JP2018532411A - ウイルスフリーの細胞株及びそれを取得する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年11月1日に出願された米国仮出願第62/249,288号の利益を主張するものであり、その内容全体を参照により本願明細書に援用する。
[連邦予算による研究に関する宣言]
本願発明を説明する際に使用される用語「細胞株」は、1つ又はいくつかの共通の祖先細胞(これは限定するものではないが、例えば単一の単離細胞から増殖した細胞のクローン集団)から増殖していった細胞の1集団を意味する。「樹立細胞株」とは、新しい培養培地、増殖のための空間、及び適切な条件下でインキュベートした場合に無限に増殖する可能性を有する細胞株である。このような細胞株は、生体内に見出される自然に存在する対応細胞と比較すると、インビトロでの変化(限定するものではないが例えば、形質転換、染色体変化、又はその両方)を経ている。第1の細胞株から単一の細胞を単離し、第2の細胞株を得るために、この単離した細胞を増殖させて多数の細胞を得ること、によって得られる細胞株を、時には前記第1の細胞株の「サブクローン」と呼ぶ。細胞株はサブクローンに由来する。
鱗翅目の昆虫細胞(限定するものではないが、例えばツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞又はイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞)の集団から単一の細胞を単離する工程;
単離した細胞を、少なくとも1つの抗ウイルス化合物を含む細胞培養培地と組み合わせて、第1の培養組成物を作製する工程;細胞が増殖及び分裂するのに適した条件下で第1の培養組成物をインキュベートし、それにより多数の細胞を生成する工程;
任意選択的に、細胞又は細胞培養培地の一部を採り、Sf-ラブドウイルス又はノダウイルスの存在について試験する工程;
第1の培養組成物由来の多数の細胞の少なくともいくつかを抗ウイルス化合物を含まない細胞培養培地と混合して第2の培養組成物を作製する工程;及び
細胞が増殖及び分裂するのに適した条件下で第2の培養組成物をインキュベートし、それによりウイルスが存在しないことを特徴とする細胞株を得る工程。
Sf-ラブドウイルスに汚染していることが知られているSf9細胞を、ESF921培地(エクスプレッション・システムズ(Expression Systems)、ウッドランド(Woodland)、CA)中28℃で振盪フラスコ培養として規定通りに培養した。Tn-ノダウイルスに汚染していることが知られているTN-368細胞を、10%ウシ胎児血清(アトランタ・バイオロジカルズ(Atlanta Biologicals, Inc.)、フローリーブランチ(Flowery Branch)、GA)と1%pluronicF-68(インビトロジェン(Invitrogen)、カールスバッド(Carlsbad)、CA)を添加したTN-MFH培地中28℃で付着培養として規定通りに培養した。
Sf-ラブドウイルスフリーの由来株を単離するために本願発明者らが最初に努力したことには、10%(v/v)ウシ胎児血清(アトランタ・バイオロジカルズ(Atlanta Biologicals, Inc.)、フローリーブランチ(Flowery Branch)、GA)と種々の濃度のリバビリン(オキシケム・コーポレーション(Oxchem Corporation)、イルウインデール(Irwindale)、CA)を添加したTNM-FH培地中でポリクローナルSf9細胞集団を培養することが含まれていた。続いて、本願発明者らは、ポリクローナルSf9細胞集団を、種々の濃度の3種類の抗ウイルス薬(リバビリン、6-アザウリジン(アルファ・エイサー(Alfa Aesar)、ウォードヒル(Ward Hill)、MA)及びビダラビン(ティーシーアイ・アメリカ(TCI America)、ポートランド(Portland)、OR))で処理した。前記Sf9細胞を、これらの3つの薬物が添加された状態で、約1ヶ月間随時継代しながら培養し、サンプルを、実施例4に記載するように、RT-PCRによるSf-ラブドウイルス汚染の試験に規定通りに供した。100μg/mLのリバビリンで約1か月処理した後、本願発明者らはRT-PCRで検出可能なSf-ラブドウイルスを含まないSf9サブクローンを得た(図1A)。このSf-ラブドウイルスフリーのサブクローンを、10%(v/v)ウシ胎仔血清を添加したが抗ウイルス剤を添加していないTNM-FH培地に移し、実施例4に記載するように、RT-PCR/nested PCRにより再試験をした。