可避免假阴性检测结果的副溶血弧菌恒温检测引物组、检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌的恒温检测引物组、试剂盒及检测方法。包含检测引物组及内标引物组。所述检测引物组是根据副溶血弧菌VPtlh基因设计的，其序列如SEQ ID NO.1-6所示；所述内标引物组是根据副溶血弧菌VPgyrB基因设计的，其序列如SEQ ID NO.7-12所示。除了上述引物组外，所述副溶血性弧菌的恒温检测试剂盒中还包括：DNA聚合酶、LAMP反应/、内标靶标片、阳性对照和阴性对照。本发明的检测引物、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、适合现场检测等优点，并且可有效防止假阴性的发生，适于推广应用。

Description

一种可避免假阴性检测结果的副溶血弧菌恒温检测引物组、检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种副溶血性弧菌的恒温检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
副溶血弧菌（Bibrio Parahemolyticus）属于非霍乱弧菌，是最常见的食源性细菌病原体，在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血弧菌污染。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。
传统的副溶血弧菌检测方法是一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原，虽然可靠，但却很费力、耗时，常常需要4-7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。
为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法, 并在实践检验中不断取得新进展。
以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高和但特异性差；以核酸为基础的PCR技术及恒温扩增技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于副溶血弧菌检测。但检测样品复杂，因目前检测方法对假阴性的检测结果没有采取监控手段，故存在漏检的可能，但副溶血弧菌危害严重，漏检造成的危害无法估量，此外，PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的副溶血弧菌检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。恒温扩增技术具有检测时间短，易于操作等优点，本发明在恒温扩增技术基础上加入内标基因，可提供一种有效鉴别检测结果为假阴性检测方法，有利于食品中副溶血弧菌的准确、及时发现，更加有利于恒温检测方法在检测中的推广应用及提高检测的准确度。
本发明在样品管检测的时候同时设立一个内标基因检测管，该内标检测管及检测方法具有以下特点：1）内标基因与实际样品的检测不在同一管中进行检测，2）该内标基因的扩增靶标与样品检测管中的扩增靶标不同，3）内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标靶标片段，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于检测副溶血性弧菌的LAMP引物组合物。
本发明的另一个目的在于提供一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒
本发明的另一个目的在于提供一种副溶血性弧菌的LAMP检测方法
本发明所采取的技术方案是：
用于检测副溶血性弧菌的LAMP引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPtlh-F3：5’-TGATTCGTTTGACGGACG-3’；
VPtlh-B3：5’-GAACAAGGCGTGAGTATCAA-3’；
VPtlh-FIP：5’-ACTTAAACTGAGGCGCTTTCGTAGGTGCGAAGAACTTCATG-3’；
VPtlh-BIP：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATTGATGTCGTAACCTTGCG-3’；
VPtlh-LF：5’-CGTCTGGCAGTGTCATCA-3’；
VPtlh-LB：5’-GGCTCAAGCGATGTACTACA-3’；
所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPgyrB-F3：5’-GTTTGACAGCCGTTGTTTC-3’；
VPgyrB-B3：5’-GTAGGCCTGCTAGGTCTAG-3’；
VPgyrB-FIP：5’-ATCTTCGCTTCGCTTGGGTTAGTGAAATCAGCGGTTGAG-3’；
VPgyrB-BIP：5’-CGAAAATCATCGATGCAGCACGCACCTTTACGACGAGTCATT；
VPgyrB-LoopF：5’-TTCGACCAAGAACTCAGATAGC-3’；
VPgyrB-LoopB：5’-GTGAAGCTGCACGTAAAGC-3’。
一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括如上所述的检测引物组和内标引物组。
作为优选的，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒中还包括以下成分：（1）LAMP反应液；（2）DNA聚合酶；（3）内标靶标片段；（4）阳性对照和阴性对照。
所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
所述阳性对照为含有副溶血弧菌VPtlh基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有副溶血弧菌VPgyrB基因片段的T载体克隆。
