CN116064367A - 无病毒细胞系及获得其的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及无病毒细胞系及获得其的方法。本发明的教导涉及源自病毒污染的起始物质诸如生物体或细胞系的新型无病毒细胞系。还提供了用于获得从病毒污染的起始物质获得的无病毒细胞系的方法。示例性无病毒细胞系包括：源自被Sf‑弹状病毒(Sf‑rhabdovirus)污染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系的新型细胞系，其中所述新型细胞系缺乏Sf‑弹状病毒；以及源自被α野田村病毒(alphanodavirus)污染的粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系的新型细胞系，其中所述新型细胞系缺乏α野田村病毒。

Description

无病毒细胞系及获得其的方法
本申请是申请日为2016年11月01日，申请号为201680071306.3，发明名称为“无病毒细胞系及获得其的方法”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年11月1日提交的美国临时申请序列号62/249,288的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
领域
本发明的教导通常涉及不含污染病毒的连续细胞系。本发明的教导还涉及用于获得无病毒细胞系的方法，所述无病毒细胞系源自被病毒污染的细胞或生物体。
背景
体外繁殖的细胞可以大致被分类为原代细胞或连续细胞系(也被称为建立的细胞系)。原代细胞可以通过从生物体分离器官或组织并且使其解聚以形成个体细胞的混合物来获得。当原代细胞在培养物中繁殖时，它们仅分裂有限次数，然后失去其增殖能力，这是一种由遗传决定的事件，称为衰老。然而，一些细胞经历了被称为转化的过程并且获得了无限期分裂的能力。这些细胞被称为转化细胞或连续细胞。与连续细胞系源自其的组织或器官中发现的天然存在的细胞相比，连续细胞系通常具有遗传异常，诸如非整倍性或异倍性，并且缺乏常见于原代细胞的接触抑制和贴壁依赖性(anchorage dependence)。
多年来，已经一再发现用于生物生产的培养的细胞被病毒污染。例如，在20世纪60年代早期，发现了在原代恒河猴(Rhesus monkey)肾(RMK)细胞中产生的腺病毒疫苗和脊髓灰质炎病毒疫苗被猿猴(simian)病毒40(SV40)污染。随后证明了SV40在仓鼠中引起肿瘤并且在已经接受了在原代RMK细胞中产生的灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的人中检测到针对SV40的抗体。在20世纪70年代，发现了几批活的麻疹、腮腺炎、风疹和脊髓灰质炎疫苗均被称为噬菌体的细菌病毒污染。在鸡胚成纤维细胞中产生的黄热病、麻疹和腮腺炎的减毒疫苗中发现禽白血病病毒(ALV)和内源禽病毒(AEV)。疫苗相关的ALV和AEV的来源被认为是整合到鸡基因组中的内源逆转录病毒。最近，发现几批轮状病毒疫苗被感染性猪圆环病毒-1(PCV-1)污染。
自杆状病毒-昆虫细胞系统(BICS)在20世纪80年代早期在同行评议的文献中首次被描述以来，其已成为被广泛认可并且被大量利用的重组蛋白生产平台。BICS的优势包括其灵活性、速度、简单性、真核蛋白加工能力以及产生多亚基蛋白复合物的能力。近30年来，BICS主要用于产生用于学术和工业实验室中的基础研究的重组蛋白。然而，最近，BICS成为了一个真正的商业制造平台，现在它被用于产生几种生物制剂(biologics)，所述生物制剂被许可用于在人类(
Figure BDA0003892913750000021
和
Figure BDA0003892913750000022
)或兽医(
Figure BDA0003892913750000023
PESTI、BAYOVAC CSF
Figure BDA0003892913750000024
Figure BDA0003892913750000025
PCV、INGELVAC
Figure BDA0003892913750000026
和
Figure BDA0003892913750000027
PCV)药物中使用。另外，BICS正在被用于产生几种另外的生物制剂，包括在人类临床试验不同阶段中的诺罗病毒(noroviral)、细小病毒、埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒和戊型肝炎病毒疫苗候选物。
在BICS中最常用作宿主的昆虫细胞系源自粉纹夜蛾(cabbage looper)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Tn))或秋粘虫(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf))，并且用BICS制造的大多数生物制剂均使用后者产生。原始Sf细胞系(被命名为IPLB-SF-21、也被称为Sf-21)在1977年源自蛹卵巢。其他常用的Sf细胞系包括Sf9(IPLB-SF-21的亚克隆)及其子代亚克隆，包括Super 9和Sf900+，也被称为
Figure BDA0003892913750000028
如在1970年由Hink报道的，原始Tn细胞系(被命名为TN-368)源自从新出现的处女雌蛾中分离的卵巢组织。其他常用的Tn细胞系包括BTI-Tn-5B1-4(商品化为HIGHFIVETM)和Tni PRO细胞。
在2007年，来自日本和新西兰的一组科学家发现BTI-Tn-5B1-4细胞被新型的野田村病毒(nodavirus)(Li等,J.Virol.81:10890-96)(本文被命名为“Tn-野田村病毒”)污染。当我们发现我们的所有实验室Tn细胞系(包括TN-368、BTI-Tn-5B1-4和Tni PRO)均被这种病毒污染时，我们证实并且扩展了这一发现。随后，在2014年，美国FDA生物制剂研究与评价中心(CBER)的科学家发现，每个测试的Sf细胞系(包括从两个信誉良好的商业来源获得的Sf-21和Sf9细胞)均被弹状病毒(现被称为Sf-弹状病毒)污染(Ma等,J.Virol.88:6576-85,2014)。Takeda Vaccines,Inc.的一个研究组独立地证实了用于产生他们的诺如病毒疫苗候选物的Sf9细胞中Sf-弹状病毒的存在(Takeda Vaccines,Inc.,美国专利申请公布号US2016/0244487；PCT/US14/59060)。另外，我们发现我们的所有实验室Sf细胞系，包括从多种来源获得的Sf-21、Sf9和
Figure BDA0003892913750000031
均被这种病毒污染。
对不含污染病毒的细胞系以及对用于产生从病毒感染的细胞系或者被持续感染的或包含内源病毒的生物体获得的无病毒细胞系的方法存在需求。
概述
本发明的教导涉及源自病毒污染的细胞或生物体的建立的细胞系，其中所述细胞系的特征在于缺乏病毒，同时保留相关的细胞功能。此类建立的细胞系作为用于产生用于人类和兽医用途的疫苗、重组蛋白和生物制剂的生物平台，例如BICS的组分特别有用。本发明的教导还涉及用于从被病毒污染的细胞或由于例如但不限于持续感染或由于内源病毒而被病毒污染的生物体获得无病毒的建立的细胞系的方法。
根据一个示例性实施方案，建立的昆虫细胞系直接地或间接地从秋粘虫(草地贪夜蛾)获得。与Sf9细胞和Sf9细胞系源自其的秋粘虫不同，该细胞系的特征在于缺乏Sf-弹状病毒。当与Sf9细胞系相比时，该示例性的建立的细胞系的细胞：在培养物中生长至相同或非常相似的细胞密度，具有相同或非常相似的细胞直径(尺寸)，具有相同或非常相似的倍增时间(生长速率)，并且产生相似的N-糖基化模式。这种新型建立的细胞系的细胞在功能上与Sf9细胞不同，因为它们通过AcP(-)p6.9hEPO或AcP(-)p6.9hSEAP产生更多的感染性的重组杆状病毒颗粒，并且不被Sf-弹状病毒污染。这种新型建立的细胞系的特征还在于在结构上(遗传上)与Sf9细胞源自其的草地贪夜蛾和Sf-21细胞不同。
根据某些细胞系实施方案，特征在于缺乏病毒的示例性的建立的细胞系源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞。在某些实施方案中，细胞系源自病毒污染的粉纹夜蛾细胞。在某些实施方案中，粉纹夜蛾细胞系为TN-368细胞系。在某些实施方案中，病毒为α野田村病毒。根据某些实施方案，细胞系的特征还在于，当所述细胞系和TN-368细胞在相同条件下繁殖时，与所述TN-368细胞相同或实质上相同的细胞密度、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
根据另一个示例性的建立的细胞系的实施方案，昆虫细胞系直接地或间接地从粉纹夜蛾(cabbage looper)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))获得。与源自粉纹夜蛾的TN-368细胞不同，该细胞系的特征在于缺乏野田村病毒。当与TN-368细胞系相比时，该示例性的建立的细胞系的细胞：在培养物中生长至相同或非常相似的细胞密度，具有相同或非常相似的细胞直径(尺寸)，并且产生相似的N-糖基化模式。
根据用于获得源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的无病毒细胞系的示例性方法，包括：从病毒污染的生物体或从病毒污染的细胞分离细胞；将分离的细胞与包含抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第一培养物组合物；将第一培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而产生多个细胞；取出多个细胞或细胞培养基的一部分并且测试病毒的存在或不存在；将所述多个细胞中的至少一些与不具有抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第二培养物组合物；并且将第二培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而获得无病毒细胞系。
根据某些示例性方法，通过从病毒感染的原代细胞、被病毒污染的细胞系或受污染的生物体分离单细胞或少量细胞来获得建立的细胞系。将分离的细胞与包含抗病毒化合物的细胞培养基组合，形成第一培养物组合物。将第一培养物组合物在允许细胞生长和分裂的条件下孵育，从而产生多个细胞。将培养基定期地更换为包含抗病毒化合物的新鲜培养基。测试从第一培养物组合物获得的少量细胞或从第一培养物组合物获得的一定体积的培养基中病毒的存在或不存在。当未检测到病毒核酸时，将来自第一培养物组合物的细胞中的至少一些与不具有抗病毒化合物的培养基混合以形成第二培养物组合物。将第二培养物组合物在允许细胞生长和分裂的条件下孵育，并且将培养基定期地更换为新鲜培养基。在某些实施方案中，随着细胞继续生长，包括当细胞定期被分开(也称为传代)时，细胞数目增加并且细胞从一个生长容器扩增至多个容器。在某些实施方案中，测试来自至少一个生长容器的细胞样品或培养基样品中病毒核酸的存在或不存在，所述病毒核酸是一种用于确定病毒存在的指示物。在细胞数目已经达到足够量后，细胞的等分试样可以使用已知方法冷冻或储存。
附图简述
考虑到以下描述、所附权利要求和附图，本发明教导的这些及其他特征和优势将逐渐被更好地理解。本领域技术人员将理解，下文描述的附图仅用于说明性目的，并且不意图以任何方式限制所公开的教导的范围。