本願発明者らが驚いたことに、これらの細胞を、抗ウイルス薬を欠く培養培地に移すと、それらはSf-ラブドウイルス陽性の表現型に戻った(図1B)。続いて、本願発明者らはポリクローナルSf9細胞集団を、3種類の抗ウイルス薬(リバビリン、6-アザウリジン及びビダラビン)の様々な濃度の組み合わせで処理した。再び、本願発明者らが驚いたことに、これらの3つの薬物で約1ヶ月間処理した細胞がSf-ラブドウイルスについて依然として陽性であることを発見した(図1C)。従って、これらの同じ抗ウイルス薬による処理によって、脊椎動物細胞でラブドウイルス汚染が無くなった以前の研究とは全く対照的に、このアプローチではSf9細胞からSf-ラブドウイルスを除去することができなかった。
抗ウイルス薬で処理したポリクローナルSf9培養細胞が、薬剤フリー培地で増殖すると、Sf-ラブドウイルス陽性の表現型に戻ったことを発見した後、本願発明者らはウイルスに汚染した出発物質から樹立ウイルスフリー細胞株を得るための新規方法を開発した。この例示する実施形態には、限界希釈により単一のSf9細胞を単離し、次いでこの単離した細胞サブクローンを抗ウイルス薬で処理することが含まれている。10%(v/v)ウシ胎児血清(アトランタ・バイオロジカルズ(Atlanta Biologicals, Inc.)、フローリーブランチ(Flowery Branch)、GA)及び10μg/mLのリバビリン(オキシケムコーポレーション(Oxchem Corporation)、イルウインデール(Irwindale)、CA)又はビダラビン(ティーシーアイ・アメリカ(TCI America)、ポートランド(Portland)、OR))を添加したTNM-FH培地中、96ウェルプレートに前記細胞を播種した。前記細胞を、段々と大きな培養スケールになるよう随時増殖させながら約1ヶ月間培養し、25cm2フラスコレベルに達したら、実施例4に記載するように、サンプルをSf-ラブドウイルス汚染についてPCRにより試験した。Sf-ラブドウイルス汚染が無いクローン(図2B)を抗ウイルス薬を含まない培地に移し、Sf-RVN細胞継代ゼロ代目(P0)と称するとした。そして、P2で、無血清ESF921培地中の振盪フラスコ培養に移し、続いてこの培地と様式で培養した。
1×106個の細胞を含有するSf9及びSf-RVN細胞培養物のサンプルを採取し、細胞を低速遠心分離によってペレットとした。細胞を含まない上清を0.22μmフィルター(セルトリート・サイエンティフィック(CELLTREAT Scientific)、シャーリー(Shirley)、MA)で濾過し、次に131,000xg、22時間、4℃で超遠心分離した。製造業者のプロトコールに従って、RNASolv試薬(オメガ・バイオテック(OmegaBio-Tek, Inc.)、ノルクロス(Norcross)、GA)を用いて低速遠心による細胞ペレット及び高速遠心による無細胞ペレットの両方から全RNAを抽出した。次いで、前記RNAを定量し、これをテンプレートとして、ProtoScript II First Strand cDNA合成キット(ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)、イプスウィッチ(Ipswich)、MA)及び320-SP1(配列番号:9)と名付けたSf-ラブドウイルス特異的プライマーを用いて、製造業者のプロトコールに従ってcDNAを合成した。等量の各cDNA調製物を用いて、TaqDNAポリメラーゼ、ThermoPol反応バッファー(ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs))、及びSf-ラブドウイルス特異的プライマーMono-1(配列番号:1)及びMono-2(配列番号:2)によるPCRを行った。この反応混合物を94℃で3分間インキュベートし、94℃で30秒、55℃で1分間、及び72℃で1分間のサイクルを35回行い、最後に72℃で10分間インキュベートした。それから、プライマーがネスト化したSf-ラブドウイルス特異的プライマーMono-1i(配列番号:7)及びMono-2i(配列番号:8)であることを除いては同じ条件の下で、各1次PCR(RT-PCR)産物の1μLを、2次PCR(RT-PCR/nested PCR)のテンプレートとして用いた。RT-PCR及びRT-PCRを行った後にnested PCRを行って得られた産物を、標準的方法に従ってアガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって分析した。これらのアッセイに使用した各プライマーの配列を表1に示す
