CN117568493B - 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 - Google Patents
一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117568493B CN117568493B CN202410059133.XA CN202410059133A CN117568493B CN 117568493 B CN117568493 B CN 117568493B CN 202410059133 A CN202410059133 A CN 202410059133A CN 117568493 B CN117568493 B CN 117568493B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- identifying
- cell line
- probe
- reagent
- spodoptera frugiperda
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 82
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims abstract description 47
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 33
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 claims abstract description 32
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 138
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000015884 Cytochrome c oxidase subunit I Human genes 0.000 description 6
- 108050004212 Cytochrome c oxidase subunit I Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 3
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100035475 Blood vessel epicardial substance Human genes 0.000 description 1
- 101710174254 Blood vessel epicardial substance Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒。本发明的试剂包括用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTT，下游引物GGTAAATAATGCAACACGATGGTT，探针CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG；用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物AATGGAGCAGGAACTGGATGAA，下游引物ACTGAACTACCACCATGAGC，探针TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC。本发明的试剂仅需一次扩增即可鉴定粉纹夜蛾细胞系和草地贪叶蛾细胞系，灵敏度高、特异性强、重复性好，可快速检测大量样品，且无交叉反应。
Description
技术领域
本发明属于昆虫细胞系鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒。
背景技术
近年来，随着全球疫苗市场的扩张，杆状病毒表达系统（Baculovirus expressionsystem，BVES）获得广泛关注。杆状病毒表达系统在疫苗生产，重组蛋白表达，提高重组蛋白稳定性、产量及翻译后修饰等方面不断优化，昆虫细胞-BVES系统已成为四大常用表达系统之一。在过去的几十年内，人们从100多种昆虫中分离出数百种细胞系。其中，粉纹夜蛾细胞系（Trichoplusia nicell line，Tn）与草地贪叶蛾细胞系（Spodopteraugerdacell line，Sf）是工业生产中应用最为广泛的昆虫细胞系。
细胞系作为生物医学领域研究的重要材料，细胞交叉污染和辨识错误等问题屡见不鲜，为确保生产及科学研究中所使用的细胞系来源单一，避免不同昆虫细胞系间的交叉污染，昆虫细胞系鉴定的需求日益强烈。目前常用的种属鉴定方法主要包括染色体分析、同工酶分析、测序和PCR法。染色体分析、同工酶分析及测序方法存在操作复杂、耗时长、误差大以及成本高等问题，严重限制生物制品的生产推广及研发。PCR法能够缩短鉴定周期，并且具有高灵敏度以及高特异性等优势，从而渐渐推广开来。多重荧光定量PCR法的实时准确的鉴定效果是建立在所选取的引物和探针的基础上，因此能够准确鉴定昆虫细胞系的引物和探针的开发成为研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够同时快速、准确地鉴定粉纹夜蛾细胞系与草地贪叶蛾细胞系的试剂及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂，所述试剂包括用于鉴定粉纹夜蛾细胞系和草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针，
用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物的序列为5’-ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTT-3’或其互补序列，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的下游引物的序列为5’-GGTAAATAATGCAACACGATGGTT-3’或其互补序列，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针的序列为5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’或其互补序列；
用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物的序列为5’-AATGGAGCAGGAACTGGATGAA-3’或其互补序列，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的下游引物的序列为5’-ACTGAACTACCACCATGAGC-3’或其互补序列，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的序列为5’-TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC-3’或其互补序列。
优选地，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物的序列为5’-ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTT-3’，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的下游引物的序列为5’-GGTAAATAATGCAACACGATGGTT-3’，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针的序列为5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’；
用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物的序列为5’-AATGGAGCAGGAACTGGATGAA-3’，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的下游引物的序列为5’-ACTGAACTACCACCATGAGC-3’，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的序列为5’-TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC-3’。
