CN101333565A - 核酸恒温同步放大检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸的恒温同步放大检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：1)将含有下列组分的反应物混合：a.待测核酸样品；b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；c.引物2：该引物可与待测核酸样品负链的5’端杂交；d.一种或多种荧光探针；e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶；f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定量或定性检测。本发明具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，适用于临床检验、血液筛查等领域中的核酸检验。

Description

核酸恒温同步放大检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及将核酸的恒温放大与检测同步进行的检验方法，及其在临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测中的核酸检测中的应用。

背景技术

在核酸检测过程中，多数情况下样品中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样品中的待检核酸片段进行扩增。1985年，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术的产生推动了核酸检测技术的发展，该技术已成为核酸检测技术中的重要手段。随后，又衍生出诸如逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(RealTime Fluorescent Quantified PCR，Real-time FQ PCR)，基于转录的扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)，Nucleic Acid Sequence BasedAmpiification(NASBA)等一系列核酸扩增检测方法，均可用于DNA样品或RNA样品的扩增及定性、定量检测中。目前，除实时荧光定量PCR外，其余的核酸检测方法都是采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式。目前，终点PCR或终点TMA/NASBA检测方法还被广泛应用。由于这些方法在实际应用中易引起扩增物的污染，因此常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，从而使得该技术的实际应用尤其是临床检测具有很大的局限性。实时荧光定量PCR虽然在技术上解决了上述难题，但设备昂贵、操作复杂，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。

1991年，Compton发明了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification，简称NASBA)(Nature，350(6313)：91-2，1991)。该技术是以RNA分子的逆转录-转录为技术主线，无需进行类似于PCR过程的温度循环，可在恒定的温度下，短时间内进行RNA扩增。但扩增产物常采用电泳、探针杂交、点杂交或化学发光等方法来完成定性检测。此外，Gen-Probe公司也发明了与基于核酸序列扩增原理完全类似的转录介导的扩增技术(Transcript ion Mediated Amplification简称TMA)(Journal of clinical Microbiology，35(3)，676-8，1997)，其与NASBA的核酸扩增方法几乎完全相同，只不过用MMLV逆转录酶替代AMV逆转录酶。TMA的扩增结果是通过杂交保护测定(Hybridization Protection Assay，简称HPA)技术进行定性检测的。其它恒温扩增技术，如链置换扩增(SDA)、基于螺旋酶的扩增(HDA)等都是类似的等温扩增技术，这些技术所需的酶成本高昂，引物设计复杂，技术要求更高，相对应的，其反应检测成本也很高。

因此，在目前的实验室研究及临床检测中所使用的核酸定量扩增检测方法主要以实时荧光定量PCR为主。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线进行定量分析。其荧光检测模式分为TaqMan荧光探针、TaqMan MGB荧光探针(在荧光探针分子3’端连接非荧光淬灭剂及MGB基团(Minor Groove Binder)，亦称为MGB探针)、SYBR Green荧光染料、分子信标(Molecular Beacon)探针和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，简称FRET)探针等。虽然实时荧光定量PCR方法的灵敏度和准确度较高，但检测成本相对昂贵，且检测过程还需依赖特殊设备，因此，该技术在操作方法和检测成本上都有很大的局限性。如果待测样品是RNA，还需将其利用反转录技术转变成cDNA才能进行后续的PCR反应，其试剂成本、技术要求和检测时间等都大大地提高或延长，灵敏度也不如DNA样本检测高。所以，RT-PCR虽然是目前最常见的用于RNA样本检测的技术，但大规模检测的推广困难很大。

国内杜蓬(专利申请号：200410025890.8)等人于2004年提出了将等温放大与TaqMan荧光探针或TaqMan MGB荧光探针结合的方法(QD1A)，但其提出的检测方法依然使用终端检测，虽然整个过程中无须打开反应管，解决了其它方法所可能引起的污染问题，但与实时荧光定量PCR相比，依然有很大的差距，而且该专利所提出的使用TaqMan或TaqMan MGB作荧光探针，此类探针的设计需要特殊的软件和很高的专业知识，该专利申请并没有提出具体的设计方法和探针序列实例。另外，该专利提出用逆转录酶的外切酶酶活性来降解TaqMan荧光探针以产生荧光信号。但国内外的文献中没有有关这方面的报道，也没有基于TaqMan或TaqMan MGB探针的利用恒温放大技术的产品或文献报导。这是一个全新的思路。目前，在核酸诊断领域，还没有将等温放大与检测同步进行的相关技术报道或发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种将核酸的恒温放大与检测同步进行的检验方法。