一种副溶血性弧菌的LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用权利要求1的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温扩增；
（3）结果判断：将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据VPtlh基因检测结果和内标基因VPgyrB检测结果进行判断：
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
LAMP恒温PCR扩增的25μl反应体系含有：VPtlh-F3 0.2μM，VPtlh-B3 0.2μM，VPtlh-FIP 1.6μM，VPtlh-BIP 1.6μM，VPtlh-LF 0.8μM，VPtlh-LB 0.8μM，VPgyrB-F3 0.2μM，VPgyrB-B3 0.2μM，VPgyrB-FIP 1.6μM，VPgyrB-BIP 1.6μM，VPgyrB-LoopF 0.8μM，VPgyrB-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检样品2μl ，内标2μl，用超纯水补齐到25μl。
LAMP恒温PCR扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
本发明的有益效果是：
本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故。
（1）快速高效：整个扩增只用30～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据副溶血弧菌VPtlh基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10 fg/μl；
（5）鉴定简便：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
（6）提高检测的准确性：本发明的检测试剂盒内含内标基因，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的检测结果为假阴性的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的LAMP检测方法，提高检测的准确性。
附图说明
图1副溶血弧菌内标基因的最低检出限为10 fg/μl；
图2副溶血弧菌内标基因的最低检出限为10 fg/μl的复核；
图3 副溶血弧菌VPtlh基因最低检出限2.4×103 CFU/mL ；
图4 特异性实验，对单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、创伤弧菌、、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌无非特异性扩增；
图5无抑制因子的实际样品检测；
图6有抑制因子的实际样品检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 副溶血弧菌LAMP检测试剂盒的建立
副溶血弧菌的LAMP-PCR 检测试剂盒，包括检测引物组、内标引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和内标。
（1）检测引物组：以副溶血弧菌VPtlh基因为靶基因，进行LAMP引物的设计，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPtlh-F3：5’-TGATTCGTTTGACGGACG-3’（SEQ ID NO.1）；
VPtlh-B3：5’-GAACAAGGCGTGAGTATCAA-3’ （SEQ ID NO.2）；
VPtlh-FIP：5’-ACTTAAACTGAGGCGCTTTCGTAGGTGCGAAGAACTTCATG-3’ （SEQ ID NO.3）；
VPtlh-BIP：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATTGATGTCGTAACCTTGCG-3’ （SEQ ID NO.4）；
VPtlh-LF：5’-CGTCTGGCAGTGTCATCA-3’（SEQ ID NO.5）；
VPtlh-LB：5’-GGCTCAAGCGATGTACTACA-3’（SEQ ID NO.6）；
（2）内标引物组：以副溶血弧菌VPgyrB基因为内标基因，进行LAMP引物的设计，所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPgyrB-F3：5’-GTTTGACAGCCGTTGTTTC-3’（SEQ ID NO.7）；
VPgyrB-B3：5’-GTAGGCCTGCTAGGTCTAG-3’（SEQ ID NO.8）；
VPgyrB-FIP：5’-ATCTTCGCTTCGCTTGGGTTAGTGAAATCAGCGGTTGAG-3’（SEQ ID NO.9）；
VPgyrB-BIP：5’-CGAAAATCATCGATGCAGCACGCACCTTTACGACGAGTCATT（SEQ ID NO.10）；
VPgyrB-LoopF：5’-TTCGACCAAGAACTCAGATAGC-3’（SEQ ID NO.11）；
VPgyrB-LoopB：5’-GTGAAGCTGCACGTAAAGC-3’（SEQ ID NO.12）。
（3）LAMP反应液：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
（4）阳性对照为含有副溶血弧菌VPtlh基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的副溶血弧菌为模板，利用的VPtlh外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）进行扩增，所得VPtlh基因扩增片段序列如SEQ ID NO:13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
（5）内标为含有gyrB基因部分片段的T载体克隆，以分离鉴定的副溶血弧菌为模板，利用gyrB外引物（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）进行扩增，所得gyrB基因扩增片段序列如SEQ ID NO:14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为内标。
（6）阴性对照为超纯水。
实施例2副溶血弧菌的LAMP检测方法
利用实施例1的副溶血弧菌的LAMP检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：
（1）提取待检样品DNA。
（2）利用权利要求1的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温扩增：
LAMP恒温扩增的25μl反应体系含有：VPtlh-F3 0.2μM，VPtlh-B3 0.2μM，VPtlh-FIP 1.6μM，VPtlh-BIP 1.6μM，VPtlh-LF 0.8μM，VPtlh-LB 0.8μM，VPgyrB-F3 0.2μM，VPgyrB-B3 0.2μM，VPgyrB-FIP 1.6μM，VPgyrB-BIP 1.6μM，VPgyrB-LoopF 0.8μM，VPgyrB-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检样品2μl ，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；
LAMP恒温扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
（3）结果判断：将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据VPtlh基因检测结果和内标基因VPgyrB检测结果进行判断：
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
实施例3灵敏度实验
将构建的质粒进行灵敏度实验， 将1 pg/μl质粒以10倍梯度稀释为1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl四个梯度作为质控标准，用实施例2的方法进行检测，通过灵敏度实验确定内标基因的最低检出限10 fg/μl（如图1所示），并对最低检出限予以复核（图2），将内标浓度定为最低检出限的浓度。
将培养的副溶血弧菌进行培养，将培养后的菌进行10倍梯度稀释，提取DNA，同时将稀释的菌液进行平板培养计数，将平板培养计数结果与本试剂盒的最低灵敏度进行对比，本试剂盒的最低检出度为2.4×103 CFU/mL，检测结果见图3。
实施例4 特异性实验
用实施例2的方法分别对培养的单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、创伤弧菌、、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌进行检测，结果显示阳性对照及内标基因扩增正常，单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌均无扩增。
实施例5 实际样品检测
取不含抑制因子的样品及不含抑制因子的样品同时进行实验，并增加灵敏度实验予以辅助判断结果，检测方法及结果如下：
1待检样品DNA的提取：
1）取副溶血弧菌及含有EDTA抑制因子的副溶血弧菌菌液1-2 ml，12000 rpm 离心5 min，弃上清；
2）加入500 μl 0.8% NaCl水溶液或医用生理盐水，12000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液；
3）沉淀中加入100 μl DNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10 min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10 min；
4）12000 rpm离心2 min，将上清转移至新的离心管中备用（2 μl上清用于核酸扩增）。
2、恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：VPtlh-F3 0.2μM，VPtlh-B3 0.2μM，VPtlh-FIP 1.6μM，VPtlh-BIP 1.6μM，VPtlh-LF 0.8μM，VPtlh-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检2μl g，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（3） 恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：VPgyrB-F3 0.2μM，VPgyrB-B3 0.2μM，VPgyrB-FIP 1.6μM，VPgyrB-BIP 1.6μM，VPgyrB-LoopF 0.8μM，VPgyrB-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检样品2μl，内标基因2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（4）结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪（如ABI 7500）中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据VPtlh基因检测结果和内标基因VPgyrB检测结果进行判断。
检测结果见图5（为不含抑制因子的样品检测结果图）及图6（含抑制因子的样品检测结果及灵敏度对照图），内标基因及样品检测结果为阳性，检测结果正常，且试剂盒各浓度梯度均能检出，出峰时间正常，但含抑制因子的内标基因及样品检测结果均为阴性，提示检测结果可能为假阴性检测结果，样品中可能含有抑制因子或其他原因引起检测结果异常，需重新实验并排查原因，做进一步的确认。通过上述实验证明该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>  苏州华麦生物科技有限公司
 
<120>  一种可避免假阴性检测结果的副溶血弧菌恒温检测引物组、检测试剂盒及检
       测方法
 
<130> 
 
<160>  14   
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  11
ttcgaccaag aactcagata gc                                                22
 
 
<210>  12
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  12
gtgaagctgc acgtaaagc                                                    19
 
 
<210>  13
<211>  212
<212>  DNA
<213>  Bibrio Parahemolyticus
 
<400>  13
tgattcgttt gacggacgca ggtgcgaaga acttcatgtt gatgacactg ccagatgcga       60
 
cgaaagcgcc tcagtttaag tactcaacac aagaagagat cgacaaaatt cgtgcgaaag      120
 
tgcttgagat gaacgagttc atcaaggcac aagcgatgta ctacaaagcg caaggttaca      180
 
acatcacgtt gtttgatact cacgccttgt tc                                    212
 
 
<210>  14
<211>  258
<212>  DNA
<213>  Bibrio Parahemolyticus
 
<400>  14
gtttgacagc cgttgtttcg gtaaaagtgc ctgatccaaa attctcgagc caaaccaaag       60
 
acaagctggt ttcttctgaa gtgaaatcag cggttgaatc ggcgatgggt gagaaattat      120
 
ctgagttctt ggtcgaaaac ccaagcgaag cgaagatggt ttgttcgaaa atcatcgatg      180
 
cagcacgtgc acgtgaagcc gcacgtaaag cgcgtgaaat gactcgtcgt aaaggtgcgc      240
 
tagacctagc aggcctac                                                    258

Claims (10)

1.用于检测副溶血性弧菌的LAMP引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPtlh-F3：5’-TGATTCGTTTGACGGACG-3’；
VPtlh-B3：5’-GAACAAGGCGTGAGTATCAA-3’；
VPtlh-FIP：5’-ACTTAAACTGAGGCGCTTTCGTAGGTGCGAAGAACTTCATG-3’；
VPtlh-BIP：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATTGATGTCGTAACCTTGCG-3’；
VPtlh-LF：5’-CGTCTGGCAGTGTCATCA-3’；
VPtlh-LB：5’-GGCTCAAGCGATGTACTACA-3’；
所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
VPgyrB-F3：5’-GTTTGACAGCCGTTGTTTC-3’；
VPgyrB-B3：5’-GTAGGCCTGCTAGGTCTAG-3’；
VPgyrB-FIP：5’-ATCTTCGCTTCGCTTGGGTTAGTGAAATCAGCGGTTGAG-3’；
VPgyrB-BIP：5’-CGAAAATCATCGATGCAGCACGCACCTTTACGACGAGTCATT；
VPgyrB-LoopF：5’-TTCGACCAAGAACTCAGATAGC-3’；
VPgyrB-LoopB：5’-GTGAAGCTGCACGTAAAGC-3’。
2.一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和内标引物组。
3.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
4.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）DNA聚合酶；（2）LAMP反应液；（3）内标靶标片段；（4）阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求4所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
7.根据权利要求4所述的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有副溶血弧菌VPtlh基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有副溶血弧菌VPgyrB基因片段的T载体克隆。
8.一种副溶血性弧菌的LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用权利要求1的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温PCR扩增；
（3）结果判断：将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据VPtlh基因检测结果和内标基因VPgyrB检测结果进行判断：
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
VPtlh基因检测结果为阳性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
VPtlh基因检测结果为阴性内标基因检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
9.根据权利要求8所述的副溶血性弧菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP恒温PCR扩增的25μl反应体系含有：VPtlh-F3 0.2μM，VPtlh-B3 0.2μM，VPtlh-FIP 1.6μM，VPtlh-BIP 1.6μM，VPtlh-LF 0.8μM，VPtlh-LB 0.8μM，VPgyrB-F3 0.2μM，VPgyrB-B3 0.2μM，VPgyrB-FIP 1.6μM，VPgyrB-BIP 1.6μM，VPgyrB-LoopF 0.8μM，VPgyrB-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检样品2μl ，内标2μl，用超纯水补齐到25μl。
10.根据权利要求8所述的副溶血性弧菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP恒温PCR扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
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