优选地，用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物和下游引物的扩增片段的序列为：ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTTCATATTAAAAATTCAATTTTTTACAATATTTATTGGAGTAAATTTAACTTTTTTCCCCCAACATTTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTCGATATTCTGATTATCCTGACTCATATATTTCATGAAATATTATTTCCTCATTAGGTTCATATATTTCTTTATTAGCAGTAATATTTATATTAATTATTATTTGAGAATCTATAATTAACCATCGTGTTGCATTATTTACC；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物和下游引物的扩增片段的序列为：AATGGAGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCCCTCTCCTCTAATATTGCTCATGGTGGTAGTTCAGT。
进一步优选地，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针的5’端连接的荧光报告基团与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的5’端连接的荧光报告基团不同。
进一步优选地，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
根据一些实施方式，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针为：5’FAM-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’TAMRA；用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针为：5’VIC-TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC-3’TAMRA。
优选地，将用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针混合溶解在无酶水中得到所述试剂，其中用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物的浓度分别为8~15μM，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针和用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的浓度分别为4~6μM。
本发明第二方面还提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，所述试剂盒包括所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
本发明第三方面还提供一种鉴定昆虫细胞系的方法，以待鉴定细胞的DNA为模板，采用所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂或所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒进行多重荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待鉴定细胞的种属。
具体包括以下步骤：
从待测细胞样品中提取核酸；
以步骤1）的核酸为模板，使用上述用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒进行多重荧光PCR扩增反应，收集荧光信号；
根据荧光信号判定待测细胞样品是否为粉纹夜蛾细胞系以及是否为草地贪叶蛾细胞系。
优选地，所述步骤2）中多重荧光PCR扩增反应体系为：
2×qPCR 反应液 10μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL，逆转录酶 0.4μL，所述试剂（上游引物10μM、上游引物10μM、探针5μM） 0.4μL，模板（从待测细胞样品中提取的核酸）2μL，无酶无菌水 补足20μL。
优选地，所述多重荧光定量PCR反应的反应程序为：
94~96℃ 2~4min；
94~96℃ 8~12sec，58~62℃ 12~18sec，70~74℃ 28~32sec，循环38~42次。
优选地，多重荧光定量PCR反应后的结果判定方法为：在实验成立的基础上，如果待测样本检测结果在FAM通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判断为粉纹夜蛾细胞系核酸阳性，待测细胞样品含有粉纹夜蛾细胞系；如果在VIC通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判为草地贪叶蛾细胞系核酸阳性，待测细胞样品含有草地贪叶蛾细胞系；如果在两个通道检测无Ct值或Ct值＞38，则判为粉纹夜蛾细胞系及草地贪叶蛾细胞系核酸均为阴性，待测细胞样本既不是粉纹夜蛾细胞系也不是草地贪叶蛾细胞系；如果待测样本在任一通道35＜Ct值≤38，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测，重复检测结果无Ct值则为阴性，否则阳性。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的用于鉴定昆虫细胞系的试剂和试剂盒可以同时鉴定细胞样品是否属于粉纹夜蛾细胞系以及是否属于草地贪叶蛾细胞系，还可以快速鉴别这两种细胞系是否存在交叉污染。使用本发明的用于鉴定昆虫细胞系的试剂和试剂盒进行检测方法仅需一次扩增，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，可快速检测大量样品，并与其他细胞样本无交叉反应。
附图说明
图1为实施例1的试剂盒扩增阳性参考品和阴性参考品的扩增曲线图；
图2为实施例1的试剂盒扩增待测细胞样本中草地贪叶蛾细胞的敏感性扩增曲线图（待测细胞样品浓度从左至右依次为2×104个/mL、2×103个/mL、2×102个/mL、2×101个/mL）；
图3为实施例1的试剂盒扩增待测细胞样本中粉纹夜蛾细胞的敏感性扩增曲线图（待测细胞样品浓度从左至右依次为2×104个/mL、2×103个/mL、2×102个/mL、2×101个/mL）；
图4为对比例1的试剂盒扩增待测细胞样本的扩增曲线图；
图5为对比例2的试剂盒扩增待测细胞样本的扩增曲线图；
图6为对比例3的试剂盒扩增待测细胞样本的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，包括含有引物和探针的试剂、PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
含有引物和探针的试剂由人工合成的引物和探针溶解在无酶水中制得，保存在-20℃下。其中，用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物以及用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物的浓度分别为10μM，用于鉴定草地贪叶蛾细胞系和用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的探针的浓度分别为5μM。
引物和探针分别根据粉纹夜蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因及草地贪叶蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因设计。