本发明所提供的核酸恒温同步放大检测方法，可包括以下步骤：

1)将含有下列组分的反应物混合：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负(-)链的3’端杂交；

d.一种或多种荧光探针；

e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；

f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；

2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定量或定性检测。

在上述核酸样品的恒温同步放大检测方法中，步骤1)中的待测核酸样品为RNA(包括mRNA、rRNA等)或DNA样品。

所述启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列。

若待测核酸样品为RNA，所述待测核酸样品的(-)链由反应中产生；若待测核酸样品为双链DNA，所述待测核酸样品的(-)链已存在于待测核酸样品中，该(-)链也可由反应中产生。

所述荧光探针可根据已有的技术知识和实验条件选自以下一种或几种类型探针的任意组合：分子信标(Molecular Beacon)、荧光共振(iFret)、蝎子探针(scorpinprobe)、荧光放大(Amplafluor)和分子火炬(molecular torch)。所述探针序列可以根据待测核酸样品和按照本领域已知的常规方法进行设计。

所述RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，具体来讲可为MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。

所述RNA聚合酶为T7、T3、M13或SP6RNA聚合酶。所用的RNA聚合酶是与所述启动子序列相对应的RNA聚合酶。

所述反应物可分为第一阶段反应物(除了e和f反应酶之外的所有组分)和第二阶段酶反应物(包含e和f反应酶)，所述第一阶段反应物中还可包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体可为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％(V/V)甘油(Glycerol)，0-25％(V/V)DMSO，0.1-2μM引物1，0.1-2μM引物2，0.1-2μM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还可包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体可为：100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％(V/V)TritonX-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％(V/V)甘油。

步骤2)中的恒温放大反应条件可为：先将除e和f反应酶外的第一阶段反应物充分混合，在55-90℃下温育2-30分钟后，再在42-55℃下温育2-30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55℃下继续温育30-120分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对待测样品进行定量或定性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比可为1-50∶1。

所述用于检测荧光信号的检测仪的选择是多种多样的，优选为AB1 7000、7300、7500、7700、7900系列，Stratagen MPX3000系列和Bio-Rad IQ系列等。

本发明的另一个目的是提供一种核酸恒温同步放大检测试剂盒。

本发明的试剂盒，可包括以下作为反应物的组分：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负(-)链的3’端杂交；

d.一种或多种荧光探针；

e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；

f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶。

在上述试剂盒中，所述反应物组分可分为第一阶段反应物(除了e和f反应酶之外的所有组分)和第二阶段酶反应物(包含e和f反应酶)，所述第一阶段反应物中还可包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体可为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40％(V/V)甘油(Glycerol)，0-25％(V/V)DMSO，0.1-2μM引物1，0.1-2μM引物2，0.1-2μM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还可包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体可为：100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，100-5000U RNA聚合酶，20-100mMTris，0.1-1％(V/V)Triton X-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％(V/V)甘油。

