CN108265102A - 一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 - Google Patents

一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、检测引物T7引物和nT7引物、检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检食品中的阪崎肠杆菌的RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达1000CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规60分钟完成检测)的特点，将在食品安全中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病原微生物的生物检测技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及实时荧光核酸恒温扩增检测技术对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)进行检测的试剂盒。通过本发明的试剂盒可实现对食品中的克罗诺阪崎肠杆菌的检测。
背景技术
阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)(Cronobacter spp)是一种食源性条件致病菌，可以引起新生儿严重的脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和菌血症等疾病，在新生儿中有较高的致死率。近年来对食品、饮料、加工原料、环境等阪崎肠杆菌污染率的研究发现，阪崎肠杆菌在自然界中分布广泛。
目前对阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检测常用的有培养法和分子生物学方法。分子生物学法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增和探针方法等。分子生物学克服了培养法实验操作繁琐，耗时长等，但是一般PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类细菌的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析细菌的特性进行专门设计。目前尚无针对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
发明内容
为解决现有的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。
本发明所提供的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)的靶标核酸(16sRNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝的扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针。
所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌Cronobacter spp)的靶标核酸(RNA)序列特异结合，在有内标(IC RNA)时，其最好还可与该内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液中。
再进一步所述试剂盒还包含有内标和内标检测探针；所述内标为竞争性内标，可与靶标核苷酸(16sRNA)使用同一对引物(T7和nT7)，内标由序列表中序列7所示的含内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于检测液中。
更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、反应液、检测液、SAT酶液、阳性对照、阴性对照和内标，其中：
裂解液：含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针和磁珠；
洗涤液：含NaCl和SDS。
反应液：含dNTP和NTP；
检测液：含T7引物、nT7引物、检测探针和内标检测探针；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；
阳性对照；含克罗诺阪崎肠杆菌基因的体外转录RNA稀释物；
阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌靶标核酸(16s RNA)序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌的溶液，如生理盐水；
内标：含内标RNA(IC RNA，序列如序列表中序列7所示)稀释物。
具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：
(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；
(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；
(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；
(4)反应液：Tris 10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；
(5)检测液：将扩增引物和检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；
(7)阳性对照；含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌基因的体外转录RNA稀释物；
(8)阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌靶标核酸(16sRNA)序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌的溶液；
(9)内标：含105拷贝/mL内标RNA(序列如序列表中序列7所示)稀释物。
另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述反应液、检测液、酶液、阳性对照、阴性对照及内标。
所述阳性对照中的体外转录的16sRNA以下述方法制备：
(1)用化学合成法合成克罗诺阪崎肠杆菌16sRNA基因片段(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
(2)将16sRNA基因片段插入到载体中，构建阳性对照质粒；
(3)阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为菌株，贮存于-70℃；；
(4)从菌株中提取质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
所述内标中的体外转录的IC RNA以下述方法制备：
(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同克罗诺阪崎肠杆菌靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；
(2)将片段克隆到载体中，构建内标质粒；
(3)内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为 IC菌株，贮存于-70℃；
(4)从 IC菌株中提取 IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA
所述克罗诺阪崎肠杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：
(1)可与序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的靶标核酸(16sRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