图1A-图1C：用抗病毒药物处理的多克隆Sf9细胞中的Sf-弹状病毒。将多克隆Sf9细胞群体用不同浓度的利巴韦林(ribavirin)(图1A和图1B)或利巴韦林、6-氮杂尿苷(6-azauridine)和阿糖腺苷(vidarabine)(图1C)处理约一个月，并且然后提取总RNA并且通过RT-PCR测试Sf-弹状病毒RNA，如实施例4中描述的。图1A和图1C中示出的结果使用来自仍然在抗病毒药物存在下培养的细胞的RNA获得，而图1B中示出的结果使用来自已经用利巴韦林处理但然后在抗病毒药物不存在下传代12次的细胞的RNA获得，如实施例2中描述的。从Sf9细胞或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2R+细胞(图1A-图1C、图2A-图2B、图3A-图3C中的“S2”)提取的总RNA分别用作阳性和阴性对照。另外的阴性对照反应在无模板(H2O)的情况下进行。标记为“M”的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图2A-图2B：在分离的抗病毒药物处理的Sf9细胞亚克隆中的Sf-弹状病毒。将单个Sf9细胞亚克隆通过有限稀释进行分离并且用不同抗病毒药物处理约一个月，并且然后从个体克隆提取总RNA并通过RT-PCR(图2A)或RT-PCR随后是巢式PCR(图2B)测试Sf-弹状病毒RNA，如实施例4中描述的。图2A-图2B中示出的所有结果使用来自仍然在抗病毒药物的存在下培养的细胞的RNA获得。阳性和阴性对照以及100-bp标志物如图1A-图1C的简要描述中描述。
图3A-图3C：Sf-RVN细胞中Sf-弹状病毒的不存在。从在不同传代水平的被称为“Sf-RVN”的示例性细胞系中分离总RNA，并且使用Sf-弹状病毒特异性RT-PCR随后是巢式PCR测定Sf-弹状病毒的存在，如实施例4中描述的。该示例性细胞系通过对在图2B中发现为Sf-弹状病毒污染阴性的6-氮杂尿苷处理的Sf9亚克隆进行扩增来产生。Sf-弹状病毒特异性RT-PCR/巢式PCR结果表明在Sf-RVN细胞的60代传代和120代传代过程中不存在Sf-弹状病毒(分别为图3A和图3B)。我们还从通过超速离心来自在第60代传代的Sf-RVN细胞的无细胞培养基(CFM)获得的沉淀物部分中分离总RNA。使用Sf-弹状病毒特异性RT-PCR/巢式PCR测定来自该CFM沉淀物的总RNA的Sf-弹状病毒。如图3C中示出的，在对应于从Sf9细胞中分离的RNA和从Sf9的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA的泳道中观察到Sf-弹状病毒扩增子(图3C，分别为泳道Sf9和Sf9 CFM)。相比之下，在从Sf-RVN的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA中未检测到Sf-弹状病毒扩增子(图3C，泳道Sf-RVN CFM)。图3A-图3C中示出的所有结果使用来自在抗病毒药物不存在下培养的细胞的RNA获得。从Sf9细胞和从通过超速离心Sf9CFM获得的沉淀物提取的RNA用作阳性对照；并且从S2R+细胞提取的RNA(S2)用作阴性对照。另外的阴性对照反应在无模板(H2O)的情况下进行，并且标记为M的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图4：支原体测定。使用基于PCR的通用支原体检测试剂盒(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))测定Sf-RVN和Sf9细胞提取物(-)的支原体污染，如实施例6中描述的。编码精氨酸支原体(M.arginini)rRNA靶序列的质粒用作阳性对照(图4，泳道“精氨酸支原体(M.arginini)”)。另外的对照使用掺入该质粒的Sf-RVN和Sf9细胞裂解物进行(图4，分别标记为Sf-RVN(+)和Sf9(+)的泳道)以确定裂解物是否干扰测定。阴性对照反应在无模板的情况下进行(图4，泳道H2O)。标记为M的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图5A-图5D：夜蛾属(Spodoptera)细胞生长和形态学。将Sf-RVN和Sf9细胞以1.0×106个细胞/mL的密度接种到摇瓶中的ESF 921培养基中。在接种之后在不同时间收获一式三份的样品，并且用自动细胞计数器测量存活细胞的计数和直径，如实施例7中描述的。该图示出了在三个独立实验中测量的平均存活细胞密度(图5A)、直径(图5B)和倍增时间(图5C)，以及以10×放大率的Sf-RVN和Sf9细胞的相差显微照片(图5D)。误差条(error bars)代表置信区间(P<0.05)。
图6A-图6B：在杆状病毒感染之后的细胞存活力。将Sf-RVN和Sf9细胞以0.1pfu/细胞(图6A)或5pfu/细胞(图6B)的MOI用无Sf-弹状杆菌病毒的AcP(-)p6.9hSEAP原种(stock)感染。在感染后的不同时间收获一式三份的样品，并且使用自动细胞计数器测量存活力，如实施例7中描述的。该图示出了在两个独立实验中测量的平均存活力百分比。误差条代表置信区间(P<0.05)。
图7A-图7C：重组β-gal产生。将Sf-RVN和Sf9细胞以5pfu/细胞的MOI用无Sf-弹状病毒的BacPAK6-ΔChi/Cath原种感染。在感染后的不同时间收获一式三份的样品，并且测定澄清的细胞内提取物的β-gal活性(图7A)，如实施例9中描述的。该图示出了平均结果，其中误差条代表置信区间(P<0.05)。还使用一组提取物以通过免疫印迹分析(图7B)与扫描激光密度测定法(scanning laser densitometry)(图7C)测量总细胞内β-gal产生水平，以估计相对免疫反应条带密度。在该实验的两个独立的生物学重复中观察到相同的一般性趋势。
图8A-图8F：重组hSEAP产生。将Sf-RVN和Sf9细胞以0.1pfu/细胞(图8A、图8B、和图8C)或5pfu/细胞(图8D、图8E和图8F)的MOI用无Sf-弹状病毒的AcP(-)p6.9hSEAP原种感染。在感染后的不同时间收获一式三份的样品，制备无细胞培养基并且测定hSEAP活性，如实施例9中描述的，并且绘制平均结果，其中误差条代表置信区间(P<0.05；图8A和图8D)。还使用一组无细胞培养基以通过免疫印迹分析(图8B和图8E)与扫描激光密度测定法(图8C和8F)测量总细胞内hSEAP产生水平，以估计相对免疫反应条带密度。
图9A-图9B：重组hEPO产生。将Sf-RVN和Sf9细胞以5pfu/细胞的MOI用无Sf-弹状病毒的AcP(-)p6.9hEPO原种感染。在感染后的不同时间收获样品，并且制备无细胞培养基并且通过免疫印迹分析(图9A)与扫描激光密度测定法(图9B)测定总细胞内hEPO产生水平，以估计相对免疫反应条带密度，如实施例9中描述的。
图10A-图10B：N-糖基化谱。将Sf-RVN和Sf9细胞以3pfu/细胞的MOI用无Sf-弹状病毒的AcP(-)p6.9hEPO原种感染，并且从无细胞培养基中亲和纯化hEPO-His，如实施例10中描述的。将N-聚糖酶促释放、回收、全甲基化，并且根据已知方法通过MALDI-TOF MS(图10A)进行分析，其中以[M+Na]+检测的分子离子为指定的结构，使用标准图形符号表示进行注释，为了简单起见进行编号，并且被表示为总数的百分比(图10B)。
图11：重组杆状病毒产生。将Sf-RVN和Sf9细胞用无Sf-弹状病毒的AcP(-)p6.9hSEAP或AcP(-)p6.9hEPO原种感染。收获所得后代并且通过噬斑测定进行滴定，如实施例11中描述的。以在三次独立实验中获得的平均病毒滴度绘制所得的滴度，其中误差条代表置信区间，描绘为‘*’(P<0.05)或‘**’(P<0.001)。
图12：Sf-RVN细胞的Sf-弹状病毒感染。将Sf-RVN细胞进行模拟感染(mock-infected)或用源自Sf9细胞的无细胞培养基感染，如实施例13中描述的，并且然后提取总RNA并且通过RT-PCR测定Sf-弹状病毒，如实施例4中描述的。标记的泳道：M包含碱基对标志物；Sf9包含从Sf9细胞RNA扩增的物质；模拟(Mock)包含从在细胞被“模拟感染”之后获得的Sf-RVN细胞RNA扩增的物质；P0(24)和(72)分别包含从在细胞被Sf-弹状病毒感染持续24h和72h之后获得的Sf-RVN细胞RNA扩增的物质；P1(72)、P2(72)和P3(72)分别包含从在细胞被Sf-弹状病毒感染之后被传代第一次、第二次或第三次之后72h获得的Sf-RVN细胞RNA扩增的物质；S2包含从S2R+细胞RNA扩增的物质；并且H2O包含蒸馏水。
图13A-图13B：用抗病毒药物处理的多克隆TN-368细胞中的Tn-野田村病毒。将多克隆TN-368细胞群体用不同浓度的三种抗病毒药物利巴韦林、6-氮杂尿苷、和阿糖腺苷的混合物(cocktail)处理15天。从仍然在这些药物的存在下培养的细胞提取总RNA，并且通过RT-PCR测定Tn-野田村病毒RNA区段1(图13A)或区段2(图13B)，如实施例16中描述的。从TN-368或Sf9细胞提取的总RNA分别用作阳性或阴性对照。另外的阴性对照反应在无模板(H2O)的情况下进行。标记为“M”的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图14A-图14B：在利巴韦林处理的TN-368细胞亚克隆中不存在Tn-野田村病毒。从用200μg/mL利巴韦林处理一个月的6个单细胞TN-368亚克隆中分离总RNA。然后通过RT-PCR(图14A)或RT-PCR随后是巢式PCR(图14B)测定样品的Tn-野田村病毒RNA区段1，如实施例16中描述的。从TN-368或Sf9细胞提取的总RNA分别用作阳性或阴性对照。标记为“M”的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图15A-图15C：Tn-NVN细胞中不存在Tn-野田村病毒。从在抗病毒药物不存在下培养多次传代的被称为“Tn-NVN”的示例性细胞系中分离总RNA，并且通过用对Tn-野田村病毒区段1(图15A)或区段2(图15B)特异性的引物的RT-PCR随后是巢式PCR测定Tn-野田村病毒的存在，如实施例16中描述的。被称为Tn-NVN的该示例性细胞系通过对利巴韦林处理的TN-368克隆(Cl#3)进行扩增来产生，该利巴韦林处理的TN-368克隆(Cl#3)被发现为Tn-野田村病毒污染阴性的(图15A-图15C)。Tn-野田村病毒特异性RT-PCR随后是巢式PCR的结果表明在Tn-NVN细胞的55代传代之后不存在Tn-野田村病毒(图15A和图15B)。我们还从通过超速离心来自在第55代传代的Tn-NVN细胞的CFM获得的沉淀物部分中分离总RNA并且使用其以使用Tn-野田村病毒特异性RT-PCR随后是巢式PCR测定Tn-野田村病毒，如实施例16中描述的。如图15C中示出的，在对应于从TN-368细胞中分离的RNA和从TN-368的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA的泳道中观察到Tn-野田村病毒扩增子(图15C，分别为泳道TN-368和TN-368CFM)。相比之下，在从Tn-NVN的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA中未检测到Tn-野田村病毒扩增子。同样，图15A-图15C中示出的所有结果使用来自在抗病毒药物不存在下培养的细胞的RNA获得。从TN-368细胞和从通过超速离心TN-368的无细胞培养基(CFM)获得的沉淀物提取的RNA用作阳性对照，并且从Sf9细胞提取的RNA用作阴性对照。另外的阴性对照反应在无模板(H2O)的情况下进行，并且标记为M的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图16：支原体测定。使用基于PCR的通用支原体检测试剂盒(美国典型培养物保藏中心)测定Tn-NVN和TN-368细胞提取物(-)的支原体污染，如实施例6和18中描述的。编码精氨酸支原体rRNA靶序列的质粒用作阳性对照(图16，泳道“精氨酸支原体”)。另外的对照使用掺入该质粒的Tn-NVN和TN-368细胞裂解物进行(图16，分别为泳道Tn-NVN(+)和TN-368(+))以确定裂解物是否干扰测定。阴性对照反应在无模板(H2O)的情况下进行。标记为M的泳道显示100-bp标志物，其中在左侧指示选择的尺寸。
图17A-图17C：细胞生长和形态学。将Tn-NVN和TN-368细胞以1.0×106个细胞/mL的密度接种到摇瓶中的ESF 921培养基中。在接种之后在不同时间收获一式三份的样品，并且用自动细胞计数器测量存活细胞的计数和直径，如实施例7和19中描述的。该图描绘了在三个独立实验中测量的平均存活细胞密度(图17A)和直径(图17B)，以及以10×放大率的Tn-NVN和TN-368细胞的相差显微照片(图17C)。误差条代表置信区间(P<0.05)。
图18A-图18C：重组β-gal产生。将Tn-NVN和TN-368细胞以5pfu/细胞的MOI用无Tn-野田村病毒的BacPAK6-ΔChi/Cath原种感染。在感染后的不同时间收获一式三份的样品，并且测定澄清的细胞内提取物的β-gal活性(图18A)，如实施例9和20中描述的。该图示出了平均结果，其中误差条代表置信区间(P<0.05)。还使用一组提取物以通过免疫印迹分析(图18B)与扫描激光密度测定法(图18C)测量总细胞内β-gal产生水平，以估计相对免疫反应条带密度。在该实验的两个独立的生物学重复中观察到相同的一般性趋势。
图19A-图19C：重组hSEAP产生。将Tn-NVN和TN-368细胞以5pfu/细胞的MOI用无Tn-野田村病毒的AcP(-)p6.9hSEAP原种感染。在感染后的不同时间收获一式三份的样品，制备无细胞培养基并且测定hSEAP活性，如实施例9和20中描述的，并且绘制平均结果，其中误差条代表置信区间(P<0.05；图19A)。还使用一组无细胞培养基以通过免疫印迹分析(图19B)与扫描激光密度测定法(图19C)测量总细胞内hSEAP产生水平以估计相对免疫反应条带密度。
图20A-图20B：重组hEPO产生。将Tn-NVN和TN-368细胞以5pfu/细胞的MOI用无Tn-野田村病毒的AcP(-)p6.9hEPO原种感染。在感染后的不同时间收获样品，并且制备无细胞培养基，并且通过免疫印迹分析(图20A)与扫描激光密度测定法(图20B)测定总细胞内hEPO产生水平，用于估计相对免疫反应条带密度，如实施例9和20中描述的。
图21A-图21B：N-糖基化谱。将Tn-NVN和TN-368细胞以3pfu/细胞的MOI用无Tn-野田村病毒的AcP(-)p6.9hEPO原种感染，并且从无细胞培养基中亲和纯化hEPO-His，如实施例10和21中描述的。将N-聚糖酶促释放、回收、全甲基化，并且根据已知方法通过MALDI-TOFMS(图21A)进行分析，并且以[M+Na]+检测的分子离子为指定的结构，使用标准图形符号表示进行注释，为了简单起见进行编号，并且被表示为总数的百分比(图21B)。
图22：在BmN细胞中的Sf-弹状病毒。从源自鳞翅目昆虫家蚕的BmN细胞系提取总RNA，如实施例4中描述的。然后通过RT-PCR测定样品中的多种Sf-弹状病毒RNA(N、P、M、G、X、和L)，如实施例22中描述的。
某些示例性实施方案的详细描述
应当理解，上文的一般描述和下文的详细描述两者仅是说明性的和示例性的，并且不意图限制所公开的教导的范围。本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所公开的教导的主题。
在以上的概述、详细描述、附图和下文权利要求中，提及本发明的教导的特定特征(包括方法步骤)。应当理解，本说明书中的公开内容包括此类特定特征的可能组合。例如但不限于，在特定特征在本发明的教导的特定实施方案或特定权利要求的背景中公开的情况下，该特征在可能的程度上也可以与其他特定实施方案组合使用和/或在其他特定实施方案的背景中使用以及在本发明的教导中一般性地使用。
当提及包括两个或更多个组合步骤的方法时，定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除该可能性)，并且该方法可以包括在定义的步骤中的任一个之前、在定义的步骤中的两个之间，或者在所有定义的步骤之后(除非上下文排除该可能性)进行的一个或更多个另外的步骤。
定义
提及本发明的教导使用的术语“细胞系”意指从一个或几个共同祖先细胞扩增的细胞群体，例如但不限于从单个分离的细胞扩增的细胞克隆群体。“建立的细胞系”是一种当给予新鲜培养基、生长空间时并且当在合适条件下孵育时具有无限期增殖潜力的细胞系。与生物体中发现的天然存在的对应物(counterpart)细胞相比，此类细胞系在体外已经经历了变化(例如但不限于转化、染色体变化或两者)。通过从第一细胞系中分离单细胞、然后扩增所分离的细胞以获得多个细胞以获得第二细胞系而获得的细胞系有时被称为它源自的第一细胞系的“亚克隆”。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”，其与“包括(including)”或“特征在于(characterized by)”同义，以及各自的同源词(诸如包含(comprises)和包括(includes))，是包括性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的组分、要素或方法步骤，即其他组分、步骤等任选地存在。例如但不限于，“包含”组分A、B和C的物品(article)可以由组分A、B和C组成(即，仅包含)；或者物品不仅可以包含组分A、B和C，还可以包含一种或更多种另外的组分。
如本文使用的，术语“源自(derived)”意指直接地或间接地从来源获得。例如，通过从生物体获得组织或器官，然后使该组织或器官解聚以获得原代细胞，细胞可以直接地源自生物体。通过例如但不限于，获得分离株(isolate)(通常来自从生物体获得的细胞系的单细胞分离株)，然后扩增分离株以获得包含多个细胞的细胞系(有时被称为亚克隆)，细胞可以从生物体间接地获得。
术语“鳞翅目昆虫”指包括蝴蝶、蛾和弄蝶(skippers)的大的昆虫目(鳞翅目)的任何成员，其作为成虫具有四个宽或披针形的翅，通常覆盖有微小的重叠并且通常具有鲜艳的翅鳞，并且作为幼虫为毛虫。示例性的鳞翅目昆虫包括但不限于，草地贪夜蛾、家蚕、Heliothis subflexa、和粉纹夜蛾。
如本文使用的，术语“实质上”指相对于所指定的一个项目或更多个项目的不多于正或负百分之十的变化。例如但不限于，当细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖并且平均细胞直径如本文描述来确定时，基于统计学显著样品尺寸，细胞系具有在Sf9细胞的平均直径的90％与110％之间的平均细胞直径；或者，当细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖并且细胞密度如本文描述来确定时，基于统计学显著样品尺寸，细胞系具有在Sf9细胞的细胞密度的90％与110％之间的细胞密度。
术语“测试病毒的存在”、“测试Sf-弹状病毒的存在”、“测试Tn-野田村病毒的存在”、“检测病毒的存在或不存在”以及相关术语在本文被广义地使用。本领域技术人员理解，存在本领域已知的可以用于本发明的教导的背景中的许多测试技术。适于测试病毒的存在的示例性技术包括，逆转录(RT)、RT-聚合酶链式反应(RT-PCR)、与巢式PCR联合的RT-PCR(例如但不限于实施例4、16和22中公开的示例性技术)、定量PCR(有时被称为实时PCR)、多种探针杂交技术、电子显微术以及本领域已知的多种基于抗体的检测技术，例如但不限于包括至少一种抗病毒抗体的ELISA测定。在病毒在细胞中为裂解性的或引起可观察的致细胞病变效应(CPE)的情况下，示例性的测试技术包括但不限于噬斑测定和CPE观察，其可包括使用显微术。生物信息学技术，例如但不限于BLAST检索包含在感兴趣的细胞系或生物体中的RNA或DNA序列的电子数据库，也在本发明的教导的范围内。
根据某些实施方案，特征在于缺乏病毒的建立的细胞系源自感染病毒的生物体，所述建立的细胞系例如但不限于源自病毒污染的生物体的无病毒的建立的细胞系。在某些实施方案中，细胞系源自被病毒污染的昆虫。在某些实施方案中，昆虫包括鳞翅目昆虫，例如但不限于，草地贪夜蛾(Sf)、家蚕、Heliothis subflexa、或粉纹夜蛾。在某些实施方案中，细胞系源自Sf细胞系，例如但不限于，Sf9或Sf-21细胞系。在某些实施方案中，细胞系源自被病毒污染的粉纹夜蛾或病毒污染的粉纹夜蛾细胞系，例如但不限于，被α野田村病毒污染的TN-368细胞系。
在某些实施方案中，建立的细胞系的特征在于当：(1)无病毒的细胞系和病毒感染的细胞系在相同条件下繁殖，(2)如本文描述的进行比较，以及(3)该比较是基于统计学显著的样品尺寸时，与该细胞系源自其的病毒污染的细胞具有相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。在某些实施方案中，细胞系的特征在于当各自在相同条件下用AcP(-)p6.9hEPO或AcP(-)p6.9hSEAP感染并且比较根据实施例11来进行时，产生比所述细胞系源自其的病毒感染的细胞更多的感染性重组杆状病毒。在某些实施方案中，本发明的教导的细胞系易受Sf-弹状病毒感染影响。
根据用于获得缺乏病毒的细胞系的某些示例性方法，从感染病毒的细胞群体，诸如被病毒污染的细胞系或来自解聚的组织或器官或来自感染病毒的生物体的细胞中分离一个或几个细胞。将分离的细胞(cell or cells)与包含一种或更多种抗病毒化合物的适当的细胞培养基组合，以形成第一培养物组合物。将该第一培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育；并且持续足够的时间段以允许一种或更多种抗病毒化合物影响病毒复制。在某些方法实施方案中，从培养物中取出等份试样的细胞或培养基并且测试病毒的存在。将缺乏病毒的细胞与不含抗病毒化合物的培养基组合以形成第二培养物组合物。将该第二培养物组合物在允许细胞生长和分裂的条件下孵育。将细胞扩增以获得缺乏污染细胞系从其获得的生物体或细胞的病毒的细胞系。
在某些实施方案中，用于获得无病毒细胞系的方法包括：从鳞翅目昆虫细胞(例如但不限于草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞)群体中分离单细胞；将分离的细胞与包含至少一种抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第一培养物组合物；将第一培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而产生多个细胞；任选地，取出细胞或细胞培养基的一部分并且测试Sf-弹状病毒或野田村病毒的存在；将来自第一培养物组合物的多个细胞中的至少一些与不具有抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第二培养物组合物；并且将第二培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而获得特征在于缺乏病毒的细胞系。
根据某些方法实施方案，获得了缺乏病毒例如但不限于Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒的建立的细胞系。在某些方法实施方案中，从感染病毒的细胞群体分离个体细胞或小的细胞组，例如但不限于，2个细胞、3个细胞、4个细胞、5个细胞、10个细胞或更少细胞或者20个细胞或更少细胞(包括在1与20之间的每个整数)的组。用于分离单细胞或少量细胞的技术的非限制性实例包括有限稀释克隆(有时被称为通过连续稀释的克隆)、在软琼脂中克隆细胞并且随后挑取细胞集落、细胞分选以分离单细胞或少量细胞、激光捕获显微切割(LCM)、使用微量移液管(例如但不限于超薄毛细管)手动捕获个体细胞或少量细胞、微流体或使用显微操作器通过显微镜辅助选择单细胞或少量细胞。在某些实施方案中，分离单细胞包括有限稀释克隆。
在某些方法实施方案中，将分离的单细胞或小的细胞组与包含至少一种抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第一培养物组合物。示例性的抗病毒化合物包括但不限于，药物诸如核苷类似物，干扰素和病毒特异性抗体，例如但不限于中和单克隆或多克隆抗体。核苷类似物的非限制性实例包括，利巴韦林、6-氮杂尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、9-/3-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A)、胞嘧啶阿拉伯糖(cytosine arabinose)、腺嘌呤阿拉伯糖苷和鸟嘌呤7-N-氧化物(G-7-Ox)。在某些方法实施方案中，至少一种抗病毒化合物包括6-氮杂尿苷。在某些实施方案中，抗病毒化合物选自利巴韦林、6-氮杂尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、9-/3-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A)、胞嘧啶阿拉伯糖、腺嘌呤阿拉伯糖苷和鸟嘌呤7-N-氧化物(G-7-Ox)。在某些实施方案中，抗病毒化合物为6-氮杂尿苷。在某些实施方案中，抗病毒化合物包括利巴韦林。
根据某些方法实施方案，将第一培养物组合物在适于细胞生长的条件下孵育。根据某些公开的方法，测试从第一培养物组合物获得的细胞或细胞培养物上清液中病毒的存在或不存在，其通过例如但不限于RT-PCR、巢式PCR或RT-PCR和巢式PCR，随后分析所得扩增子中病毒特异性扩增产物的存在或不存在。在某些方法实施方案中，感染性病毒的存在或不存在通过以下来确定：(1)将(a)潜在感染的细胞或潜在感染的细胞在其中被孵育的细胞培养物上清液与(b)疑似被潜在病毒(c)感染的细胞组合在合适的细胞培养基中；(2)将该培养物在适于病毒感染细胞的条件下孵育；以及(3)监测培养的细胞或培养的细胞已经在其中被培养的培养基中病毒核酸的存在。在某些实施方案中，定期地测试细胞或培养基中病毒的存在，其例如但不限于通过使用病毒特异性RT-PCR随后是巢式PCR，然后确定特异性扩增子的存在或不存在。
根据某些实施方案，在将分离的细胞已经在第一培养物组合物中孵育合适的时间段以抑制病毒复制并且已经测试了对应细胞或培养基样品并且发现其不包含病毒之后，将细胞与不包含抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第二培养物组合物。将第二培养物组合物在合适的细胞生长条件下孵育。在某些实施方案中，测试来自第二培养物组合物的细胞或培养基中病毒的存在或不存在。
本领域的技术人员将理解，适于生长特定细胞类型的条件可从多种来源容易地确定，所述来源例如但不限于细胞培养手册、商业细胞库或培养基和/或塑料制品的供应商。使用本领域已知的方法也可以容易地确定适当的细胞培养条件。
在某些实施方案中，细胞系源自被病毒例如但不限于Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒污染的原代细胞。在某些实施方案中，细胞系源自被病毒包括但不限于Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒感染的细胞系。在某些实施方案中，感染的细胞的群体为感染的细胞系的一部分。在某些实施方案中，感染的细胞系从感染的生物体，例如但不限于蛾、毛虫或被病毒持续感染的其他昆虫获得。在某些实施方案中，细胞系源自污染的细胞系(所述污染的细胞系源自感染病毒的昆虫)，例如但不限于感染Sf-弹状病毒的Sf细胞系。在某些实施方案中，细胞系为被Tn-野田村病毒污染的粉纹夜蛾细胞系，例如但不限于TN-368、BTI-Tn-5B1-4(也被称为HIGH FIVETM)、或Tni PRO细胞。
根据某些公开的方法，测试细胞或细胞在其中生长的细胞培养基中病毒的存在或不存在。在某些方法中，测试包括RT-PCR和巢式PCR；定量PCR；探针杂交技术；生物信息学方法，包括但不限于BLAST检索；噬斑测定，CPE观察或基于抗体的检测方法。
某些示例性实施方案
实施例1.昆虫细胞培养。将已知被Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞在ESF 921培养基(Expression Systems,Woodland,CA)中在28℃作为摇瓶培养物被常规维持。将已知被Tn-野田村病毒污染的TN-368细胞在补充有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals,Inc.,Flowery Branch,GA)和1％pluronic F-68(Invitrogen,Carlsbad,CA)的TN-MFH培养基中在28℃作为贴壁培养物被常规维持。
实施例2.常规方法未能产生缺乏病毒的建立的草地贪夜蛾(S.frugiperda)细胞系。我们最初分离无Sf-弹状病毒的衍生物的努力包括将多克隆Sf9细胞群体在补充有10％(v/v)胎牛血清(Atlanta Biologicals,Inc.,Flowery Branch,GA)加不同浓度的利巴韦林(Oxchem Corporation,Irwindale,CA)的TNM-FH培养基中培养。随后，我们用不同浓度的三种抗病毒药物利巴韦林、6-氮杂尿苷(Alfa Aesar,Ward Hill,MA)和阿糖腺苷(TCIAmerica,Portland,OR)处理多克隆Sf9细胞群体。将Sf9细胞与这三种药物一起培养约一个月，特别地(ad hoc)进行连续传代，并且通过RT-PCR常规测试样品的Sf-弹状病毒污染，如实施例4中描述。在用100μg/mL利巴韦林处理约一个月之后，我们获得了不包含RT-PCR可检测的Sf-弹状病毒的Sf9亚克隆(图1A)。将该无Sf-弹状病毒的亚克隆转移至补充有10％(v/v)胎牛血清但无抗病毒药物的TNM-FH培养基中并且通过RT-PCR/巢式PCR再测试，如实施例4中描述的。出乎我们意料的是，当这些细胞被转移至缺乏抗病毒药物的培养基时，它们恢复为Sf-弹状病毒阳性表型(图1B)。我们随后用不同浓度的三种抗病毒药物利巴韦林、6-氮杂尿苷、和阿糖腺苷的组合处理多克隆Sf9细胞群体。同样，我们出乎意料地发现用这三种药物处理约一个月的细胞仍然是Sf-弹状病毒阳性的(图1C)。因此，与其中脊椎动物细胞通过用这些相同的抗病毒药物处理而消除弹状病毒污染的先前的工作形成鲜明对比，该方法未能从Sf9细胞中消除Sf-弹状病毒。
实施例3.用于获得特征在于缺乏病毒的建立的Sf细胞系的示例性方法。在发现用抗病毒药物处理的多克隆Sf9细胞培养物当在无药物培养基中生长时恢复为Sf-弹状病毒阳性表型之后，我们开发了用于获得源自病毒污染的起始物质的建立的无病毒细胞系的新型方法。该示例性实施方案包括通过有限稀释分离单个Sf9细胞，然后用抗病毒药物处理所分离的细胞亚克隆。将细胞接种到96孔板中的补充有10％(v/v)胎牛血清(AtlantaBiologicals,Inc.,Flowery Branch,GA)加10μg/mL利巴韦林(Oxchem Corporation,Irwindale,CA)、6-氮杂尿苷(Alfa Aesar,Ward Hill,MA)、或阿糖腺苷(TCI America,Portland,OR)的TNM-FH培养基中。将细胞培养约一个月，特别地进行扩增以逐渐产生更大的培养物，并且在达到25cm2烧瓶水平之后，通过PCR测试样品的Sf-弹状病毒污染，如实施例4中描述的。将缺乏Sf-弹状病毒污染的克隆(图2B)转移至缺乏抗病毒药物的培养基中，被命名为Sf-RVN传代第零代(P0)，并且在P2，转移至摇瓶培养物的无血清ESF 921培养基中，并且随后维持在这种培养基和培养形式中。
实施例4.Sf-弹状病毒特异性逆转录-PCR(RT-PCR)/巢式PCR。收获包含1×106个细胞的Sf9和Sf-RVN培养物的样品，并且通过低速离心使细胞沉淀。将无细胞上清液通过0.22μm过滤器(CELLTREAT Scientific,Shirley,MA)过滤，并且然后在4℃以131,000×g超速离心22h。根据制造商的方案，使用RNASolv试剂(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)从低速细胞沉淀物和高速无细胞沉淀物提取总RNA。然后将RNA定量，并且用作用于根据制造商的方案用ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA)和被命名为320-SP1的Sf-弹状病毒特异性引物(SEQ ID NO:9)进行cDNA合成的模板。将等量的各cDNA制备物与Taq DNA聚合酶、ThermoPol反应缓冲液(New England Biolabs)和Sf-弹状病毒特异性引物Mono-1(SEQ ID NO:1)和Mono-2(SEQ ID NO:2)一起用于PCR。将反应混合物在94℃孵育3min，在94℃持续30s、55℃持续1min和72℃持续1min循环35次，并且最后在72℃孵育10min。然后将1μL各初始PCR(RT-PCR)物用作用于在相同条件下的第二PCR(RT-PCR/巢式PCR)的模板，不同之处在于引物为巢式Sf-弹状病毒特异性引物Mono-1i(SEQID NO:7)和Mono-2i(SEQ ID NO:8)。根据标准方法，通过琼脂糖凝胶电泳与溴化乙锭染色分析RT-PCR的产物以及RT-PCR随后是巢式PCR的产物。用于这些测定的各引物的序列示于表1中。
Figure BDA0003892913750000191
1由用奇数/偶数引物对(例如，Mono-1和Mono-2；或320-SP1和320-ASP1)的PCR产生的扩增产物的尺寸。
实施例5.示例性Sf亚克隆“Sf-RVN”缺乏Sf-弹状病毒。从在不同传代水平的Sf-RVN细胞提取物中分离总RNA，并且使用RT-PCR/巢式PCR测试Sf-弹状病毒的存在，如实施例4中描述的。如预期的，当来自Sf9细胞的总RNA用作该测定的阳性对照时，观察到预期尺寸的强扩增产物(图3A、图3B和图3C)。相比之下，当我们使用从在我们实验室在任何抗病毒药物不存在下的60代(图3A)或120代(图3B)连续传代的过程期间每传代5次的Sf-RVN细胞中分离的总RNA时，未观察到产物。我们在具有从黑腹果蝇S2R+细胞(其不支持Sf-弹状病毒复制)分离的总RNA的阴性对照中也未观察到扩增产物。当我们使用两种其他Sf-弹状病毒特异性引物对(Mono-3(SEQ ID NO:3)/Mono-4(SEQ ID NO:4)和Mono-5(SEQ ID NO:5)/Mono-6(SEQ ID NO:6)；参见表1)(其源自Sf-弹状病毒的L-蛋白编码序列的其他区域，用于从Sf9细胞但不是从Sf-RVN细胞中分离的总RNA的RT-PCR)时，我们观察到预期尺寸的强扩增产物(数据未示出)。最后，当在60代传代之后测试时，我们在用从通过超速离心Sf9的无细胞培养基而不是Sf-RVN的无细胞培养基获得的沉淀物中分离的总RNA的RT-PCR/巢式PCR测定中观察到了预期尺寸的强扩增产物(图3C)。总之，这些结果表明，在任何抗病毒药物不存在下的120代传代过程中，在Sf-RVN细胞或无细胞培养基中不存在可检测的Sf-弹状病毒RNA，这表明这些细胞是无Sf-弹状病毒的。
实施例6.支原体检测。根据制造商的方案，我们还使用来自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)的通用支原体检测试剂盒测试包含约105个Sf-RVN或Sf9细胞的样品的支原体。这种基于PCR的测定使用与在超过60种不同支原体、无胆甾原体(acholeplasma)、螺原体(spiroplasma)和脲原体(ureaplasma)物种(包括作为细胞培养物污染物被频繁发现的8种物种)的16S rRNA基因中保守的序列互补的引物。图4中示出的结果表明，Sf9与Sf-RVN细胞均未被检测到支原体污染。PCR产物的不存在不是由于昆虫细胞裂解物对PCR反应的抑制，因为在使用掺入对照模板的裂解物进行的PCR中观察到预期尺寸的扩增子(图4)。
实施例7.细胞生长特性、形态学和直径。将Sf-RVN或Sf9细胞以1.0×106个细胞/mL的起始密度接种于50mL摇瓶培养物中，每24h取出一式三份的样品，持续4天，并且使用
Figure BDA0003892913750000201
自动细胞计数器(ThermoFisher Scientific,Inc.)测量存活细胞密度和尺寸。使用以下公式计算倍增时间：Td＝T×Log2/Log(Q2/Q1)，其中Td＝倍增时间，T＝自上次传代以来经过的时间(h)，Q1＝细胞接种密度，并且Q2＝存活细胞计数。通过使用OlympusFSX-100显微镜和FSX-BSW成像软件(Olympus Life Sciences Solutions,Center Valley,Pennsylvania)以10×的放大率收集相差图像来记录细胞形态学。
为了比较Sf-RVN细胞与Sf9细胞的一些一般特性，我们评价了它们的培养物密度、直径、倍增时间、形态学和响应于杆状病毒感染的存活力。结果显示Sf-RVN和Sf9细胞在接种到平行的摇瓶培养物中的ESF-921培养基中之后四天过程中实现了几乎相同的平均密度(图5A)。这个时间范围涵盖了常规昆虫细胞系维持期间通常允许的在连续传代之间的2-3天的生长。结果还揭示在这些细胞培养实验过程期间在Sf-RVN和Sf9细胞的平均直径(图5B)、倍增时间(图5C)、或形态学(图5D)方面无显著差异。最后，我们发现在Sf-RVN和Sf9细胞响应于杆状病毒感染的存活力方面无显著差异，这在以0.1(图6A)或5(图6B)pfu/细胞的复数感染之后4天内是不可区分的。在该实验中使用的时间范围和两种不同的MOI分别涵盖通常用于以低或高MOI产生杆状病毒工作原种或重组蛋白的条件。总之，这些实验的结果表明，该研究中检查的Sf-RVN和Sf9细胞的一般特性是不可区分的。
实施例8.杆状病毒表达载体。以两个连续步骤产生编码全长、未加标签的大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(β-gal)的被命名为BacPAK6-ΔChi/Cath的杆状病毒表达载体。在第一个步骤中，将BacPAK6病毒DNA与在杆状病毒p6.9启动子控制下编码大肠杆菌β-葡糖醛酸酶的质粒重组。在该质粒中，将p6.9-β-葡糖醛酸酶基因插入代替AcMNPV chiA和v-cath基因并且嵌入野生型AcMNPV侧翼序列内。期望的重组体通过其在X-GlcA(RPI Corp.,Mount Prospect,IL)的存在下的蓝色噬斑表型试验性地鉴定。重组位点用分别在转移质粒内部和外部的β-葡糖醛酸酶基因和AcMNPV gp64基因的5'UTR特异性的引物通过PCR来证实。扩增该病毒，并且分离病毒DNA并且用I-SceI消化以缺失完整的β-葡糖醛酸酶表达盒。在第二个步骤中，将Sf9细胞用I-SceI消化的病毒DNA转染。将所得后代在X-GlcA存在下通过噬斑测定来鉴别，并且最终的重组杆状病毒BacPAK6-ΔChi/Cath通过其白色噬斑表型来鉴定。
被命名为AcP(-)p6.9hSEAP和AcP(-)p6.9hEPO的重组杆状病毒表达载体在AcMNPVp6.9启动子和蜜蜂蜂毒前溶血肽原(prepromellitin)信号肽控制下分别编码8X HIS-加标签形式的人类分泌型碱性磷酸酶(hSEAP)和人类红细胞生成素(hEPO)。编码成熟SEAP和EPO(分别为Genbank NP_001623.3氨基酸23-511和Genbank NP_000790.2氨基酸28-193)与N-末端TEV蛋白酶裂解位点(ENLYFQG)的合成基因使用OPTIMIZER(Puigbo等，2007)来设计以匹配AcMNPV密码子使用(http://www.kazusa.or.jp)。将这些序列进行合成、克隆并且通过Genscript(Piscataway,N.J.)测序，并且使用无错误的克隆以通过与Ac6.9GT体外重组产生重组杆状病毒表达载体，如先前描述的(Toth等，2011)。
使用标准方法对Sf9细胞中的重组杆状病毒表达载体进行噬斑纯化、扩增和滴定。另外，产生了无Sf-弹状病毒和Tn-野田村病毒的原种用于该研究。首先，将Sf9细胞用每种杆状病毒载体的工作原种感染，并且然后使用标准方法分离杆状病毒DNA。该方法包括蛋白酶K、SDS和RNA酶A处理，随后是苯酚/氯仿/异戊醇提取和用异丙醇沉淀DNA，这预期消除Sf-弹状病毒和Tn-野田村病毒。然后使用所得杆状病毒DNA制备物转染Sf-RVN细胞，并且将后代进行噬斑纯化、扩增和滴定，不同之处在于使用Sf-RVN而不是Sf9细胞作为噬斑纯化和扩增的宿主。在该过程期间，我们使用实施例4中描述的RT-PCR/巢式PCR测定测试了杆状病毒DNA转染的Sf-RVN细胞提取物和杆状病毒感染的Sf-RVN细胞提取物以及通过超速离心最终的工作病毒原种的样品获得的沉淀物的Sf-弹状病毒和Tn-野田村病毒的存在或不存在。未检测到Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒序列。
实施例9.重组蛋白表达。将ESF 921培养基中的Sf-RVN或Sf9细胞以1×106个细胞/孔的密度接种到六孔板中。然后将细胞用ESF 921培养基模拟感染或者以0.1或5噬斑-形成单位(pfu)/细胞的感染复数(MOI)用无Sf-弹状杆菌病毒的BacPAK6-ΔChi/Cath、AcP(-)p6.9hSEAP或AcP(-)p6.9hEPO的原种感染。在感染后的不同时间，收获感染的细胞，测量细胞密度，并且通过低速离心使细胞沉淀。然后取决于被表达的模式蛋白(model protein)的性质和实验目的，将细胞和无细胞培养基以多种方式处理，如下文描述的。然而，在每种情况下，细胞提取物和/或无细胞培养基中的重组蛋白的水平通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；(Laemmli,1970))和免疫印迹(Towbin等，1979)用蛋白-或标签-特异性第一抗体和碱性磷酸酶缀合的第二抗体来测量，如下文指明的。免疫反应性蛋白使用标准的基于碱性磷酸酶的显色反应可视化，并且相对强度通过使用Image J软件1.48版(美国国立卫生研究院)对条带进行扫描和定量来估计。
对于β-gal，使用已知方法，使用感染的细胞沉淀物来制备细胞质提取物，以用于酶活性测定。使用兔抗β-gal(EMD Millipore Corporation,Germany)和碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)分别作为第一探针和第二探针进行免疫印迹。
对于hSEAP，制备无感染的细胞的培养基用于酶活性测定，并且使用小鼠抗-penta-His(ThermoFisher)和碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich)分别作为第一探针和第二探针进行免疫印迹。
对于hEPO，制备无感染的细胞的培养基，用于用兔抗-hEPO(U-CyTech,Utrecht,The Netherlands)和碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich)分别作为第一探针和第二探针进行免疫印迹。
我们使用大肠杆菌β-gal，一种模式细菌细胞内蛋白；hSEAP，一种模式人类分泌型糖蛋白；和hEPO，一种具有生物技术意义的模式人类分泌型糖蛋白比较了由Sf-RVN和Sf9细胞支持的杆状病毒介导的重组蛋白产生的水平。重要的是要强调制备每种重组杆状病毒的无Sf-弹状病毒的工作原种并用于这些研究，如以上描述的。
大肠杆菌β-gal表达实验显示，在用重组杆状病毒感染的4天期间，在由Sf-RVN和Sf9细胞产生的细胞内酶活性水平方面不存在显著差异(图7A)。图7B中示出的代表性免疫印迹结果指示Sf-RVN产生略微更多的总细胞内β-gal蛋白。其中我们用考马斯亮蓝对凝胶染色的独立生物学重复产生了相同的结果，而如同图7A-图7C中示出的结果，由Sf-RVN细胞产生的细胞内β-gal水平的增加较小(数据未示出)。最后，我们注意到与较早时间点相比，由Sf-RVN和Sf9细胞产生的酶活性和免疫反应性细胞内β-gal两者的水平在感染后4天时均较低，这可能反映了在该感染的甚晚期(at this very late time of infection)的杆状病毒诱导的细胞毒性。
我们在感染的4天期间对hSEAP产生和分泌的分析产生了基本上相同的结果。在这种情况下，我们扩大了实验以包括低(0.1pfu/细胞；图8A、图8B和图8C)和高(5pfu/细胞；图8D、图8E和图8F)MOI感染两者，因为一些研究人员已经报道了在BICS中以低而不是传统的高MOI感染的更高生产率。这些实验的结果显示，在由以低(图8A)或高(图8D)MOI感染的Sf-RVN和Sf9细胞产生的hSEAP活性水平方面不存在统计学显著差异。代表性免疫印迹结果表明，当以低(图8B和图8C)MOI感染时Sf9产生略微更多的hSEAP，并且当以高(图8E和8F)MOI感染时，Sf-RVN产生略微更多的hSEAP。然而，这些仅是微小的差异，这在该实验的独立生物学重复中不可完全再现(数据未示出)。当以高MOI感染时，在感染后1天Sf-RVN和Sf9细胞两者产生更多hSEAP活性和免疫反应性细胞外蛋白，并且在感染后4天产生约3倍更多的hSEAP活性。我们还注意到，在以任一MOI感染的4天期间，在Sf-RVN和Sf9细胞的存活力方面不存在差异，如图6A-图6B中示出的，其源自作为本文描述的hSEAP表达和分泌实验一部分获得的数据。
最后，当我们比较通过Sf-RVN和Sf9细胞的hEPO产生和分泌的水平时，我们获得相同的一般性结果。由于不存在该产物的简单的功能测定，我们的分析限于比较在4天感染期间由两种不同细胞类型分泌到细胞外培养基中的免疫反应性hEPO的水平。该实验的两个独立生物学重复的结果揭示，在由Sf-RVN和Sf9细胞产生的分泌型hEPO水平方面无主要的可再现的差异(图9A和图9B)。
总之，这些结果表明Sf-RVN和Sf9细胞以几乎相同的水平产生和分泌三种不同的重组蛋白。
实施例10.N-聚糖分析。将Sf-RVN和Sf9细胞的50mL摇瓶培养物用无Sf-弹状病毒的AcP(-)p6.9hEPO原种感染，并且使用Ni-NTA树脂(ThermoFisher)从无细胞和病毒的上清液中对hEPO进行亲和纯化。通过用PNGase-F(New England Biolabs)消化从纯化的hEPO制备物中酶促释放N-聚糖，并且根据已知方法将释放的N-聚糖进行纯化、衍生化并且通过MALDI-TOF-MS分析。基于对Sf细胞中产生的N-聚糖的预测的质量和知识，指定峰的结构，使用标准图形符号表示进行注释并且为了简单起见进行编号。不同结构的相对定量通过将来自个体全甲基化N-聚糖结构的同位素群的组合峰强度除以所有注释的N-聚糖峰的总强度来完成。
在比较Sf-RVN和Sf9细胞时评价的另一个重要因素为它们的蛋白N-糖基化模式，因为由不同细胞系提供的模式可以显著不同。因此，我们用AcP(-)p6.9hEPO感染Sf9和Sf-RVN细胞，从无细胞培养基中纯化分泌型hEPO，酶促释放总N-聚糖，并且通过MALDI-TOF MS分析全甲基化产物。如期望的，结果显示与由两种细胞系产生的hEPO连接的绝大多数N-聚糖具有三甘露糖基(trimannosyl)核心结构(图10A中的结构2和3)。如期望的，我们还观察到小比例的具有末端N-乙酰葡糖胺残基的杂合型结构(图10A中的结构4和5)。通过定量这些不同的结构，我们确定了由Sf-RVN和Sf9细胞提供的hEPO N-糖基化谱几乎相同，尽管Sf-RVN细胞产物具有略微更多的岩藻糖基化N-聚糖(图10B)。
实施例11.Sf-RVN细胞产生更多感染性杆状病毒后代。除了它们作为宿主用于重组蛋白生产的效用以外，Sf9细胞被广泛认为名列产生杆状病毒原种的最佳宿主之中。因此，比较由Sf9和Sf-RVN细胞产生的感染性重组杆状病毒载体后代的量是有意义的。该实验包括用两种不同的无Sf弹状病毒的杆状病毒原种AcP(-)p6.9hEPO和AcP(-)p6.9hSEAP感染两种细胞类型，从所有四种感染物收获芽殖病毒(budded viral)后代，即包含感染性重组杆状病毒的细胞培养基，并且比较噬斑测定中的感染性病毒滴度，如实施例8中描述的。三个独立生物学重复的结果显示，与由Sf9细胞产生的两种杆状病毒工作原种AcP(-)p6.9hEPO和AcP(-)p6.9hSEAP相比，当由Sf-RVN产生时，两种杆状病毒的工作原种AcP(-)p6.9hEPO和AcP(-)p6.9hSEAP具有约5-10倍更高的滴度(图11)。
实施例12.BLAST检索。使用可公开访问的NCBI BLASTN接口(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)进行Sf细胞基因组和转录物组的生物信息学检索。将Sf-21细胞系转录的序列集合(assembly)(Genbank登录号GCTM00000000.1,BioProjectID 271593(Kakumani等,Biol.Direct 10,1-7,2015)和草地贪夜蛾毛虫头部转录的序列集合(Genbank登录号GESP00000000.1,BioProjectID 318819(Cinel等.))使用megablast(缺省设置)以公布的Sf-弹状病毒基因组(Genbank登录号NC_025382.1)来查询。
使用公布的Sf-弹状病毒基因组(Genbank登录号NC_025382.1)对IPLB-SF-21细胞系转录的序列集合(Genbank登录号GCTM00000000.1,BioProjectID 271593(Kakumani等,Biol.Direct 10,1-7,2015)进行查询，从megaBLAST检索获得的结果示于表2中。
表2
最大评分 总评分 查询覆盖率 E值 同一性 登录号
12521 24213 97％ 0.0 99％ GCTM01002581.1
这些结果指示Sf-21细胞系转录物组包括完整的组装的Sf-弹状病毒基因组。由于先前显示Sf-21细胞系被Sf-弹状病毒持续感染，该结果被预期到。
使用公布的Sf-弹状病毒基因组(Genbank登录号NC_025382.1)对从国家生物技术信息中心BioProject PRJNA318819(Cinel等)获得的雄性羽化后草地贪夜蛾成虫(秋粘虫)的集合的全脑基因表达谱进行查询，从megaBLAST检索获得的结果示于表3中。
表3
最大评分 总评分 查询覆盖率 E值 ％同一性 登录号
17941 17941 76％ 0.0 98％ GESP01110283.1
17930 17930 76％ 0.0 98％ GESP01110282.1
10471 10471 44％ 0.0 98％ GESP01110281.1
5208 5208 22％ 0.0 98％ GESP01028237.1
965 965 4％ 0.0 98％ GESP01002842.1
905 905 3％ 0.0 98％ GESP01008203.1
734 734 3％ 0.0 97％ GESP01008495.1
667 667 2％ 0.0 99％ GESP01141621.1
608 608 2％ 1e-171 98％ GESP01110280.1
586 586 2％ 5e-165 98％ GESP01135659.1
551 551 2％ 2e-154 98％ GESP01137160.1
549 549 2％ 7e-154 98％ GESP01139133.1
521 521 2％ 2e-145 94％ GESP01110279.1
出乎我们意料的是，在这些生物体的转录物组中检测到几个集合的序列，所述几个集合的序列总体地包含完整的Sf-弹状病毒基因组。这些数据显示所有Sf细胞系源自的毛虫(草地贪夜蛾)本身感染了Sf-弹状病毒。因此，源自草地贪夜蛾的所有细胞系均被Sf-弹状病毒污染的原因是在第一个Sf细胞系被分离之前生物体被环境中的该病毒天然地感染，而不是因为细胞系在实验室中被病毒污染。
形成鲜明对比的是，用Sf-弹状病毒序列对Sf-RVN转录物组进行查询的BLAST检索未产生击中，进一步证实了我们的发现，即Sf-RVN细胞未被Sf-弹状病毒污染。BLAST检索结果总结于表4中。由于由我们实验室和其他实验室先前测试的所有Sf细胞系均显示Sf-弹状病毒污染阳性的，Sf-弹状病毒序列在Sf-RVN细胞系的转录物组中的不存在清楚地表明这些细胞在结构上(遗传上)不同于任何其他Sf细胞系和草地贪夜蛾(所有先前描述的Sf细胞系源自的天然存在的生物体)。Sf-RVN细胞易受Sf-弹状病毒感染的影响的事实证实了这种结构差异。
表4.Sf-弹状病毒的BLAST检索结果
测试样品 映射至Sf-弹状病毒的读段 读段总数 ％Sf-弹状病毒
Sf脑a 380×103 480×106 0.63
Sf-21细胞b 259×103 230×106 0.11
Sf-RVN细胞 0 453×106 0
a NCBI BioProjectID 318819；b Kakumani等
实施例13.Sf-RVN细胞系易受Sf-弹状病毒感染的影响。将Sf9细胞以1.0×106个细胞/mL的起始密度接种于50mL摇瓶培养物中的补充有10％(v/v)胎牛血清(AtlantaBiologicals,Inc.,Flowery Branch,GA)的TNM-FH培养基中。将细胞在振荡培养箱中在28℃孵育3天。在孵育之后，通过低速离心使细胞沉淀并且将无细胞上清液通过0.22uM过滤器(CELLTREAT Scientific,Shirley,MA)过滤。将该滤液用作Sf-弹状病毒接种物以检查Sf-RVN细胞对该病毒的易感性。
对于感染性实验，将Sf-RVN细胞以5mL ESF921培养基(Expression Systems,Woodland,CA)中2.0×106个细胞的密度一式两份接种于25cm2烧瓶中并且在28℃孵育1h以允许细胞贴壁。然后去除生长培养基，并且重复的烧瓶中的细胞可以：(1)用2.5mL补充有10％(v/v)胎牛血清的TNM-FH培养基模拟感染或者(2)用2.5mL以上描述的Sf-弹状病毒接种物感染。将细胞在28℃孵育2h，并且然后添加2.5mL补充有10％(v/v)胎牛血清的新鲜TNM-FH培养基，并且将细胞在28℃孵育另外24h。在感染后24h，将一组模拟感染的细胞或Sf-弹状病毒接种物感染的细胞洗涤三次并且进行收获。第二组进一步在28℃孵育，在感染后72h取样并且连续传代(P0至P1)，并且然后在两个另外的72h孵育时间段之后再次取样并连续传代，直至进行总计三次传代。将在每个传代水平获得的样品用于通过低速离心产生细胞沉淀物，提取总RNA，并且通过RT-PCR测定样品，如实施例4中描述的。
在任何时间点从模拟感染的Sf-RVN细胞获得的RNA或在感染后24h或72h从Sf-弹状病毒接种物感染的P0 Sf-RVN细胞获得的RNA未观察到Sf-弹状病毒特异性扩增子(图12)。然而，在P1之后在72h从Sf-弹状病毒接种物感染的Sf-RVN细胞获得的RNA观察到微弱的扩增子，并且其强度随着在P2之后在72h和在P3之后在72h获得的RNA而逐渐增加(图12)。这些结果清楚地表明Sf-RVN细胞易受用由污染的Sf细胞产生的Sf-弹状病毒的感染影响。
实施例14.常规方法未能产生无病毒的建立的T.ni细胞系。我们还试图通过在补充有10％(v/v)胎牛血清加不同浓度的抗病毒药物(包括利巴韦林、6-氮杂尿苷和阿糖腺苷)混合物的TNM-FH培养基中培养多克隆TN-368细胞群体来分离无Tn-野田村病毒的细胞。将细胞与这三种药物一起培养15天，特别地进行连续传代，并且通过RT-PCR常规测试样品的Tn-野田村病毒，如实施例16中描述。如图13A-图13B中示出的，对应于Tn-野田村病毒区段1和2的扩增子存在于已经在测试的所有浓度的抗病毒混合物中孵育的TN-368细胞中(分别为图13A和图13B)。因此，与Sf9细胞一样，我们使用用这种抗病毒混合物处理的TN-368细胞群体不能获得无野田村病毒的T.ni细胞。
实施例15.用于获得缺乏病毒的建立的T.ni细胞系的示例性方法。在发现用抗病毒药物混合物处理的多克隆TN-368细胞培养物保持Tn-野田村病毒阳性之后，我们采用所公开的用于获得无病毒细胞系的方法。该示例性方法实施方案包括通过有限稀释来分离单个TN-368细胞，以分离单细胞，将分离的细胞接种到96孔板中的补充有10％(v/v)胎牛血清和200μg/mL利巴韦林的TNM-FH培养基中以形成第一培养物组合物。将第一培养物组合物培养约一个月，特别地进行扩增以逐渐产生更大的培养物，并且在达到25cm2烧瓶水平之后，通过RT-PCR随后是巢式PCR测试样品的Tn-野田村病毒，如实施例16中描述的。将缺乏Tn-野田村病毒的克隆(图14A，泳道CL#3)转移至缺乏抗病毒药物的培养基中以形成第二培养物组合物。使该克隆(被命名为Tn-NVN传代第零代(P0))适应无血清ESF 921培养基并且悬浮生长。随后将Tn-NVN细胞系维持在该第二培养物组合物和生长形式中。
实施例16.Tn-野田村病毒特异性逆转录-PCR(RT-PCR)/巢式PCR。收获包含1×106个细胞的TN-368和Tn-NVN培养物的样品，并且通过低速离心使细胞沉淀。将无细胞上清液通过0.22μm过滤器(CELLTREAT Scientific,Shirley,MA)过滤，并且然后在4℃以131,000×g超速离心22h。根据制造商的方案，使用RNASolv试剂(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)从低速细胞沉淀物和高速无细胞沉淀物提取总RNA。然后将RNA定量，并且用作用于根据制造商的方案用ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA)和被命名为Noda-7的Tn-野田村病毒特异性引物(SEQ ID NO:24)进行cDNA合成的模板。将等量的各cDNA制备物与Taq DNA聚合酶、ThermoPol反应缓冲液(New England Biolabs)和Tn-野田村病毒RNA区段1-(Noda-1；SEQ ID NO:19和Noda-2；SEQ ID NO:20)或区段2-(Noda-6；SEQ ID NO:23和Noda-7；SEQ ID NO:24)特异性引物对一起用于巢式PCR。将反应混合物在94℃孵育3min，在94℃持续30s、60℃持续1min和72℃持续1min循环35次，并且最后在72℃孵育10min。然后将1μL各初始PCR物用作在相同条件下与Tn-野田村病毒RNA区段1-(Noda-1i；SEQ ID NO:21和Noda-2i；SEQ ID NO:22)或区段2-(Noda-6i；SEQ ID NO:25和Noda-7i；SEQ ID NO:26)特异性引物对一起用于巢式PCR的模板。根据标准方法，通过琼脂糖凝胶电泳与溴化乙锭染色分析RT-PCR的产物以及RT-PCR随后是巢式PCR的产物。用于这些测定的各引物的序列示于表5中。
Figure BDA0003892913750000291
Figure BDA0003892913750000301
1由用奇数/偶数引物对的PCR产生的扩增产物的尺寸。
实施例17.Tn-NVN细胞不具有可检测的Tn-野田村病毒。从在不同传代水平的Tn-NVN中分离总RNA，并且用Tn-野田村病毒区段1(图15A)或区段2(图15B)特异性的引物通过RT-PCR随后是巢式PCR测定Tn-野田村病毒的存在，如实施例16中描述的。Tn-野田村病毒特异性RT-PCR/巢式PCR结果表明Tn-NVN细胞在任何抗病毒药物不存在下在至少55代连续传代中不具有可检测的Tn-野田村病毒(图15A-图15C)。我们还从通过超速离心来自在第55代传代的Tn-NVN细胞的无细胞培养基(CFM)获得的沉淀物部分中分离总RNA，并且使用其以使用Tn-野田村病毒特异性RT-PCR/巢式PCR测定Tn-野田村病毒，如实施例16中描述的。如图15C中示出的，在对应于从TN-368细胞中分离的RNA和从TN-368的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA的泳道中观察到Tn-野田村病毒扩增子。相比之下，在从Tn-NVN的无细胞培养基沉淀物中分离的RNA中未检测到Tn-野田村病毒扩增子。图15A-图15C中示出的所有结果使用来自在抗病毒药物不存在下培养的细胞的RNA获得。总之，这些结果表明，在任何抗病毒药物不存在下的55代传代过程中，在Tn-NVN细胞或无细胞培养基中不存在可检测的Tn-野田村病毒RNA，这表明这些细胞是无Tn-野田村病毒的。
实施例18.支原体检测。根据制造商的方案，我们还使用来自ATCC(Manassas,VA)的通用支原体检测试剂盒测试包含约105个Tn-NVN或TN-368细胞的样品的支原体。这种基于PCR的测定使用与在超过60种不同支原体、无胆甾原体、螺原体和脲原体物种(包括作为细胞培养物污染物被频繁发现的8种物种)的16S rRNA基因中保守的序列互补的引物。图16中示出的结果表明，TN-368与Tn-NVN细胞均未被检测到支原体污染。在两种情况下，PCR产物的不存在不是由于昆虫细胞裂解物对PCR反应的抑制，因为在使用掺入对照模板的裂解物进行的PCR中观察到预期尺寸的扩增子(图16，泳道Tn-NVN(+)和TN-368(+))。
实施例19.Tn-NVN和TN-368细胞的细胞生长特性、形态学和直径。我们使用实施例7中描述的技术比较了Tn-NVN细胞的一般特性与TN-368的一般特性，包括它们的培养物密度、直径和形态学。结果显示Tn-NVN和TN-368细胞在接种到平行的摇瓶培养物中的ESF-921培养基中之后五天过程中实现了几乎相同的平均密度(图17A)。结果还揭示在这些细胞培养实验过程期间在Tn-NVN和TN-368细胞的平均直径(图17B)或形态学(图17C)方面无显著差异。总之，这些结果表明，该研究中检查的Tn-NVN和TN-368细胞的一般特性相同或实质上相同。
实施例20.Tn-NVN和TN-368细胞以几乎相同的水平产生重组蛋白。我们还使用β-gal、hSEAP和hEPO比较了由Tn-NVN和TN-368细胞支持的杆状病毒介导的重组蛋白产生的水平，如实施例9中描述的。重要的是要强调制备每种重组杆状病毒的无Tn野田村病毒的工作原种并用于这些研究，如实施例8中描述的。
大肠杆菌β-gal表达实验揭示在感染的4天时间过程中在由Tn-NVN和TN-368细胞产生的细胞内酶活性水平(图18A)或总细胞内β-gal蛋白(图18B和图18C)方面无显著差异。同样，我们注意到与较早时间点相比，酶活性和免疫反应性细胞内β-gal两者的水平在感染后3-4天时均降低，这可能反映了在这些感染的较后期(at these later times ofinfection)的杆状病毒诱导的细胞毒性。
我们在感染的4天时间过程中对hSEAP产生和分泌的分析产生了基本上相同的结果，揭示在由Tn-NVN和TN-368细胞产生的hSEAP活性或免疫反应性分泌型hSEAP蛋白的水平方面无统计学显著差异(图19A-图19C)。
最后，当我们比较在4天感染期间通过Tn-NVN和TN-368细胞的hEPO产生和分泌的水平时，我们获得相同的一般性结果(图20A-图20B)。这些结果表明Tn-NVN和TN-368细胞以相同或实质上相同的水平产生和分泌三种不同的重组蛋白。
实施例21.Tn-NVN和TN-368细胞的N-聚糖分析。我们分析了Tn-NVN和TN-368细胞的N-糖基化谱，如实施例10中描述的。从由Tn-NVN和TN-368细胞产生的hEPO中分离的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析显示它们提供了基本上相同的糖基化模式。来自两种细胞系的hEPO上的绝大多数N-聚糖为双甘露糖基(bimannosyl)核心结构(图21A，结构1)，但我们也观察到具有和不具有末端N-乙酰葡糖胺残基的小比例的岩藻糖基化三甘露糖基核心结构(图21A，结构3和6)。
实施例22.源自家蚕的BmN细胞系被Sf-弹状病毒感染。为了研究来自鳞翅目昆虫家蚕的细胞是否被污染，我们分析了BmN细胞系的Sf-弹状病毒的存在。将来自我们实验室细胞库的一小瓶BmN细胞(ATCC-CRL 8910)解冻，通过低速离心使细胞沉淀，并且提取总RNA，通过RT-PCR定量和测定，如实施例4中描述的。基本上如描述的进行RT-PCR，不同之处在于，在这种情况下，独立的RT-PCR用对所有六种Sf-弹状病毒基因特异性的引物进行(表6)。
Figure BDA0003892913750000321
如图22中观察到的，观察到对应于所有六种Sf-弹状病毒基因(N、P、M、G、X、和L)的扩增子。这些结果表明，源自鳞翅目昆虫家蚕(草地贪夜蛾的近亲)的BmN细胞系也被Sf-弹状病毒感染。
总而言之，我们的结果表明许多建立的细胞系可能感染了病毒。这可能是由于这些细胞系源自其的生物体的持续病毒感染。我们的结果还证明了所公开的用于获得建立的系的方法是广泛适用的。
管理机构批准BICS来源的生物制剂在人类和兽医患者中使用的最近的激增是BICS作为一种真正的商业生物制剂制造平台出现的一个至关重要的里程碑。然而，在最频繁用作用于杆状病毒载体的宿主的昆虫细胞系(包括Sf和Tn细胞)中感染性病毒污染物的发现提出了关于BICS生产的生物制剂安全性的问题。在这种情况下，重要的是要强调，不存在Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒对人类或兽医患者构成明确威胁的证据。尽管如此，对在任何生物制造平台中鉴定到任何外来因子(adventitious agents)的明确反应是消除该因子，以创建固有地更为安全的系统。因此，我们发明了Sf-RVN和Tn-NVN，它们分别未被Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒污染。事实上，这两种细胞系均缺乏这些最近鉴定到的病毒污染物中任何一种的任何可检测痕迹。
这个结论是基于高度灵敏的RT-PCR/巢式PCR测定的结果，我们使用它来证明在我们实验室在至少55代传代过程中Sf-RVN细胞和无细胞培养基不具有可检测的Sf-弹状病毒，并且Tn-NVN细胞和无细胞培养基不具有可检测的Tn-野田村病毒RNA。这得到了我们的Sf-弹状病毒-和Tn-野田村病毒-特异性RT-PCR/巢式PCR测试方案的持续时间的强烈支持，该方案仍在进行中，并且此时已分别揭示在170代和100代连续传代过程中在Sf-RVN中不存在Sf-弹状病毒的痕迹或在Tn-NVN细胞中不存在Tn-野田村病毒的痕迹。如果这些细胞具有低水平的Sf-弹状病毒或Tn-野田村病毒污染，我们预期这些病毒相当快速地复制至可检测的水平，特别是考虑到在Sf细胞培养物中据报道高水平的污染(2×109个颗粒/mL细胞外生长培养基)。另外，我们已经通过对Sf-21细胞的公开可用的基因组和转录物组数据(Geisler和Jarvis,2016)，以及通过对我们的Sf-RVN细胞大规模平行测序获得的原始基因组和转录物组数据库进行生物信息学分析证实并扩展了我们的Sf-RVN结果(表2)。
来自本发明的教导的另一个结论是Sf-RVN和Tn-NVN细胞在其作为用于BICS的可选宿主的潜力的情况下的基本特性分别与Sf9和TN-368细胞的那些基本特性高度相似，由于Sf9和TN-368细胞在该领域中的广泛使用，我们将它们用作用于BICS的“金标准”宿主。我们发现我们的Sf-RVN与我们的Tn-NVN细胞均未被检测到支原体污染。我们还发现，在标准细胞培养维护方案的参数内分别检查的Sf-RVN和Sf9以及Tn-NVN和TN-368细胞的基本生长特性是不可区分的。
来自本发明的教导的另一个结论是，Sf-RVN和Tn-NVN细胞至少可以与它们的病毒污染的对应物一样起到用作BICS的宿主组分的作用。这一结论得到Sf-RVN和Sf9以及Tn-NVN和TN-368细胞分别支持大致相等水平的重组蛋白和糖蛋白产生、分泌和酶活性的发现结果的支持。形式上，这个结论可能仅适用于本文作为模式物使用的三种不同的产物。虽然我们使用细胞内细菌蛋白和两种分泌型人类N-糖蛋白努力地来扩大我们的分析，可能的是，将发现Sf-RVN和/或Tn-NVN细胞在未来产生更高或更低水平的其他重组蛋白。我们还发现Sf-RVN和Sf9以及Tn-NVN和TN-368细胞分别提供了几乎相同的N-糖基化模式。Sf-RVN和Sf9以及Tn-NVN和TN-368细胞提供几乎相同的N-糖基化模式的结论形式上仅适用于hEPO，其是用于分析使用的模式物。然而，与重组蛋白产生水平方面的潜在变化相比，Sf-RVN和Sf9以及Tn-NVN和TN-368远不可能使其他产物不同地进行N-糖基化，因为用给定产物获得的分析结果反映了内源N-聚糖加工能力。如果它们存在，在我们通过不同细胞系分析hEPO糖基化中将检测到N-聚糖加工程度方面的差异。
在本文检查的Sf-RVN和Sf9细胞的另一个重要的功能性能力是其产生感染性重组杆状病毒后代的能力。出乎意料地，我们发现，与Sf9细胞相比，当用于繁殖两种不同重组杆状病毒时Sf-RVN细胞产生更高水平的感染性后代(在一些情况下多达5至10倍)(图11)。这种差异是统计学显著的，并且证明Sf-RVN细胞优于Sf9细胞的明显优势。
尽管已经提及多种应用、方法和组合物描述了所公开的教导，应当理解，可以做出多种改变和修改而不脱离本文的教导。提供上文的实施例是为了更好地说明本发明的教导，并且不意图限制本文教导的范围。此外，本领域技术人员随后可以做出各种当前未预见到或未预料到的替代方案、修改、变化或其中的改进，其也意图被涵盖在所附权利要求书中。根据所附权利要求书，可以进一步理解本发明的教导的某些方面。
在下文的一个或多个实施方案中可实现本公开的各方面。
1.一种源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的细胞系，所述细胞系的特征在于缺乏病毒，其中所述细胞系在结构上和功能上不同于所述病毒污染的生物体或所述病毒污染的细胞。
2.根据实施方案1所述的细胞系，其中所述细胞系源自感染病毒的昆虫。
3.根据实施方案2所述的细胞系，其中所述细胞系源自鳞翅目(lepidopteran)昆虫。
4.根据实施方案3所述的细胞系，其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、或家蚕(Bombyx mori)。
5.根据实施方案4所述的细胞系，其中所述细胞系源自草地贪夜蛾细胞系。
6.根据实施方案5所述的细胞系，其特征还在于缺乏Sf-弹状病毒。
7.根据实施方案6所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖时，与所述Sf9细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
8.根据实施方案6所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下用AcP(-)p6.9hEPO或AcP(-)p6.9hSEAP感染时，与所述Sf9细胞相比增加的感染性重组杆状病毒颗粒的产生。
9.根据实施方案6所述的细胞系，其中所述细胞系易受Sf-弹状病毒感染影响。
10.根据实施方案9所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖时，与所述Sf9细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
11.一种源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的细胞系，所述细胞系的特征在于缺乏病毒。
12.根据实施方案11所述的细胞系，其中所述细胞系源自病毒污染的粉纹夜蛾细胞。
13.根据实施方案12所述的细胞系，其特征还在于缺乏α野田村病毒。
14.根据实施方案13所述的细胞系，其中所述粉纹夜蛾细胞包括TN-368细胞系。
15.根据实施方案14所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和TN-368细胞在相同条件下繁殖时与所述TN-368细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
16.一种用于获得源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的无病毒细胞系的方法，包括：
从病毒污染的生物体或从病毒污染的细胞分离细胞；
将所分离的细胞与包含抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第一培养物组合物；
将所述第一培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而产生多个细胞；
取出所述多个细胞或所述细胞培养基的一部分并且测试病毒的存在或不存在；
将所述多个细胞中的至少一些与不具有抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第二培养物组合物；以及
将所述第二培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而获得无病毒细胞系。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述病毒包括Sf-弹状病毒或α野田村病毒。
18.根据实施方案16所述的方法，其中所述细胞系源自昆虫。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述昆虫包括鳞翅目昆虫。
20.根据实施方案19所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粉纹夜蛾、或家蚕。
21.根据实施方案16所述的方法，其中所述细胞系源自病毒污染的原代细胞。
22.根据实施方案16所述的方法，其中所述细胞系源自被病毒污染的细胞系。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述病毒污染的细胞系包括Sf-21细胞或Sf9细胞，并且其中所述病毒包括Sf-弹状病毒。
24.根据实施方案22所述的方法，其中所述细胞系包括被α野田村病毒污染的粉纹夜蛾细胞系。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述细胞系包括TN-368、BTI-Tn-5B1-4、或Tni PRO细胞。
26.根据实施方案16所述的方法，其中所述测试包括(a)RT-PCR；(b)RT-PCR和巢式PCR；(c)定量RT-PCR；或(d)基于抗体的检测技术。
27.根据实施方案16所述的方法，其中所述抗病毒化合物为核苷类似物。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述核苷类似物包括以下的至少一种：利巴韦林、6-氮杂尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、9-/3-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A)、胞嘧啶阿拉伯糖，腺嘌呤阿拉伯糖苷和鸟嘌呤7-N-氧化物(G-7-Ox)。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述核苷类似物为6-氮杂尿苷。
30.根据实施方案16所述的方法，其中所述病毒包括Sf-弹状病毒或α野田村病毒；其中所述分离包括有限稀释；其中所述细胞系源自草地贪夜蛾或粉纹夜蛾；其中所述抗病毒化合物为6-氮杂尿苷；并且其中所述测试包括：(a)RT-PCR或(b)RT-PCR和巢式PCR。

Claims (30)

1.一种源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的细胞系，所述细胞系的特征在于缺乏病毒，其中所述细胞系在结构上和功能上不同于所述病毒污染的生物体或所述病毒污染的细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系源自感染病毒的昆虫。
3.根据权利要求2所述的细胞系，其中所述细胞系源自鳞翅目(lepidopteran)昆虫。
4.根据权利要求3所述的细胞系，其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、或家蚕(Bombyx mori)。
5.根据权利要求4所述的细胞系，其中所述细胞系源自草地贪夜蛾细胞系。
6.根据权利要求5所述的细胞系，其特征还在于缺乏Sf-弹状病毒。
7.根据权利要求6所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖时，与所述Sf9细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
8.根据权利要求6所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下用AcP(-)p6.9hEPO或AcP(-)p6.9hSEAP感染时，与所述Sf9细胞相比增加的感染性重组杆状病毒颗粒的产生。
9.根据权利要求6所述的细胞系，其中所述细胞系易受Sf-弹状病毒感染影响。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和Sf9细胞在相同条件下繁殖时，与所述Sf9细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
11.一种源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的细胞系，所述细胞系的特征在于缺乏病毒。
12.根据权利要求11所述的细胞系，其中所述细胞系源自病毒污染的粉纹夜蛾细胞。
13.根据权利要求12所述的细胞系，其特征还在于缺乏α野田村病毒。
14.根据权利要求13所述的细胞系，其中所述粉纹夜蛾细胞系包括TN-368细胞系。
15.根据权利要求14所述的细胞系，其特征还在于，当所述细胞系和TN-368细胞在相同条件下繁殖时与所述TN-368细胞相同或实质上相同的细胞密度、倍增时间、平均细胞直径、形态学和N-糖基化模式。
16.一种用于获得源自病毒污染的生物体或病毒污染的细胞的无病毒细胞系的方法，包括：
从病毒污染的生物体或从病毒污染的细胞分离细胞；
将所分离的细胞与包含抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第一培养物组合物；
将所述第一培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而产生多个细胞；
取出所述多个细胞或所述细胞培养基的一部分并且测试病毒的存在或不存在；
将所述多个细胞中的至少一些与不具有抗病毒化合物的细胞培养基组合以形成第二培养物组合物；以及
将所述第二培养物组合物在适于细胞生长和分裂的条件下孵育，从而获得无病毒细胞系。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒包括Sf-弹状病毒或α野田村病毒。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞系源自昆虫。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述昆虫包括鳞翅目昆虫。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粉纹夜蛾、或家蚕。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞系源自病毒污染的原代细胞。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞系源自被病毒污染的细胞系。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病毒污染的细胞系包括Sf-21细胞或Sf9细胞，并且其中所述病毒包括Sf-弹状病毒。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞系包括被α野田村病毒污染的粉纹夜蛾细胞系。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞系包括TN-368、BTI-Tn-5B1-4、或TniPRO细胞。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述测试包括(a)RT-PCR；(b)RT-PCR和巢式PCR；(c)定量RT-PCR；或(d)基于抗体的检测技术。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗病毒化合物为核苷类似物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述核苷类似物包括以下的至少一种：利巴韦林、6-氮杂尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、9-/3-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A)、胞嘧啶阿拉伯糖，腺嘌呤阿拉伯糖苷和鸟嘌呤7-N-氧化物(G-7-Ox)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述核苷类似物为6-氮杂尿苷。
30.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒包括Sf-弹状病毒或α野田村病毒；其中所述分离包括有限稀释；其中所建立的细胞系源自草地贪夜蛾或粉纹夜蛾；其中所述抗病毒化合物为6-氮杂尿苷；并且其中所述测试包括：(a)RT-PCR或(b)RT-PCR和巢式PCR。
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