本发明提供一种核酸的恒温同步放大检测方法，是一种新的核酸同步等温扩增(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)方法。该方法采用反转录酶和RNA聚合酶与分子信标(molecular Beacon)、荧光共振(iFret，Fret)，蝎子探针(Scorpion probe)、荧光放大(Amplifluor)或分子火炬技术(Molecular Torch)等荧光检测技术相结合，将待测样品、两种引物、反转录酶、RNA聚合酶以及一种或组合荧光探针混合共同反应，并在核酸恒温放大的同时，实现对核酸样本的同步定性或定量检测。该方法的检测原理如图1所示，即将第一引物与待测核酸的3’端杂交，第一引物的5’端含有RNA聚合酶启动子序列；第二引物与待测核酸样品的互补链(由第一引物利用待测核酸为模板，经过引物延伸而产生)杂交，利用该互补链为模板进行新一轮引物延伸，从而产生一条带有双链DNA顺序的启动子序列，以此为模板，由RNA聚合酶转录更多的与第二引物互补的RNA产物，第二引物再以此为模板，经由第二引物延伸产生与之互补的cDNA链；随后，第一引物再以此cDNA为模板进行新一轮的引物延伸而形成带有启动子的双链DNA序列；然后，再以所产生的新的双链DNA为模板进行新一轮转录反应，产生更多的负链RNA。在反应体系中，同时含有与此负链RNA互补的荧光探针(如分子信标等)；随着负链RNA的增加，与之杂交的荧光探针的数量也随之增加；最后，通过检测荧光量的变化，达到实时检测的目的，所有反应在同一体系中、同一温度下同步进行。本发明的核酸检测方法明显优于现有的核酸检测技术，主要优点如下：

1.低污染：由于采用封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无须打开反应体系，因而避免了扩增子的污染；

2.多种检测方法可供选择：现有的荧光检测技术均适合于本发明的检测方法，使用者可以根据自己的经验或已有的技术知识和实验条件，从多种荧光信号的检测方法中任意选择；

3.快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降温循环，因而所需时间大大缩短；

4.设备简单：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无须升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低.

综上所述，本发明的方法具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验，适合大面积推广和应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

说明书附图

图1为本发明核酸的恒温同步放大检测方法的原理图

图2为用本发明的方法对淋球菌RNA的检测结果

图3为用本发明的方法对艾滋病毒(HIV-1)RNA的检测结果

图4为用本发明的方法对乙肝病毒(HBV)DNA的检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用试剂和方法如无特别说明均为常规试剂和方法。所有引物、分子信标及荧光探针序列均由美国ValueGene，BioNeer和Allele Biotech公司合成。

实施例1、细菌RNA的检测

以淋球菌RNA的检测为例，用本发明的方法对细菌RNA进行定量检测，具体方法包括以下步骤：

一、淋球菌RNA的提取

取淋球菌(ATCC NO.19424)的过夜(12-24小时)培养物，用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取淋球菌RNA。

二、引物1、引物2及分子信标的设计

根据淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)的16s rRNA序列(LOCUS#X07714，序列表中的序列1)设计了一个5’端为T7启动子序列的引物1和不带启动子的引物2，以及分子信标的序列，序列如下：

引物1：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTCAGACCCGCTACTGATCGTCGCCTTG-3’(带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)；

引物2：5’-CCTTCGGGCCTTGCGCTATCCGAG-3’；

分子信标：5’-GCACCGGCCGAUAUCUGAUUAGCUGGUUGGCGGUGC-3’，5’端标记的荧光基团为(FAM：6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein))，3’端标记的淬灭基团为Dabcyl4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

三、反应体系

第一阶段反应物的组分：50mM Tris，35mM KCl，20mM MgCl₂，4mM NTPS，1mM dNTPs，10％(V/V)甘油，5％(V/V)DMSO，0.5μM引物1，0.5μM引物2，0.5μM分子信标。

第二阶段酶反应物的组分：2000U MMLV反转录酶(美国RD BioSciences公司)，2000U T7 RNA聚合酶(美国RD BioSciences公司)，20mM Tris，0.5％(V/V)TritonX-100，30mM KCl，0.1mM EDTA，0.3mM DTT，25％(V/V)甘油。

四、检测

先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将50μl第一阶段反应物混合液加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的淋球菌RNA(1ug、10ng、100fg、不加RNA(0))充分混合，在60℃(55-90℃均可)下温育5min(2-30min均可)后，再在42℃(42-55℃下)下温育5min(2-30min)，在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此开始在42℃(42-55℃均可)下继续温育60min(30-120min均可)，用上海宏石实时荧光定量PCR(Slan)仪同步检测，荧光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。

五、结果

荧光信号的检测结果如图2所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值)，加入不同浓度的淋球菌RNA在不同时间(Ct)产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比。未加入淋球菌RNA的样品(阴性对照)在反应结束时(Ct＞60分钟)，没有产生高于背景的荧光信号，只有背景荧光信号。上述检测结果表明本发明的方法可用于细菌RNA的扩增与定性或定量的同步检测。

实施例2、病毒RNA的检测

以艾滋病毒(HIV-1)RNA的检测为例，用本发明的方法对病毒RNA进行定量检测，具体方法包括以下步骤：

一、艾滋病毒(HIV-1)RNA的获得

提纯的艾滋病(HIV-1)病原体RNA的体外转录产物由美国RD BioSciences公司提供，其产品说明书同时提供了RNA的含量和序列。

二、引物1、引物2及荧光探针的设计

根据艾滋病病原体(HIV-1)RNA的体外转录产物序列设计了一个5’端含有T7启动子序列的引物1和不带启动子的引物2，以及荧光探针的序列，序列如下：

引物1：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTGTTTTCCATAATCCCTAATGATC-3’(带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)；

引物2：5’-ACAGAGATCCACTTTGGAAAGG-3’；

荧光探针：5’Fam-GCACCAAACUACUCUGGAAAGGUGAAGGUGC-Dabcyl-3’，5’端标记的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)，3’端标记有Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

三、反应体系

第一阶段反应物的组分：25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPS，lmM dNTPs，5％(V/V)甘油，0.1μM引物1，0.1μM引物2，0.1μM分子信标。

第二阶段酶反应物的组分：2000U MMLV反转录酶(美国RD BioSciences公司)，2000U T7RNA聚合酶(美国RD BioSciences公司)，20mM Tris，0.1％(V/V)TritonX-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50％(V/V)甘油。

四、检测

先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将30μ1第一阶段反应物混合液加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的艾滋病病原体(HIV-1)RNA的体外转录产物(1ug、10ng、100fg、不加RNA(0))充分混合，在55℃(55-90℃均可)下温育30min(2-30min均可)后，再在42℃(42-55℃下)下温育30min(2-30min)，在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此升始在42℃(42-55℃均可)下继续温育120min(30-120min均可)，用AB1 7500实时荧光定量PCR仪同步检测，荧光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。

五、结果

荧光信号的检测结果如图3所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值)，加入不同浓度的艾滋病病原体(HIV-1)RNA的体外转录产物在不同时间(Ct)产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比。未加入艾滋病病原体(HIV-1)RNA的体外转录产物(阴性对照)的样品在反应结束时(Ct＞60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明本发明的方法可用于病毒RNA核酸的扩增与定性或定量的同步检测中。

实施例3、DNA的检测

以乙肝(HBV)病毒DNA的检测为例，用本发明的方法对DNA进行定量检测，具体方法包括以下步骤：

一、HBV病毒DNA的获得

带有克隆的HBV病毒DNA的质粒由美国RD BioSciences公司提供，其产品说明书同时提供了质粒DNA的含量和克隆的HBV病毒DNA序列(序列表中的序列3)。

二、引物1、引物2及荧光探针的设计

根据HBV病毒的DNA序列设计了一个5’端为T7启动子序列的引物1和不带启动子的引物2，以及荧光探针的序列，序列如下：

引物1：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCA-3’(带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)；

引物2：5’-CAGCGATAGCCAGGACAAATTGGAGGAC-3’；

荧光探针：5’Fam-GCACCAAGAGGUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUGGUGC-Dabcyl-3’，5’端标记的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)，3’端标记有Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

三、反应体系

第一阶段反应物的组分：30mM Tris，50mM KCl，50mM MgCl₂，1mM NTPS，10mM dNTPs，40％(V/V)甘油，1.5μM引物1，1.5μM引物2，0.5μM分子信标。

第二阶段酶反应物的组分：9000U MMLV反转录酶(美国RD BioSciences公司)，5000U T7 RNA聚合酶(美国RD BioSciences公司)，100mM Tris，1％(V/V)TritonX-100，100mM KCl，0.5mM EDTA，2mM DTT，50％(V/V)甘油。

四、检测

先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将40μl第一阶段反应物混合液加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的HBV病毒DNA(1ug、10ng、100fg、不加RNA(0))充分混合，在90℃(55-90℃均可)下温育2min(2-30min均可)后，再在55℃(42-55℃下)下温育2min(2-30min)，在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此开始在55℃(42-55℃均可)下继续温育30min(30-120min均可)，用ABI 7500实时荧光定量PCR仪同步检测，荧光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。

五、结果

荧光信号的检测结果如图4所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值)，加入不同浓度的HBV病毒DNA在不同时间(Ct)产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比。未加入HBV病毒DNA(阴性对照)的样品在反应结束时(Ct＞60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明本发明的方法可用于DNA靶标的扩增与定性或定量的同步检测中。

序列表

<160>3

<210>1

<211>1544

<212>RNA

<213>淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)

<400>1

ugaacauaag aguuugaucc uggcucagau ugaacgcugg cggcaugcuu uacacaugca    60

agucggacgg cagcacaggg aagcuugcuu cucggguggc gaguggcgaa cgggugagua   120

acauaucgga acguaccggg uagcggggga uaacugaucg aaagaucagc uaauaccgca   180

uacgucuuga gagggaaagc aggggaccuu cgggccuugc gcuauccgag cggccgauau   240

cugauuagcu gguuggcggg guaaaggccc accaaggcga cgaucaguag cgggucugag   300

aggaugaucc gccacacugg gacugagaca cggcccagac uccuacggga ggcagcagug   360

gggaauuuug gacaaugggc gcaagccuga uccagccaug ccgcgugucu gaagaaggcc   420

uucggguugu aaaggacuuu ugucagggaa gaaaaggcug uugccaauau cggcggccga   480

ugacgguacc ugaagaauaa gcaccggcua acuacgugcc agcagccgcg guaauacgua   540

gggugcgagc guuaaucgga auuacugggc guaaagcggg cgcagacggu uacuuaagca   600

ggaugugaaa uccccgggcu caacccggga acugcguucu gaacugggug acucgagugu   660

gucagaggga gguggaauuc cacguguagc agugaaaugc guagagaugu ggaggaauac   720

cgauggcgaa ggcagccucc ugggauaaca cugacguuca uguccgaaag cguggguagc   780

aaacaggauu agauacccug guaguccacg cccuaaacga ugucaauuag cuguugggca   840

acuugauugc uugguagcgu agcuaacgcg ugaaauugac cgccugggga guacggucgc   900

aagauuaaaa cucaaaggaa uugacgggga cccgcacaag cgguggauga uguggauuaa   960

uucgaugcaa cgcgaagaac cuuaccuggu uuugacaugu gcggaauccu ccggagacgg  1020

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cucauggccc uuaugaccag ggcuucacac gucauacaau ggucgguaca gaggguagcc  1260

aagccgcgag gcggagccaa ucucacaaaa ccgaucguag uccggauugc acucugcaac  1320

ucgagugcau gaagucggaa ucgcuaguaa ucgcagguca gcauacugcg gugaauacgu  1380

ucccgggucu uguacacacc gcccgucaca ccaugggagu gggggauacc agaaguaggu  1440

aggguaaccg caaggagucc gcuuaccacg guaugcuuca ugacuggggu gaagucguaa  1500

caagguagcc guaggggaac cugcggcugg aucaccuccu uucu                   1544

<210>2

<211>9732

<212>RNA

<213>艾滋病毒(HIV-1)

<400>2

uggaugggcu aauuuacucc aagaaaagac aagagauccc ugauuugugg gucuauaaua     60

cucaaggcuu cuucccugau uggcaaaacu acacaccagg gccagggacc agauucccac    120

uguguuuugg auggugcuuc aagcuaguac caguugaucc aagagaggua gaggaagaaa    180

acaaagggga aaacaacugc cuguuacacc ccaugagcca gcauggaaua gaugacaacg    240

aaagagaagu gcugaugugg aaguuugaca gcucccuagc acgaaaacac auagcccgag    300

aacugcgucc agaguacuac aaagacugcu gacaaagaag uuucuaacua ggacuuccgc    360

uggggacuuu ccaggggagg uguggccggg gaggaguugg ggaguggcua acccucagau    420

gcugcauaaa agcagccgcu uuucgcuugu acugggucuc ucuugguaga ccaggucgag    480

cccgggagcu cucuggcuag caagggaacc cacugcuuaa agccucaaua aagcuugccu    540

uaagugcuua aaguagugug ugcccgucug uguuaggacu cuaguaacua gagaucccuc    600

agaccacucu agacuaagua aaaaucucua gcaguggcgc ccgaacaggg acuugaaagc    660

gaaaguuaau agggacucga aagcgaaagu uccagagaag uucucucgac gcuggacucg    720

gcuugcugag guacacacag caagaggcga gagcggcgaa cugguaagua cgccaauuuu    780

ugacuagcag aagcuagaag gagagagaug ggugcgagag cgucaguauu aaguggggga    840

aaauuagaug caugggaaaa aauucgguua cggccaggag gaaagaaaaa auauaggaua    900

aaacauuuag uaugggcaag cagagaguua gaaagauucg cgcuuaaccc uggccucuua    960

gaaacagcag aaggauguca acagauaaua gaacaguuac agucaacucu caagacagga   1020

ucagaagaac uuaaaucauu auuuaauuua guaguaaccc ucuggugcgu acaccaaagg   1080

auagauguaa aagacaccaa ggaagcuuca gauaaauuag aggaaguaca aaagaagagc   1140

cagcaaaaaa cacagcaggc agcagcuggc acaggaagca gcagcaaagu cagccaaaau   1200

uacccuauag ugcaaaauac acaagggcaa augguacauc agccuuuauc accuagaacu   1260

cugaaugcau gggugaaagu aguagaggaa aaagguuuua acccagaagu aauacccaug   1320

uucucagcau uaucagaggg agccacccca caagauuuaa auaugaugcu aaauauagug   1380

gggggacacc aggcagcaau gcagauguua aaagaaacca ucaaugagga agcugcagaa   1440

ugggauaggu uacacccagu acaugcagga ccuauuccac caggccagau gaagcggcaa   1500

ccaaggggaa gugacauagc aggaacuacu aguacccuuc aagaacaaau aggauggaug   1560

acaaauaauc caccuauccc agugggagac aucuauaaaa gguggauaau ccugggauug   1620

aauaaaauag uaagaaugua uagcccuguu ggcauuuugg acauaaaaca agggccaaaa   1680

gagcccuuca gagacuaugu agacagguuu uauaaaacuc ucagagcgga acaagcuaca   1740

caggagguaa aaaacuggau gacagaaacc uuguuagucc aaaaugcgaa uccagacugu   1800

aaguccauuu uaaaagcauu aggaacagga gcuacauuag aagaaaugau gacagcaugc   1860

cagggagugg gaggaccuag ccauaaggca aggguuuugg cugaggcaau gagccauguu   1920

caaaauacaa auauaaugau gcagagaggc aauuuuaagg uccagaaaag aauuaagugc   1980

uucaacugug gcaaagaagg acaccuagcc agaaauugca gggccccuag aaagaagggu   2040

uguuggaaau gugggcaaga aggacaucaa augaaagacu gcacugggag acaggcuaau    2100

uuuuuaggca aaauuuggcc uuccaacaag ggaaggccag ggaauuuucc ucagagcaga    2160

acagagccaa cagccccacc agcagaaaau ugggggaugg gggaagagau aaccuccuuc    2220

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uuuggcaacg accccuuguu acaguaaaaa uaggaggaca guuaaaagaa gcucuauuag    2340

auacaggagc agaugauaca guauuagaag auauaaauuu gccaggaaaa uggaaaccaa    2400

aaaugauagg gggaauugga gguuuuauca agguaaggca auaugaucag auacuuguag    2460

aaauuugugg aaaaaaggcu auagguacag uguuaguagg accuacaccu gucaauauaa    2520

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acacuguacc aguaaaauua aagccaggaa uggauggacc aaaaguuaaa caguggccau    2640

ugacagaaga aaaaauaaaa gcauuaacag aaauuuguaa agagauggaa gaggaaggaa    2700

aaauuucaag aauugggccu gaggauccau acaauacucc aauauuugcu auaaagaaaa    2760

aggacagcac caaauggaga aaauuaguag auuucagaga gcucaauaaa agaacucagg    2820

acuuuuggga aguucaauua ggaauaccgc auccagcagg uuuaaaaaag aaaaaaucag    2880

uaacaguacu agauguggga gaugcauauu uuucaguucc uuuagaugag gacuuuagaa    2940

aguauacugc auucaccaua ccuaguauaa acaaugagac accaggaauc agauaucagu    3000

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aaaucuuaga gcccuauaga auaaaaaauc cagaaaugga uaucuaucaa uacauggaug    3120

auuuguuggu aggaucugac uuagaaauag gacagcacag agcaaaaaua gaggagcuaa    3180

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cauuccuuug gaugggauau gaacuccauc cugacagaug gacaguccag ccuauagaac    3300

ugccagaaaa agacagcugg acugucaaug auauacagaa auuaguggga aaacuaaauu    3360

gggcaaguca aauuuaugca gggauuaagg uaaagcaacu guguaaacuc cucaggggag    3420

cuaaaacacu aacagacgua guaccacuga cugaagaagc agaacuagaa uuggcagaga    3480

acagggagau ucuaaaaacc ccugugcaug gaguauauua ugacccauca aaagacuuag    3540

uggcagaagu acagaaacaa gggcaggacc aauggacaua ucaaauuuau caagagccau    3600

uuaaaaaucu aaaaacagga aaauaugcca gaaaaagguc ugcucacacu aaugauguaa    3660

gacaacuaac agaaguggug caaaaaauag ccacagaagg cauaguaaua uggggaaaga    3720

uuccuaaauu uagacuaccc auacaaaaag aaacauggga aacauggugg auggaauauu    3780

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gguaccaauu agaaaaagac ccuauaauag gagcagagac uuucuaugua gauggggcau    3900

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uaguuucccu aacugagaca acaaaucaaa agacugaauu acaugcaauc cauuuagccu    4020

ugcaggauuc aggaucagaa gugaacauag uaacagacuc acaauaugca uuaggaauca    4080

uucaugcaca accagacagg agugaaucag aaguagucaa ccaaauaaua gaggagcuaa    4140

uaaaaaagga aaaagucuac cugucauggg ugccagcaca caaggggauu ggaggaaaug    4200

aacaaguaga uaaauugguc aguucaggaa ucaggaaggu gcuguucuua gaugggauag    4260

auaaggcuca agaagaacau gaaagauauc acagcaauug gagaacaaug gcuagugauu    4320

uuaauuugcc accuauagua gcaaaggaaa uaguagccaa cugugauaaa ugucaacuaa    4380

aaggggaagc aaugcaugga caaguaggcu guaguccagg aauauggcaa uuagauugca    4440

cacaucuaga aggaaaaguc auccugguag caguccacgu ggccagugga uauauagaag    4500

cagaaguuau cccagcagaa acaggacagg aaacagcaua cuuucugcua aaauuagcag    4560

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gagaacaagc ugaacaccuu aagacagcug uacaaauggc aguauucauu cacaauuuua    4800

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agaucauuag ggauuaugga aaacagaugg caggugauga uuguguggca gguagacagg    5100

augaggauua gaacauggaa uaguuuagua aaacaucaua uguaugucuc aaagaaagcu    5160

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cacaucucac uaggagaggc uauauuagua auaagaacau auuggggucu gcagacagga    5280

gaaaaggacu ggcaauuggg ucauggaguc uccauagaau ggaggcagaa aaacuauaga    5340

acacaaauag auccugaccu agcagacaaa cugauucauu uauacuauuu ugacuguuuu    5400

ucagacucug ccauaaggaa agccauauua ggacaaguag uuagacguag gugugaauac    5460

ccaucaggac auaaccaggu aggauccuua caauauuugg cacugaaagc auuaacaaca    5520

ccaaaaaaga ucaggccacc ucugccuagu guuaaaaaau uaacagaaga cagauggaac    5580

aagccccaga agaucauggg ccacagagag aacccuacaa uuuauggaca uuagagcugu    5640

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gacaguacau cuauaacacu uauggggaua cuugggaagg gguugaagcc auaauaagaa    5760