用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Tn-F1：5’-ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTT-3’（SEQ ID NO：1）；
Tn-R1：5’-GGTAAATAATGCAACACGATGGTT-3’（SEQ ID NO：2）；
用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的探针为：
Tn-P：5’FAM-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’TAMRA（SEQ ID NO：3）。
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Sf-F1：5’-AATGGAGCAGGAACTGGATGAA-3’（SEQ ID NO：4）；
Sf-R1：5’-ACTGAACTACCACCATGAGC-3’（SEQ ID NO：5）；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的探针为：
Sf-P：5’VIC-TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC-3’TAMRA（SEQ ID NO：6）。
PCR反应液为上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液（BeyoFastTM ProbeqPCR Mix（2×））。
TaqDNA聚合酶（5 U/μL）为赛默飞世尔科技公司的TaqDNA聚合酶（DreamTaq DNAPolymerase（5 U/μL））。
逆转录酶为赛默飞世尔科技公司的逆转录酶（SuperScript™ IV）。
用于试剂盒性能测试的阳性参考品为人工合成的粉纹夜蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因核酸片段和人工合成的草地贪叶蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因核酸片段的混合物。其中人工合成的粉纹夜蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因核酸片段序列为：ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTTCATATTAAAAATTCAATTTTTTACAATATTTATTGGAGTAAATTTAACTTTTTTCCCCCAACATTTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTCGATATTCTGATTATCCTGACTCATATATTTCATGAAATATTATTTCCTCATTAGGTTCATATATTTCTTTATTAGCAGTAATATTTATATTAATTATTATTTGAGAATCTATAATTAACCATCGTGTTGCATTATTTACC（SEQ ID NO：7），人工合成的草地贪叶蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（CO1）基因核酸片段序列为：AATGGAGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCCCTCTCCTCTAATATTGCTCATGGTGGTAGTTCAGT（SEQ ID NO：8）。
用于试剂盒性能测试的阴性参考品为无酶水（RNase/DNase free water）。
用于试剂盒性能测试的待测细胞样本为粉纹夜蛾细胞培养液和草地贪叶蛾细胞培养液的混合样本（粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞在混合样本中的含量分别为2×104个/mL）。使用液体培养基将上述混合样本按照10倍浓度稀释为粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞的含量分别为2×103个/mL的混合样本、粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞的含量分别为2×102个/mL的混合样本、粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞的含量分别为2×101个/mL的混合样本。分别对上述待测细胞样本提取DNA作为扩增的模板。
其中，上述稀释采用的液体培养基、粉纹夜蛾细胞培养液和草地贪叶蛾细胞培养液所采用的液体培养基均为Grace昆虫培养基（Grace's Insect Medium），粉纹夜蛾细胞培养液和草地贪叶蛾细胞培养液分别采用本领域常规方法制备得到。
待测细胞样本DNA的提取方法为：使用赛默飞PureLink™基因组DNA小提试剂盒，参照说明书进行DNA提取。
测试方法为：
1）配制多重PCR反应体系：
PCR反应体系（20μL）：2×qPCR 反应液 10μL；TaqDNA聚合酶 0.4μL；逆转录酶 0.4μL；含有引物和探针的试剂 0.4μL；阳性参考品或阴性参考品或从待测细胞样本中提取的DNA 2μL；无酶无菌水（RNase/DNase free water）补足至20μL。
2）PCR反应条件：95℃/3 min；95℃/10s，60℃/15s，72℃/30s，共40个循环；在72℃退火延伸时采集荧光信号，获得阳性参考品和阴性参考品扩增曲线（图1）及不同浓度的待测细胞样本扩增曲线（图2、图3）。
图1显示，阳性参照品在FAM通道和VIC通道均出现Ct值，均出现相应的扩增曲线，阴性参照品在FAM通道和VIC通道均未出现扩增曲线。此外，阳性参考品和阴性参考品在其余通道中均未出现有效的扩增曲线，说明特异性好。
图2显示，本实施例的试剂盒对不同浓度的待测细胞样本中的草地贪叶蛾细胞均具有明显的扩增曲线，对草地贪叶蛾细胞的检测灵敏度可达2×101个/mL。
图3显示，本实施例的试剂盒对不同浓度的待测细胞样本中的粉纹夜蛾细胞均具有明显的扩增曲线，对粉纹夜蛾细胞的检测灵敏度可达2×101个/mL。
对比例1
本对比例提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同，本对比例中的引物和探针与实施例1中的引物和探针是根据同样的基因序列设计的。其中，用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Tn-F1：5’-TGGAGCAGGAACTGGTTG-3’（SEQ ID NO：9）；
Tn-R1：5’-GTAATACCTACAGCTCAAAT-3’（SEQ ID NO：10）；
用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的探针为：
Tn-P：5’FAM-TTCATCTAATATTGCCCATGGAGGA-3’TAMRA（SEQ ID NO：11）。
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Sf-F1：5’-GGAATTTGAGCAGGAATAGTAGGT-3’（SEQ ID NO：12）；
Sf-R1：5’-ACGTGGGAAAGCTATATCAGGA-3’（SEQ ID NO：13）；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的探针为：
Sf-P：5’VIC-GAGCTGAATTAGGAACTCCAGGATCTT-3’TAMRA（SEQ ID NO：14）。
采用本对比例的试剂盒按照实施例1中的检测方法对实施例1中的待测细胞样本进行检测，结果如图4所示，本对比例的试剂盒对不同细胞浓度的待测样本的扩增均不及实施例1，FAM通道无有效扩增曲线，完全无法检测粉纹夜蛾细胞系；VIC通道扩增不稳定，扩增曲线曲折波动，指数期和平台期不稳定，无法有效检测草地贪叶蛾细胞系。
对比例2
本对比例提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同，本对比例中的引物和探针与实施例1中的引物和探针是根据同样的基因序列设计的。其中，用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Tn-F1：5’-TTTTTTGGTCACCCTGAA-3’（SEQ ID NO：15）；