実施例4に記載したように、種々の継代レベルにおけるSf-RVN細胞抽出物から全RNAを単離し、RT-PCR/nested PCRを用いてSf-ラブドウイルスの存在について試験した。予想されたように、このアッセイの陽性対照としてSf9細胞由来の全RNAを使用した場合、予想されたサイズの強い増幅産物が観察された(図3A、3B及び3C)。対照的に、本願発明者らが、本願発明者らの研究室にあるいずれの抗ウイルス薬も添加しないで、60代(図3A)又は120代(図3B)の連続継代の過程で5継代ごとにSf-RVN細胞から全RNAを単離して使用した場合、増幅産物は観察されなかった。本願発明者らは、Sf-ラブドウイルスの複製が行われないキイロショウジョウバエ(D. melanogaster)S2R+細胞から単離した全RNAの陰性対照においても、増幅産物を観察しなかった。本願発明者らは、Sf-ラブドウイルスのLタンパク質のコーディング配列の他の領域に由来する2つの他のSf-ラブドウイルス特異的プライマー対(Mono-3(配列番号:3)/Mono-4(配列番号:4)及びMono-5(配列番号:5)/Mono-6(配列番号:6);表1参照)を使用してSf9細胞から単離した全RNAについてのRT-PCRを行った場合、予想したサイズの強い増幅を観察したが、Sf-RVN細胞からの全RNAではこの増幅を観察しなかった(データ示さず)。最後に、本願発明者らは継代60代後に、Sf9無細胞培地を超遠心して得られたペレットから単離した全RNAについて、RT-PCR/nested PCRアッセイを行うと、予想されるサイズの強い増幅産物を観察したが、Sf-RVN無細胞培地を超遠心して得られたペレットから単離した全RNAではこの増幅を観察しなかった(図3C)。まとめると、これらの結果から、いずれの抗ウイルス薬も添加せずに120代継代を重ねたSf-RVN細胞又は無細胞培地には検出可能なSf-ラブドウイルスRNAは存在せず、これらの細胞がSf-ラブドウイルスフリーであることが示された。
本願発明者らはまた、約105個のSf-RVN細胞又はSf9細胞を含むサンプルを、マイコプラズマの有無について、アメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection(マナサス(Manassas)、VA))のユニバーサルマイコプラズマ検出キット(マナサス(Manassas)、VA)を製造者のプロトコールに従って用いて、試験した。このPCRをベースとしたアッセイでは、60種類以上のマイコプラズマ、アコレプラズマ、スピロプラズマ及びウレアプラズマ種、細胞培養の汚染要因としてしばしば見出される8種を含めての16SrRNA遺伝子間で保存された配列に相補的なプライマーを使用する。図4に示す結果によれば、Sf9細胞とSf-RVN細胞のいずれも検出可能なほどにマイコプラズマに汚染されていないことが示された。コントロールテンプレートをスパイクした溶解物を用いて行ったPCRでは予想サイズのアンプリコンが観察されたため、PCR産物が存在しないのは、昆虫細胞溶解物による前記PCR反応の阻害によるものではなかった(図4)。
Sf-RVN細胞又はSf9細胞を、50mLの振盪フラスコ培養液中において、1.0x106細胞/mLの開始密度で播種し、3連サンプルを24時間毎に4日間採取し、COUNTESS(登録商標)自動細胞カウンター(サーモフィッシャー・サイエンティフィック(ThermoFisher Scientific, Inc.))を使用して、生存細胞密度及びサイズを測定した。倍加時間は以下の公式を用いて計算した:
Td=T×Log2/Log(Q2/Q1)
ここで、Td=倍加時間、T=最後の継代以後に経過した時間(時間)、Q1=細胞播種密度及びQ2=生存細胞数である。
細胞形態は、Olympus FSX-100顕微鏡及びFSX-BSW画像ソフトウェア(オリンパス・ライフサイエンス・ソリューション(Olympus Life Sciences Solutions)、セントラルバレー(Center Valley)、ペンシルバニア(Pennsylvania))を用いて、10倍の倍率で位相差画像を収集することにより記録した。