(2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝的扩增引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；
(3)用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
(4)内标和内标检测探针，内标为靶标核苷酸序列(16sRNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)，内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
所述试剂盒的使用方法，用于克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：
1)用裂解液裂解待测样品中的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)，得到含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)核酸的裂解液；
2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的核酸(RNA)和IC RNA；
3)将步骤2)提取的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的核酸(RNA)和ICRNA加入由反应液和检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3∶1；
4)根据荧光信号产生的时间和强度参照阳性对照、阴性对照和内标检测结果对待测样品进行定性检测。
本发明提供了一种克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的检测相比，具有以下优点：
(1)高特异性、高纯度、低污染：针对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。
(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要40分钟
(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
综上所述，本发明试剂盒能够检测食品中的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达1000CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(60分钟完成扩增检测)的特点，将在克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的食品检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为克罗诺属阪崎肠杆菌的四个实验组引物和探针筛选
图2为克罗诺属阪崎肠杆菌灵敏度检测的靶标荧光检测结果
图3为克罗诺属阪崎肠杆菌灵敏度检测的内标荧光检测结果
图4为克罗诺属阪崎肠杆菌特异性检测的靶标荧光检测结果
图5为克罗诺属阪崎肠杆菌特异性检测的内标荧光检测结果
图6-9为克罗诺属阪崎肠杆菌检测活菌和死菌的荧光检测结果
图10为克罗诺属阪崎肠杆菌样品检测的靶标荧光检测结果
图11为克罗诺属阪崎肠杆菌样品检测的内标荧光检测结果
具体实施方式
本发明克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增(SAT)技术结合而形成。通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的RNA；核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
本发明中的专用引物和探针包括：
(1)捕获探针：一条可与克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的靶标核酸(16sRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
(2)扩增引物：一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝的扩增引物，所述扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；
(3)检测探针：一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
为便于进行结果分析，还包括：(4)一条内标检测探针和内标核酸，内标检测探针为在使用内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；内标为克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)核苷酸序列(16s RNA)的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)。内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为IC RNA(IC含义为内标)。
基于以上设计，本发明进一步提供一种克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。
该试剂盒，至少包含所述捕获探针(序列2)，一对所述T7引物(序列3)和nT7引物(序列4)，以及一条所述检测探针(序列5)。
进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液中。
再进一步，所述试剂盒还可包含内标(序列7)和内标检测探针(序列6)，所述的内标检测探针存在于检测液中。
更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、反应液、检测液、SAT酶液、阳性对照、阴性对照和内标，各组分说明如下：
(1)裂解液：用于裂解和保存待测样品中的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵((NH4)2SO4，优选为5-50mM)；
(2)核酸提取液：用于提取和纯化CA16病毒RNA，为含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)的水溶液；
(3)洗涤液：用于磁珠清洗，为含1％(V/V)SDS的水溶液。
(4)反应液：SAT扩增所需组分，含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)和NTP 1-20mM(优选为1-10mM)的水溶液；
(5)检测液：含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(6)SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；
(7)阳性对照；含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因的体外转录RNA稀释物；
(8)阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16s RNA)序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的溶液，如生理盐水；
(9)内标：含105拷贝/mL内标RNA(序列7)稀释物。
以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下：
裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的靶标核酸(RNA)。靶标RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。
检测液中的检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。
由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了阳性对照、阴性对照和内标。其中，阳性对照和内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。