Tn-R1：5’-GCTCGTGTATCAATATCT-3’（SEQ ID NO：16）；
用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的探针为：
Tn-P：5’FAM-ATTTGGGATAATTTCCCATATTATT-3’TAMRA（SEQ ID NO：17）。
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Sf-F1：5’-AGAAAATGGAGCAGGAAC-3’（SEQ ID NO：18）；
Sf-R1：5’-CCAGCTAAATGAAGTGAG-3’（SEQ ID NO：19）；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的探针为：
Sf-P：5’VIC-GTTTACCCCCCCCTCTCCTCTAATAT-3’TAMRA（SEQ ID NO：20）。
采用本对比例的试剂盒按照实施例1中的检测方法对实施例1中的待测细胞样本进行检测（粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞的含量分别为2×104个/mL、2×103个/mL），结果显示FAM通道扩增效率低，反应不稳定，存在非特异性扩增，不能有效检测粉纹夜蛾细胞系；VIC通道无有效扩增曲线，完全无法检测草地贪叶蛾细胞系。
对比例3
本对比例提供一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同，本对比例中的引物和探针与实施例1中的引物和探针是根据同样的基因序列设计的。其中，用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Tn-F1：5’-GCTGATTAGCTACATTCC-3’（SEQ ID NO：21）；
Tn-R1：5’-ACACCAGTTAAACCCCCT-3’（SEQ ID NO：22）；
用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的探针为：
Tn-P：5’FAM-TTATTCTCCCTCTATTTTATGAAGT-3’TAMRA（SEQ ID NO：23）。
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物分别为：
Sf-F1：5’-GACTTTTACCCCCATCTT-3’（SEQ ID NO：24）；
Sf-R1：5’-ATCTACTGAACTACCACC-3’（SEQ ID NO：25）；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的探针为：
Sf-P：5’VIC-GCATTGTAGAAAATGGAGCAGGAAC-3’TAMRA（SEQ ID NO：26）。
采用本对比例的试剂盒按照实施例1中的检测方法对实施例1中的待测细胞样本（粉纹夜蛾细胞和草地贪叶蛾细胞的含量分别为2×104个/mL）进行检测，结果显示本对比例的试剂盒，检测过程中FAM通道和VIC通道扩增不稳定，扩增曲线曲折，不能有效检测。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于鉴定粉纹夜蛾细胞系和草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针，
用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物的序列为5’-ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTT-3’，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的下游引物的序列为5’-GGTAAATAATGCAACACGATGGTT-3’，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针的序列为5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’；
用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物的序列为5’-AATGGAGCAGGAACTGGATGAA-3’，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的下游引物的序列为5’-ACTGAACTACCACCATGAGC-3’，用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的序列为5’-TTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂，其特征在于，用于鉴定粉纹夜蛾细胞系的上游引物和下游引物的扩增片段的序列为：ACGGGTCTTTCTTTAAACCCTTTCATATTAAAAATTCAATTTTTTACAATATTTATTGGAGTAAATTTAACTTTTTTCCCCCAACATTTTCTAGGATTAGCAGGCATACCTCGTCGATATTCTGATTATCCTGACTCATATATTTCATGAAATATTATTTCCTCATTAGGTTCATATATTTCTTTATTAGCAGTAATATTTATATTAATTATTATTTGAGAATCTATAATTAACCATCGTGTTGCATTATTTACC；
用于鉴定草地贪叶蛾细胞系的上游引物和下游引物的扩增片段的序列为：AATGGAGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCCCTCTCCTCTAATATTGCTCATGGTGGTAGTTCAGT。
3.根据权利要求1所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针的5’端连接的荧光报告基团与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的5’端连接的荧光报告基团不同。
4.根据权利要求3所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
5.根据权利要求1所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂，其特征在于，将用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物和探针混合溶解在无酶水中得到所述试剂，其中用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的上游引物、下游引物与用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的上游引物、下游引物的浓度分别为8~15μM，用于鉴定所述粉纹夜蛾细胞系的探针和用于鉴定所述草地贪叶蛾细胞系的探针的浓度分别为4~6μM。
6.一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至5中任一项所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂。
7.根据权利要求6所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
8.一种鉴定昆虫细胞系的方法，其特征在于，以待鉴定细胞的DNA为模板，采用权利要求1至5中任一项所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂或权利要求6或7所述的用于鉴定昆虫细胞系的试剂盒进行多重荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待鉴定细胞的种属。
9.根据权利要求8所述的鉴定昆虫细胞系的方法，其特征在于，所述多重荧光定量PCR反应的反应程序为：
94~96℃ 2~4min；