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auaaaguagu acaaauugaa ccacuaggaa uagcacccac cagggcaaaa agaagagugg    7740

uggauagaga aaaaagagca gugggacuag gagcuaugau cuuuggguuc uuaggagcag    7800

caggaggcac uaugggcgca gcgucaauaa cgcugacggu acaggccaga caauuauugu    7860

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accuaaagga ucaaagguuc cuaggacuuu ggggcugcuc uggaaaaacc aucugcacca    8040

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gggggcagga acugaaaacu agugcuaucu cuuugcuuga ugcuauagca auaacaacag    8700

cgggguggac agauaggguu auagaaguua cacaaagagc uuggagagcu cuucuccaca    8760

uaccuagaag aaucagacag ggcuuugaaa gggcuuugcu auaaauggga ggcaaguggu    8820

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<210>3

<211>3191

<212>DNA

<213>HBV病毒

<400>3

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ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgaaggtct caatcgccgc gtcgcagaag    2400

atctcaatct cgggaatctc aatgttagta tcccttggac tcataaggtg ggaaacttta    2460

ctgggcttta ttcttctact gtacctgtct ttaatcctga gtggcaaact ccctcctttc    2520

ctaacattca tttacaggag gacattatta atagatgtga acaatatgtg ggccctctta    2580

cagttaatga aaaaaggaga ttaaaattaa ttatgcctgc taggttctat cctaacctta    2640

ccaaatattt gcccttggac aaaggcatta aaccttatta tcctgaacat gcagttaatc    2700

attacttcaa aactaggcat tatttacata ctctgtggaa ggctggcatt ctatataaaa    2760

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aatcctctgg gattctttcc cgatcaccag ttggaccctg cgttcggagc caactcaaac    2940

aatccagatt gggacttcaa ccccaacaag gatcactggc ccgaggcaaa tcaggtagga    3000

gcgggagcat tcgggccagg gttcacccca tcacacggcg gtcttttggg gtggagccct    3060

caggctcagg gcatattgac aacagtgcca gcagctcctc ctcctgcctc caccaatcgg    3120

cagtcaggaa gacagcctac tcccatctct ccacctctaa gagacagtca tcctcaggcc    3180

atacagtgga a                                                         3191

Claims (12)

1、核酸的恒温同步放大检测方法，包括以下步骤：

1)将含有下列组分的反应物混合：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负链的5’端杂交；

d.一种或多种荧光探针；

e.RNA依赖的DNA聚合酶；

f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；

2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对样品进行定量或定性检测.。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的待测核酸样品为RNA或DNA。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的荧光探针选自以下一种或几种类型探针的任意组合：分子信标、荧光共振、蝎子探针、荧光放大和分子火炬。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的所述RNA依赖的DNA聚合酶为MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的RNA聚合酶为T7、T3、M13或SP6 RNA聚合酶。

7、根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的反应物分为第一阶段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体为：10-50mMTris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.1-2μM引物1，0.1-2μM引物2，0.1-2μM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体为：100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％Triton X-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的恒温放大反应条件为：先将第一阶段反应物充分混合，在55-90℃下温育2-30分钟后，再在42-55℃下温育2-30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55℃下继续温育30-120分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对待测样品进行定量或定性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为1-50∶1。

9、根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述检测仪为AB1 7000、7300、7500、7700、7900系列，Stratagen MPX3000系列或Barad iQ系列。

10、权利要求1-9任一项所述的方法在临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测中的核酸检测中的应用。

11、一种核酸恒温同步放大检测试剂盒，包括以下作为反应物的组分：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负(-)链的3’端杂交；

d.一种或多种荧光探针；

e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；

f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶。

12、根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于：所述反应物组分分为第一阶段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体为：10-50mM Tris，20-90mMKCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.1-2μM引物1，0.1-2μM引物2，0.1-2μM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体为：100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％Triton X-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油。

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