通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1∶1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。内标作为克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。
利用以上试剂盒对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：
1)用裂解液裂解待测样品中的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)，得到含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)核酸的裂解液；
2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的核酸(RNA)和IC RNA；
3)将步骤2)提取的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的核酸(RNA)和ICRNA加入由反应液和检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3∶1；
4)根据荧光信号产生的时间和强度参照阳性对照、阴性对照和内标检测结果对待测样品进行定性检测。
在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为食品样品的增菌液(按国标进行的第一步增菌液)。
所述步骤4)中的阳性对照为含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)基因的体外转录RNA稀释物；阴性对照为不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16sRNA)序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的溶液；内标为含105拷贝/mL内标RNA的稀释物。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。
实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的专用引物和探针的设计
本发明根据个人经验和阅读大量文献和专利，选择克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因中23s-ITS2-5S Rrna，16s-ITS-23S Rrna，16s rRNA中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：
实验组1：
nT7：5’-TTAACCTTACAACGCCAA-3’
T7：5’-AATTTATACGACTCACTATAGGGAGACCGCTTCCGCCATGA-3’
探针：5’-CCGCCAGUCUGGCGUGUGGCGG-3’
实验组2：
nT7：5’-CTGGCGTGTTGAGAGAC-3’
T7：5’-AATTTATACGACTCACTATAGGGAGATGGGACCACCGCGC-3’
探针：5’-CCGCCAGAAUUUGCCUGGGCGG-3’
实验组3
nT7：5’-GAAAGGCGTTACCGATTG-3’
T7：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGCGTGTCTGTTTCAA-3’
探针5’-CCGCCCAAAACUGACUGGGCGG-3’
实验组4
nT7：5’-GCGAAGAACCTTACCTGGT-3’
T7：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCACCTGTCTCAGAGTTCC-3’
探针：5’-CCGCCUCCUGCAGAGAUGGCGG-3’
购买ATCC 29544克罗诺阪崎肠杆菌标准菌株，按说明复苏，取2ul菌液分别加入到四个实验组中，每个实验组的引物浓度为5pmol/ul，探针浓度为5pmol/ul，30ul反应液，反应液中含dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM；42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1000U/反应、T7RNA聚合酶2000U/反应、2mM HEPES pH7.5、10mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.04mM zinc acetate(乙酸锌)、10mM trehalose(海藻糖)、40mM Tris-HCl pH 8.0、40mM KCl、0.01mM EDTA、0.1％(v/v)Triton X-100和20％(v/v)glycerol(丙三醇)。将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次；荧光素通道选择FAM通道。
根据图1结果表明：实验组1和实验组2扩增的靶标为23s-ITS2-5S Rrna，实验组3的扩增靶标为16s-ITS-23S Rrna，实验组4的扩增靶标为16s rRNA。结果提示：实验组1和实验组2的扩增效果优于实验组3，但是实验组4的扩增均优于其他三个实验组(图1)。经多次验证，最终选用实验组4的引物和探针。
根据实验组4的引物和探针，具体研发出克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增试剂盒，试剂盒的引物和探针具体序列如下：
(1)一条可与克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的靶标核酸(16sRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为：5’AGTTTGCTCAATGTCCTCTGTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’(序列表中序列2)；
(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生克罗诺阪崎肠杆菌Cronobacter spp)靶标核酸(16s RNA)的DNA拷贝的扩增引物，所述扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCACCTGTCTCAGAGTTCC-3’(序列表中序列3)，nT7引物序列为5’-GCGAAGAACCTTACCTGGT-3’(序列表中序列4)；
(3)一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，所述检测探针的核苷酸序列为5’-CCGCCUCCUGCAGAGAUGGCGG-3’(序列表中序列5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加内标(序列7)，设计了内标检测探针，内标与靶标核苷酸(16s RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述内标可通过靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’CCGAGAUACGAGAGAGCGACTCGG-3’(序列表中序列6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
实施例2、用于实时荧光核酸恒温扩增检测克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的专用引物和探针检测的菌属亚型
选取了实施例1中最后选取的引物和探针，将序列放入NCBI BLAST，结果提示该区域能够检测出全部的克罗诺属阪崎肠杆菌亚型，分别是Cronobacter dublinenesis，Cronobacter dublinenesis subsp lausannensis，Cronobacter malonaticus，Cronobacter muytjensii，Cronobacter sakazakii，Cronobacter turicensis，Cronobacter universalis，Cronobacter genomospecies，Cronobacter condiment。
实施例3、制备克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等组分。
所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针、内标检测探针存在于检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15--35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括反应液、检测液、SAT酶液、阳性对照、阴性对照和内标，主要成分如下：
A盒(标本处理单元)组成为：
裂解液；含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；
洗涤液：主要含1％(V/V)SDS。
B盒(核酸扩增检测单元)组成为：
反应液：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；
检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；
阳性对照；含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因的体外转录RNA稀释物；
阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16s RNA) 序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的溶液，如生理盐水；
内标：含105拷贝/mL内标RNA稀释物(序列表中序列7)。
试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。
具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：
(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH4)2SO4 5-50mM；
(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；
(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；
(4)反应液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；
(5)检测液：将扩增引物和检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；
(7)阳性对照；含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因的体外转录RNA稀释物；
(8)阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)靶标核酸(16s RNA)序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的溶液；
(9)内标：含105拷贝/mL内标RNA(序列如序列表中序列7所示)稀释物。
阳性对照中的体外转录的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：
(1)用化学合成法合成克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因片段(16s阳性片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；
(2)将克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)基因片段插入到载体中，构建阳性对照质粒；
(3)阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为菌株，贮存于-70℃；；
(4)从菌株中提取质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
内标中的体外转录的IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：
(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同靶标序列区域(内标片段，其核苷酸序列与序列表中序列9所示)；
(2)将片段克隆到载体中，构建内标质粒；
(3)内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为 IC菌株，贮存于-70℃；
(4)从 IC菌株中提取 IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA
实施例4、克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增的灵敏度
购买ATCC 29544克罗诺阪崎肠杆菌标准菌株，按说明复苏，按10倍梯度稀释涂板计数后得出菌液浓度为1X1010CFU/ml。对该菌液进行10倍梯度稀释后，运用本试剂盒(具体见实施例3)，按下述步骤进行实验。
1、核酸提取
1.1取200μl每个浓度梯度的样品液，加入200μl裂解液(HEPES 50mM，(NH4)2SO435mM)得到含有克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)核酸的裂解液。
1.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100μl核酸提取液(HEPES 200mM EDTA100mM，LiCl 800mM，捕获探针20μM，磁珠150mg/L)，10μl内标溶液(含105拷贝/mL内标RNA)，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。
1.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM，NaCl150mM，1％SDS，EDTA 2.5mM)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。
1.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。
2、SAT核酸扩增检测
2.1向样品处理管中加入40μl反应检测液(40μl反应液+2.5μl检测液)洗涤磁珠。反应液具体包含Tris 15mM，MgCl215mM，dNTP 2.5mM，NTP 3mM，PVP40 1％，KCl 10mM；检测液中T7引物浓度为7.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。
2.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7 RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mMKCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇)。
2.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(内标信号检测，F2)。
结果如图2(F1荧光通道)和图3(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定本试剂盒的最低检出下限是1000CFU/ml，表明本试剂盒的灵敏度高。
实施例5、克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增的特异性
购买并且按照说明书上的要求培养沙门氏菌(SAL)CMCC50094，金黄色葡萄球菌(SA)ATCC29213，志贺氏菌(SH)CMCC(B)51572，副溶血性弧菌(VP)CGMCC1.1614，单核细胞增生李斯特氏菌(LM)GIM1.347，大肠杆菌(O157)ATCC33591标准菌，同时加上阳性对照和阴性对照，验证上述引物和探针的特异性。运用本试剂盒(具体见实施例3)，实验步骤同实施例4.
结果如图4(F1荧光通道)和图5(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，6个阴性参考品的扩增曲线平直且与基线无交叉，由此表明本试剂盒的特异性好。
实施例6、克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测活菌和死菌
购买ATCC 29544克罗诺阪崎肠杆菌标准菌株，按说明复苏，按10倍梯度稀释涂板计数后得出菌液浓度为1X1010CFU/ml。将1X1010CFU/ml的阪崎肠杆菌培养液分成A、B两份，B份于121℃高压30分钟进行灭活；然后将上述两份培养液分别10倍稀释，并添加于阴性食品样品中进行检测。运用本试剂盒(具体见实施例3)，实验步骤同实施例4。
结果如图6-9，A组为图6(F1荧光通道)和图7(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，A组活菌能检测到1000CFU/ml。B组为图8(F1荧光通道)和图9(F2荧光通道)所示，B组无法检测到任何信号。故本发明能检出活菌和死菌。
实施例7、实际样品的实时荧光核酸恒温扩增检测
用本发明试剂盒(组成见实施例3)检测实际食品样品(奶制品)中的克罗诺阪崎肠杆菌，具体方法包括以下步骤：
1、样本采集、运输及保存
阪崎肠杆菌：样品100g(mL)+900mL缓冲蛋白胨水(BPW)，均质后36℃±1℃，培养18h±2h。按照上述方法进行样本增菌后取1ml增菌液，按1∶1加入SAT试剂盒中的裂解液，混匀，取400μl按照SAT操作进行致病菌检测。取样后的培养液继续按照国标培养进行相关鉴定。
2、具体实验操作见实例4
3、结果
克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)食品样品6个样，另设阴性对照、阳性对照各一个。结果如图10(F1荧光通道)和图11(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定样本1、3、4、6为阳性，2、5号为阴性。本结果与国标培养结果完全相同，表明本发明试剂盒用于检测食品中克罗诺阪崎肠杆菌准确性高，但上机扩增检测时间仅需60分钟具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronosbacter spp)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌的靶标核酸RNA序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生靶标核酸的DNA拷贝的扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针；其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含SAT酶液，所述SAT酶液为包含M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶的混合物，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液中。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有内标和内标检测探针；所述内标为竞争性内标，可与靶标核苷酸RNA使用同一对引物即T7和nT7，内标由序列表中序列7所示的含内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于检测液中。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、反应液、检测液、SAT酶液、阳性对照、阴性对照和内标，其中：
裂解液：含硫酸铵(NH4)2SO4和HEPES；
核酸提取液：含捕获探针和磁珠；
洗涤液：含NaCl和SDS；
反应液：含dNTP和NTP；
检测液：含T7引物、nT7引物、检测探针和内标检测探针；
SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；
阳性对照；含克罗诺阪崎肠杆菌基因的体外转录RNA稀释物；
阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌靶标核酸序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌的溶液；
内标：含内标RNA即序列如序列表中序列7所示的稀释物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：
(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH4)2SO4 5-50mM；
(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针 1-50μM，磁珠 50-500mg/L；
(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；
(4)反应液：Tris 10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；
(5)检测液：将扩增引物和检测探针溶解在TE溶液即10mM Tris和1mM EDTA的混合液中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应；
(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mMtrehalose、40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、体积百分浓度0.1-1％的Triton X-100和体积百分浓度20-50％的glycerol；
(7)阳性对照；含105-108拷贝/mL克罗诺阪崎肠杆菌基因的体外转录RNA稀释物；
(8)阴性对照：不含有克罗诺阪崎肠杆菌靶标核酸序列或不含有克罗诺阪崎肠杆菌的溶液；
(9)内标：含105拷贝/mL内标RNA即序列如序列表中序列7所示的稀释物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：试剂(2)核酸提取液中，捕获探针浓度为5-25μM，磁珠用量为50-250mg/L；试剂(4)反应液中，dNTP浓度为0.5-5mM，NTP浓度为1-10mM；试剂(5)检测液中，T7引物浓度为7.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；试剂(6)SAT酶液中，M-MLV反转录酶500-1500U/反应，T7 RNA聚合酶500-1000U/反应。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述反应液、检测液、酶液、阳性对照、阴性对照及内标。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照中的体外转录的RNA以下述方法制备：
(1)用化学合成法合成克罗诺阪崎肠杆菌基因片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；
(2)将克罗诺阪崎肠杆菌基因片段插入到载体中，构建阳性对照质粒；
(3)阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为菌株，贮存于-70℃；；
(4)从菌株中提取质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA；或
存在克罗诺阪崎肠杆菌内标时，体外转录的克罗诺阪崎肠杆菌内标RNA以下述方法制备：
(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列同克罗诺阪崎肠杆菌靶标序列区域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；
(2)将片段克隆到载体中，构建内标质粒；
(3)内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为IC菌株，贮存于-70℃；
(4)从IC菌株中提取IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
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