94~96℃ 8~12sec，58~62℃ 12~18sec，70~74℃ 28~32sec，循环38~42次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410059133.XA CN117568493B (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410059133.XA CN117568493B (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117568493A CN117568493A (zh) | 2024-02-20 |
| CN117568493B true CN117568493B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=89890463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410059133.XA Active CN117568493B (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117568493B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105255883A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-20 | 青岛农业大学 | 一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的pcr引物及其鉴别方法 |
| CN113308552A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-08-27 | 四川大学 | 一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法 |
| CN113604585A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-05 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 一种通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用 |
| CN116064367A (zh) * | 2015-11-01 | 2023-05-05 | 格里科贝克有限责任公司 | 无病毒细胞系及获得其的方法 |
| CN116716415A (zh) * | 2023-06-27 | 2023-09-08 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种用于昆虫细胞dna残留含量定量检测的引物探针及其方法和应用 |
-
2024
- 2024-01-16 CN CN202410059133.XA patent/CN117568493B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064367A (zh) * | 2015-11-01 | 2023-05-05 | 格里科贝克有限责任公司 | 无病毒细胞系及获得其的方法 |
| CN105255883A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-20 | 青岛农业大学 | 一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的pcr引物及其鉴别方法 |
| CN113308552A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-08-27 | 四川大学 | 一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法 |
| CN113604585A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-05 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 一种通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用 |
| CN116716415A (zh) * | 2023-06-27 | 2023-09-08 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种用于昆虫细胞dna残留含量定量检测的引物探针及其方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117568493A (zh) | 2024-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111560482B (zh) | 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人乳头瘤病毒检测试剂盒 | |
| WO2019192156A1 (zh) | 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 | |
| CA2378408C (en) | Polynucleotide amplification method | |
| CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
| CN107475252B (zh) | 一种核酸释放剂及快速释放核酸的方法及其应用 | |
| EP3353320B1 (en) | Improved detection of short homopolymeric repeats | |
| US20200232014A1 (en) | Systems and methods for isolating nucleic acids | |
| CN112322705A (zh) | 一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光rma方法 | |
| CN112585279A (zh) | 一种rna建库方法及试剂盒 | |
| CN111893216A (zh) | 核酸质谱检测dna/rna的产品及检测方法 | |
| CN117568493B (zh) | 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 | |
| CN110241200B (zh) | Flt3-itd突变高灵敏度检测方法及试剂盒 | |
| CN107022621A (zh) | Braf基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
| CN114672548B (zh) | 一种人类静脉血栓风险基因pai-1，thbd和proc基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN114350767A (zh) | 检测jak2基因v617f突变的引物和探针及其应用和试剂盒 | |
| CN112029836A (zh) | 检测braf基因突变的核酸组合物及试剂盒和braf基因突变的检测方法 | |
| CN111154836A (zh) | 靶向核酸捕获和检测方法 | |
| CN114350768B (zh) | 血液样本dna直接扩增试剂及其应用 | |
| CN113322353B (zh) | 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒 | |
| CN113862394B (zh) | 一种番茄不孕病毒的rpa检测方法 | |
| CN114085895B (zh) | 快速检测msi的检测引物及其试剂盒 | |
| CN116426618A (zh) | 一种用于法医鉴定的同时检测dna遗传标记和rna分子标记的方法 | |
| CN116732023A (zh) | 一种核酸释放剂及释放核酸方法及其应用 | |
| CN116463396A (zh) | 一种多用途rna靶分子的制备方法 | |
| CN113373262A (zh) | 一种用于新型冠状病毒检测的引物探针、试剂盒及快速检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |