CN103421896A - 针对大肠杆菌o157的rna恒温扩增核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对大肠杆菌O157的RNA恒温扩增核酸检测试剂盒。包括：捕获探针、O157检测引物T7引物和nT7引物、O157检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测食品中的O157RNA，具有特异性高、灵敏度高（可达103CFU/mL）、污染低（扩增产物RNA在自然环境下易于降解）及准确（避免假阳性）、快速（常规40分钟完成检测）检测的特点，将在大肠杆菌O157快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及致病菌的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的大肠杆菌O157(O157)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术
大肠杆菌O157，属肠杆菌科，埃希氏菌属，是主要的肠道致病菌之一，肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7被WHO定为新的食源性致病菌，可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症和血小板减少性紫癜等。大肠杆菌O157感染常与生牛肉，鲜牛奶或以鲜奶为原料加工的乳制品有着密切的关系。其他已知的传播途径有生牛奶、香肠、烤肉、未经氯消毒的市政用水、苹果汁、生蔬菜、沙拉和蛋黄酱。此外食品也可能被感染大肠杆菌O157的食品加工人员污染。
目前国内食品中大肠杆菌O157检测方法主要以国家标准GB/T4789.6-2008和行业标准SN/T0973-2010为依据，这些标准多依赖于传统的分离培养、镜检观察、生化鉴定、血清学分型等实验，一般的检测周期在5～7天左右，存在着检验周期长，工作量大等缺点。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展。目前已公开了很多检测E.coli O157的方法，如PCR及荧光PCR方法（行业标准：SN/T1869-2007、SN/T2754.2-2011）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SimuLtaneous AmpLification and Testing，简称SAT）是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者能够检测活菌，核酸扩增在一个温度下进行（42℃），无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。SAT技术直接以病原微生物特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，而自然界中病原微生物死亡后靶标RNA会快速降解，从而实现食品致病菌活菌检测。
发明内容
为解决现有的大肠杆菌O157(O157)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、能避免假阳性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的大肠杆菌O157(O157)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。
本发明所提供的大肠杆菌O157(O157）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增），包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针。
所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的大肠杆菌O157(O157)的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合，在有O157内标（O157IC RNA）时，其最好还可与该O157内标序列特异结合,所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述O157检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157检测探针存在于一O157检测液中。
再进一步所述试剂盒还包含有O157内标和内标检测探针；所述O157内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与O157靶标核苷酸（O157RNA）使用同一对引物（T7和nT7），O157内标由序列表中序列7所示的O157IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，
更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标，其中：
裂解液：含硫酸铵（(NH4)2SO4）和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针和磁珠；
洗涤液：含NaCl和SDS；
O157反应液：含dNTP和NTP；
O157检测液：含T7引物、nT7引物、O157检测探针和内标检测探针；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
O157阳性对照；含大肠杆菌O157(O157）rfbE基因的体外转录RNA稀释物；
O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液，如生理盐水；
O157内标：含O157内标RNA（序列如序列表中序列7所示）稀释物。
具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：
（1）裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；
（2）核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ（优选为5-25μΜ），磁珠50-500mg/L（优选为50-250mg/L）；
（3）洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，1wt％SDS，EDTA1-10mM；
（4）O157反应液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM（优选为0.5-5mM），NTP1-20mM（优选为1-10mM），PVP401-10％，KCl5-40mM；
（5）O157检测液：将O157检测引物和O157检测探针溶解在TE溶液（10mM Tris和1mM EDTA的混合液）中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为10pmol/反应，nT7引物浓度优选为8pmol/反应，O157检测探针浓度优选为8pmol/反应，内标检测探针浓度优选为8pmol/反应；
（6）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应（优选为500-1500U/反应）、T7RNA聚合酶200-2000U/反应（优选为500-1000U/反应）、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；
（7）O157阳性对照；含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE基因的体外转录RNA稀释物；
（8）O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液；
（9）O157内标：含105-108拷贝/mL O157IC RNA（序列如序列表中序列7所示）体外转录RNA稀释物。
另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照及O157内标。
所述O157阳性对照中的体外转录的O157RNA以下述方法制备：
1)用化学合成法合成O157rfbE中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列8所示）；
2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157阳性对照质粒；
3)O157阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为
-T-O157菌株，贮存于-70℃；
4)从
-T-O157菌株中提取
-T-O157质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
所述O157内标中的体外转录的O157IC RNA以下述方法制备：
1）用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同O157靶标序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列9所示）；
2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157内标质粒；
3)O157内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为
-T-O157IC菌株，贮存于-70℃；
4）从-T-O157IC菌株中提取
-T-O157IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
所述大肠杆菌O157（O157）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：
（1）可与序列表中序列1所示的大肠杆菌O157（O157）的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
（2）用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；
（3）用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针，所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
（4）内标和内标检测探针，内标为O157核苷酸序列（O157RNA）的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物（T7和nT7引物），内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示O157IC RNA，内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
所述试剂盒的使用方法，用于大肠杆菌O157（O157）的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：
1）用裂解液裂解待测样品中的大肠杆菌O157（O157），得到含有大肠杆菌O157（O157）核酸的裂解液；
2）向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在O157内标时，同时加入O157IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到大肠杆菌O157（O157）的核酸（RNA）和O157IC RNA；
3）将步骤2）提取的大肠杆菌O157（O157）的核酸（RNA）和O157IC RNA加入由O157反应液和O157检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；
4）根据荧光信号产生的时间和强度参照O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标检测结果对待测样品进行检测及判定；所述检测包括定性检测，所述判定为：检测结果为阳性则样品中有大肠杆菌O157活菌，阴性则样品中没有大肠杆菌0157活菌。
本发明提供了一种大肠杆菌O157（O157）的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的O157检测相比，具有以下优点：
（1）高特异性、高纯度、低污染：针对O157靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获O157的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。
（2）快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要40分钟。
（3）污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
（4）设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
（5）能有效区别检测物中的死菌和活菌，检测更准确，更科学，避免假阳性。
综上所述，本发明试剂盒能够检测食品样本中的O157RNA，具有特异性高、灵敏度高（可达103CFU/mL）、污染低（扩增产物RNA在自然环境下易于降解）、准确（避免假阳性）检测及快速检测（40分钟完成扩增检测）的特点，将在大肠杆菌O157快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1显示实施例3中灵敏度的检测结果
图2显示实施例4中阴性特异性参考品的检测结果
图3为实施例5中食品样本的靶标荧光检测结果
图4为实施例5中食品样本的内标荧光检测结果
图5为实施例6中SAT方法对B管检测结果
图6为实施例6中PCR方法对B管检测结果
图7为实施例6中对A管SAT的F1通道检测结果
图8为实施例6中对A管SAT的F2通道检测结果
图9为实施例6中对A管PCR检测结果
具体实施方式
本发明大肠杆菌O157（O157）检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增（SAT）技术结合而形成。
大肠杆菌O157包括的亚型比较多，如O157：H7、O157：H4，要覆盖如此多的亚型，本发明发明人研究分析后认为在检测靶标的选择上需要考虑试剂盒对各亚型检测的通用性，为此，本发明选择在各个亚型之间保守性较强的基因作为检测靶标。大肠杆菌O157各亚型之间保守性强的基因为O157抗原基因rfbE，因此本发明确定了rfbE上一段保守性强的序列作为检测靶标。
本发明通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获O157的RNA；核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
本发明中的专用引物和探针包括：
（1）捕获探针：一条可与序列表中序列1所示的大肠杆菌O157（O157）的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），在有O157内标（O157IC RNA）时，其还可与该O157内标序列特异结合；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
（2）O157检测引物：一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物，所述O157检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；
（3）O157检测探针：一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针，所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
为便于进行结果分析，还包括：（4）一条内标检测探针和O157内标，内标检测探针为在使用O157内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；O157内标为O157核苷酸序列（O157RNA）的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物（T7和nT7引物）。O157内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为O157IC RNA（IC含义为内标）。
基于以上设计，本发明进一步提供一种大肠杆菌O157（O157）的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。
该试剂盒，至少包含所述捕获探针（序列2），一对所述T7引物（序列3）和nT7引物（序列4），以及一条所述O157检测探针（序列5）。
进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157检测探针存在于O157检测液中。
再进一步，所述试剂盒还可包含竞争性O157内标（序列7）和内标检测探针（序列6），所述的内标检测探针存在于O157检测液中。
更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标，各组分说明如下：
（1）裂解液：用于裂解和保存待测样品中的大肠杆菌O157（O157），为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵（(NH4)2SO4，优选为5-50mM）；
（2）核酸提取液：用于提取和纯化O157菌体RNA，为含捕获探针1-50μM（优选为5-25μM）和磁珠50-500mg/L（优选为50-250mg/L）的水溶液；
（3）洗涤液：用于磁珠清洗，为含1wt％SDS的水溶液。
（4）O157反应液：SAT扩增所需组分，含dNTP0.1-10mM（优选为0.5-5mM）和NTP1-20mM（优选为1-10mM）的水溶液；
(5)O157检测液：含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为10pmol/反应，nT7引物浓度优选为8pmol/反应，O157检测探针浓度优选为8pmol/反应，内标检测探针浓度优选为8pmol/反应；
(6)SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应（优选为500-1500U/反应）、T7RNA聚合酶200-2000U/反应（优选为500-1000U/反应）；
(7)O157阳性对照；含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；
(8)O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液，如生理盐水；
(9)O157内标：含105-108拷贝/mL O157内标RNA（序列7），是O157核苷酸序列（O157RNA）的竞争性内标，为体外转录RNA（O157IC RNA）稀释物。
以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下：
裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。细菌RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。
O157检测液中O157检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。
由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标。其中，O157阳性对照和O157内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。
通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照（以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照100倍作为临界弱阳对照），可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检（假阴性）的情况。O157内标作为O157RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。
利用以上试剂盒对大肠杆菌O157（O157）进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：
1）用裂解液裂解待测样品中的大肠杆菌O157(O157），得到含有大肠杆菌O157(O157）核酸的裂解液；
2）向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在O157内标时，同时加入O157IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到大肠杆菌O157(O157）的核酸（RNA）和O157IC RNA；
3）将步骤2）提取的大肠杆菌O157(O157）的核酸（RNA）和O157IC RNA加入由O157反应液和O157检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；
4）根据荧光信号产生的时间和强度参照O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标检测结果对待测样品进行定性检测。
所述步骤4）中的O157阳性对照为含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；O157阴性对照为不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液；O157内标为含105-108拷贝/mL O157内标RNA（序列7）稀释物。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。
实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测大肠杆菌O157（O157）的专用引物和探针的设计
本发明选择O157细菌rfbE中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列1所示），根据引物探针设计原理，使用DNA STAR、DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测大肠杆菌O157（O157）的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：
（1）一条可与如序列表中序列1所示的大肠杆菌O157（O157）的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），所述捕获探针的核苷酸序列为5’-aucyuccagucucugcgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’（Y为简并碱基，代表C/T，序列表中序列2）；
（2）一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物，所述O157检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’-aatttatacgactcactatagggagattttgttccgcaaatttatt-3’（序列表中序列3），nT7引物序列为5’-aaccgtcattgacaggaaaa-3’（序列表中序列4）；
（3）一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针，所述O157检测探针的核苷酸序列为5’-ccagacucaacguggauuucugg-3’（序列表中序列5），5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
（4）为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性O157内标（序列7），设计了竞争性内标检测探针，O157内标与O157靶标核苷酸（O157RNA）拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述O157内标可通过O157靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与O157检测探针序列、荧光标记不同，但碱基数一致的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列5’-ccagguaauucggcacguggccugg-3’（序列表中序列6），5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
实施例2、制备大肠杆菌O157（O157）的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明大肠杆菌O157（O157）的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针（TCO，Target CaptureOligo）、T7引物、nT7引物、O157检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶；试剂盒存在内标时，还包括内标检测探针。
所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157检测探针、内标检测探针存在于O157检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒（标本处理单元）和-15－-35℃储存的B盒（核酸扩增检测单元），A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照，如果存在内标，B盒还包括O157内标，主要成分如下：
A盒（标本处理单元）组成为：
裂解液；含硫酸铵（(NH4)2SO4）和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针1-50μM（优选为5-25μM）和磁珠50-500mg/L（优选为50-250mg/L）；
洗涤液：主要含1％SDS。
B盒（核酸扩增检测单元）组成为：
O157反应液：含dNTP0.1-10mM（优选为0.5-5mM），NTP1-20mM（优选为1-10mM）；
O157检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为10pmol/反应，nT7引物浓度优选为8pmol/反应，O157检测探针浓度优选为8pmol/反应，内标检测探针浓度优选为8pmol/反应；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应（优选为500-1500U/反应），T7RNA聚合酶200-2000U/反应（优选为500-1000U/反应）；
O157阳性对照；含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；
O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液，如生理盐水；
如果存在内标，O157内标：含105-108拷贝/mL O157IC RNA稀释物（序列表中序列7）。
试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。
具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：
（1）裂解液：为裂解和保存样本中的大肠杆菌O157（O157），含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；
（2）核酸提取液：为提取大肠杆菌O157（O157）RNA的含有oligo（dT）包被的磁珠和特异结合靶标核酸（O157RNA）的一段RNA序列的溶液，具体包含HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ（优选为5-25μΜ），磁珠50-500mg/L（优选为50-250mg/L）；
（3）洗涤液：为含SDS、NaCl的溶液，具体包含HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，1wt％SDS1-10mM，EDTA1-10mM；
（4）O157反应液：为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM（优选为0.5-5mM），NTP1-20mM（优选为1-10mM），PVP401-10％，KCl5-40mM；
（5）O157检测液：将恒温扩增时必需的O157检测引物和O157检测探针溶解在TE溶液（10mM Tris和1mM EDTA的混合液）中配制而成，引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为10pmol/反应，nT7引物浓度优选为8pmol/反应，O157检测探针浓度优选为8pmol/反应，内标检测探针浓度优选为8pmol/反应；
（6）SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U/反应（优选为500-1500U/反应）、T7RNA聚合酶200-2000U/反应（优选为500-1000U/反应）、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zincacetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；
（7）O157阳性对照；含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；
（8）O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液，如生理盐水；
（9）如果存在内标，O157内标：含105-108拷贝/mL O157内标RNA（序列表中序列7）。
O157阳性对照中的体外转录的O157RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：
1)用化学合成法合成O157rfbE中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列8所示）；
2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157阳性对照质粒；
3)O157阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-O157菌株，贮存于-70℃；
4)从
-T-O157菌株中提取-T-O157质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
O157内标中的体外转录的O157IC RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：
1）用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同O157靶标序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列9所示）；
2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157内标质粒；
3)O157内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为
-T-O157IC菌株，贮存于-70℃；
4）从
-T-O157IC菌株中提取
-T-O157IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
实施例3、大肠杆菌O157的实时荧光核酸恒温扩增检测灵敏度
用本发明试剂盒（组成见实施例2，试剂盒内不存在VP内标，检测液中也不存在内标检测探针）检测食品样本中的大肠杆菌O157（O157），将浓度为1×107CFU/mL的阳性参考品，按10倍梯度稀释到102CFU/mL，另设阴性对照（0157阴性对照，为不含有大肠杆菌O157的靶标核酸（0157RNA））一个。具体方法包括以下步骤：
（1）菌液稀释
测定浓度为1×107CFU/mL的大肠杆菌O157培养物，10倍梯度稀释到100CFU/mL作为大肠杆菌O157线性灵敏度参考品。
（2）核酸提取
2.1在样品处理管（1.5mL离心管）中加入200μl裂解液（含HEPES35mM，(NH4)2SO420mM），200μl菌液，用裂解液裂解待测样品中的大肠杆菌O157(O157），得到含有大肠杆菌O157(O157）核酸的裂解液。
2.2在样品处理管（1.5mL离心管）中加入100μl核酸提取液（含HEPES100mM，EDTA50mM，LiCl500mM，捕获探针10μΜ，磁珠200mg/L）混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。
2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液（含HEPES50mM，NaCl100mM，1％SDS，EDTA5mM）振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。
2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用（此步应清晰可见磁珠）。
（3）SAT核酸扩增检测
3.1向样品处理管中加入40μl反应检测液（40μl O157反应液＋2.5μl O157检测液）洗涤磁珠。O157反应液具体包含Tris30mM，MgCl220mM，dNTP4mM，NTP8mM，PVP405％，KCl20mM；O157检测液中T7引物浓度为10pmol，nT7引物浓度为8pmol，O157检测探针浓度为8pmol。
3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪（美国ABI公司产品）60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含M-MLV反转录酶1200U，T7RNA聚合酶1500U/反应，10mM HEPES pH7.5，20mMN-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.4mM zinc acetate（乙酸锌）、30mMtrehalose（海藻糖）、100mM Tris-HCl pH8.0，200mM KCl，0.1mM EDTA，0.8％(v/v)Triton X-100和40％(v/v)glycerol（丙三醇）；
3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器（FAM通道），42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次。
（4）结果判定
根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）
①阳性结果判定：
FAM通道：dt≤35的样本为阳性；35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果FAM通道：dt＜40的样本为阳性。
②阴性结果判定：
FAM通道dt无数值或为40，则为阴性。
（5）结果
图1显示灵敏度的检测图，当阳性参考品的浓度为1000CFU/mL的时候，检测dt值为16，即检测下限灵敏度可以达到1000CFU/mL。
实施例4、大肠杆菌O157的实时荧光核酸恒温扩增检测特异性
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，试剂的生产在GMP车间进行；特异性参考品处理的方法如下：6例阴性参考品包括金黄色葡萄球菌（SA）、志贺氏菌（SH）、霍乱弧菌（VC）、单核细胞增生李斯特氏菌（Lm）、沙门氏菌（Sal.spp.）、副溶血弧菌（VP），另设阳性对照（大肠杆菌0157）一个。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。
使用本发明试剂盒的检测结果如图2，6个阴性参考品的扩增曲线平直且与基线无交叉，可明确判定为阴性。6例阴性参考品包括金黄色葡萄球菌（SA）、志贺氏菌（SH）、霍乱弧菌（VC）、单核细胞增生李斯特氏菌（Lm）、沙门氏菌（Sal.spp.）、副溶血弧菌（VP）。
实施例5、实际食品样本的实时荧光核酸恒温扩增检测
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2（试剂盒含有106CFU/mL的0157内标，检测液内含有8pmol/反应的内标探针），检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。具体方法包括以下步骤：
（1）食品样本处理：
称取25g（mL）样品装入盛有225mL营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，震荡混匀。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。大肠杆菌O157样本编号为O157食品标本1-20，另设阴性对照、阳性对照各一个。
（2）核酸提取
试剂盒内包含0157内标，在核酸处理中，在每个样品处理管中加入100μl核酸提取液，需同时加入10μl内标溶液，再混匀。其他具体操作步骤同实施例2。
（3）SAT扩增检测
同实施例3。
（4）结果判定：
①阳性结果判定：
F1通道（FAX通道）：dt≤35的样本为阳性；35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果F1通道：dt＜40的样本为阳性。
②阴性结果判定：
F1通道dt无数值或为40，同时F2通道(VIC通道,ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近)：dt≤35，则为阴性。
质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照F1通道：dt≤35；阴性对照F1通道：dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35，否则此次检测结果视为无效。
（5）结果
使用本发明试剂盒的检测结果如图3（F1荧光通道）和图4（F2荧光通道）所示，荧光素通道F1为FAM，F2为VIC，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次。根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定样本13、14、17、18检测为阳性，其余样本为阴性（图4显示有信号，正说明内标可检测出，反应体系没有受环境影响，排除假阴性）。
实施例6、SAT与PCR对活菌死菌的检测比对
本次检测为本发明的另一个应用：试剂盒组成，检测方法及试剂用量同实施例3，大肠杆菌O157检测样本类型包括：生畜肉、熟肉制品、速冻熟制米面制品、即食非发酵性豆制品、生食类蔬菜、中式凉拌菜、环境样品和动物饲料等；具体方法包括如下步骤：
（1）样本处理
按GB4789.36-2008处理感染大肠O157的食品样本，获得混匀液体，并过夜培养。取1ml过夜培养菌液置于1.5mlEP管中（共A、B两管）；将其中A管置于75度水浴锅中10分钟，并通过显微镜显示A管菌体已破裂；然后将加热（A管）与不加热处理的菌液（B管）分别进行10倍梯度稀释102、103、104、105、106倍，分别取50ul稀释菌液涂平板（LB）进行过夜培养。结果，第二天，A管的菌液对应的LB平板无菌落，B管的菌液对应的LB平板有菌落，说明加热后的菌（A管）全被灭活，A管为死菌，B管为活菌。
（2）提取、扩增与检测
SAT检测方法同实施例4；PCR检测可购市面上常规检测大肠O157的PCR试剂盒，按说明书进行提取和扩增检测。
（3）检测结果：
对B管各梯度浓度进行检测，SAT方法均可检出10-2到10-6（图5），PCR可检出10-2到10-5（图6），可见本发明所形成的试剂盒具有较高的灵敏度。
对A管各梯度浓度进行检测，SAT的F1通道检测均为阴性（图7），同时F2通道（图8）显示各梯度有内标信号，说明SAT反应体系未受抑制，结果可靠；对A管PCR检测结果（图9）和B管的PCR结果相同，表明其不能区分死菌和活菌，这是因为大肠O157的DNA稳定所致。通过对RNA的检测，可有效区分食品中的大肠O157活菌死菌情况，避免假阳性。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的大肠杆菌O157（O157）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种针对大肠杆菌O157的RNA恒温扩增核酸检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的大肠杆菌O157（O157）的靶标核酸（O157RNA）的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述O157检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157检测探针存在于一O157检测液中。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有O157内标和内标检测探针；所述O157内标为O157核苷酸序列（O157RNA）的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物（T7和nT7引物），由序列表中序列7所示的O157IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于O157检测液中。
5.根据权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标，其中：
裂解液：含硫酸铵（(NH4)2SO4）和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针和磁珠；
洗涤液：含NaCl和SDS；
O157反应液：含dNTP和NTP；
O157检测液：含T7引物、nT7引物、O157检测探针和内标检测探针；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
O157阳性对照；含大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；
O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液，如生理盐水；
O157内标：O157IC RNA（序列如序列表中序列7所示）。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：
（1）裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；
（2）核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ（优选为5-25μΜ），磁珠50-500mg/L（优选为50-250mg/L）；
（3）洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，1wt％SDS，EDTA1-10mM；
（4）O157反应液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM（优选为0.5-5mM），NTP1-20mM（优选为1-10mM），PVP401-10％，KCl5-40mM；
（5）O157检测液：将O157检测引物和O157检测探针溶解在TE溶液（10mM Tris和1mM EDTA的混合液）中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为10pmol/反应，nT7引物浓度优选为8pmol/反应，O157检测探针浓度优选为8pmol/反应，内标检测探针浓度优选为8pmol/反应；
（6）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应（优选为500-1500U/反应）、T7RNA聚合酶200-2000U/反应（优选为500-1000U/反应）、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；
（7）O157阳性对照；含105-108拷贝/mL大肠杆菌O157(O157）rfbE的体外转录RNA稀释物；
（8）O157阴性对照：不含有大肠杆菌O157(O157）靶标核酸（O157RNA）序列或不含有大肠杆菌O157的溶液；
（9）O157内标：含105-108拷贝/mL O157IC RNA（序列如序列表中序列7所示）体外转录RNA稀释物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述O157反应液、O157检测液、SAT酶液、O157阳性对照、O157阴性对照及O157内标。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述O157阳性对照中的体外转录的O157RNA以下述方法制备：
（1)用化学合成法合成O157rfbE中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列8所示）；
（2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157阳性对照质粒；
（3)O157阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为
-T-O157菌株，贮存于-70℃；
（4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA；
存在O157内标时，体外转录的O157IC RNA以下述方法制备：
（1）用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同O157靶标序列区域（其核苷酸序列如序列表中序列9所示）；
（2)将片段克隆到
-T载体中，构建O157内标质粒；
（3)O157内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为
-T-O157IC菌株，贮存于-70℃；
（4）纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
9.权利要求1-8任一所述大肠杆菌O157（O157）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：
（1）可与序列表中序列1所示的大肠杆菌O157（O157）的靶标核酸（O157RNA）序列特异结合的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
（2）用于在M-MLV反转录酶作用下产生O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝的O157检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；
（3）用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述O157靶标核酸（O157RNA）的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的O157检测探针，所述O157检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
（4）内标和内标检测探针，内标为O157核苷酸序列（O157RNA）的竞争性内标，可与（1）所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物（T7和nT7引物），其核苷酸序列如序列表中序列7所示；内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
10.一种权利要求1-8任一所述的试剂盒的使用方法，用于大肠杆菌O157的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：
（1）用裂解液裂解待测样品中的大肠杆菌O157(O157），得到含有大肠杆菌O157(O157）核酸的裂解液；
（2）向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在0157内标时，同时加入0157内标，使捕获探针与靶标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到大肠杆菌O157(O157）的核酸（RNA）和0157IC RNA；
（3）将步骤2）提取的大肠杆菌O157(O157）的核酸（RNA）和0157IC RNA加入由O157反应液和O157检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；
4）根据荧光信号产生的时间和强度参照O157阳性对照、O157阴性对照和O157内标检测结果对待测样品进行检测及判定；所述检测包括定性检测，所述判定为：检测结果为阳性则样品中有大肠杆菌O157活菌，阴性则样品中没有大肠杆菌0157活菌。
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