完全長でタグを付けていない大腸菌β-ガラクトシダーゼ(β-gal)をコードするBacPAK6-ΔChi/Cathと称するバキュロウイルス発現ベクターを2つの連続した工程で産生した。第1工程では、BacPAK6ウイルスDNAを、バキュロウイルスp6.9プロモーターの制御下で大腸菌β-グルクロニダーゼをコードするプラスミドで組み換えた。このプラスミドでは、AcMNPVのchiA遺伝子及びv-cath遺伝子の代わりに前記p6.9-β-グルクロニダーゼ遺伝子が挿入されており、野生型AcMNPVのフランキング配列内に埋め込まれている。所望の組換え体を、X-GlcA(アールピーアイ(RPICorp.)、マウントプロスペクト(Mount Prospect)、IL)の存在下でその青色プラークの表現型によって暫定的に同定した。組換え部位を、β-グルクロニダーゼ遺伝子配列及びAcMNPVgp64遺伝子の5'UTR配列(それぞれ前記転移プラスミドの内部配列及び外部配列に相当する)に特異的なプライマーを用いたPCRにより確認した。このウイルスを増幅し、ウイルスDNAを単離し、I-SceIで切断してβ-グルクロニダーゼ発現カセット全体を除去した。第2工程では、Sf9細胞をI-SceI切断ウイルスDNAでトランスフェクトした。得られた後代をX-GlcAの存在下でプラークアッセイをして分離し、最終的な組換えバキュロウイルスBacPAK6-ΔChi/Cathをその白色プラークの表現型によって同定した。
ESF921培地中のSf-RVN細胞又はSf9細胞を、1×106細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。次いで、細胞をESF921培地で偽感染させるか、又は0.1若しくは5プラーク形成単位(pfu)/細胞の感染多重度(multiplicities of infection, MOIs)で、Sf-ラブドウイルスフリーのストックのBacPAK6-ΔChi/Cath、AcP(±)p6.9hSEAP若しくはAcP(+)p6.9hEPOに感染させた。感染後の様々な時点において、感染細胞を採取し、細胞密度を測定し、低速遠心分離によって細胞をペレット化した。次に、細胞及び無細胞培地を、以下に記載するように、発現するモデルタンパク質の性質及び実験の目的に応じて、様々な方法で処理した。しかし、いずれの場合も、以下に示すように、細胞抽出物及び/又は無細胞培地中の組換えタンパク質のレベルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE;(Laemmli、1970))及びタンパク質特異的又はタグ特異的一次抗体並びにアルカリホスファターゼ結合二次抗体を使ったイムノブロッティング(Towbin et al.、1979)によって測定した。抗体と反応するタンパク質を、標準的なアルカリ性ホスファターゼに基づく発色反応を用いて可視化し、Image Jソフトウェアのバージョン1.48(米国国立衛生研究所)を使用してバンドをスキャン、及び定量することによって相対強度を見積もった。
Sf-RVN細胞及びSf9細胞の50mL振盪フラスコ培養物に、Sf-ラブドウイルスフリーのストックであるAcP(-)p6.9hEPOを感染させ、hEPOをNi-NTA樹脂(サーモフィッシャー(Thermo Fisher))を用いて細胞及びウイルスフリーの上清からアフィニティー精製した。PNGase-F(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs))で処理することにより精製hEPO調製物からN-グリカンを酵素的に切り離し、この切り離されたN-グリカンを精製し、誘導体化し、既知の方法に従ってMALDI-TOF-MSによって分析した。Sf細胞において産生されたN-グリカンの予測された質量及び知見に基づいて、ピークに構造を割り当て、一般的な模式図による象徴表現を用いて注釈を付け、簡略化のために番号を付けた。異なる構造の相対的な定量は、個々のペルメチル化N-グリカン構造の同位体クラスターからのピーク強度を合わせたものを、すべての注釈を付けたN-グリカンピークの総強度で割ることによって行った。
Sf9細胞は、組換えタンパク質生産の宿主としての有用性に加えて、バキュロウイルスストックの産生のための最良の宿主の一つであると広く考えられている。したがって、Sf9細胞及びSf-RVN細胞によって産生される感染性組換えバキュロウイルスベクター後代の量を比較することは興味深いものであった。この実験では、2つの異なるSf-ラブドウイルスフリーのバキュロウイルスストック(AcP(-)p6.9hEPO及びAcP(-)p6.9hSEAP)を両方の細胞株に感染させ、4つ全ての感染体から出芽してきた後代ウイルス(すなわち感染性組み換えバキュロウイルスを含む細胞培養培地)を回収し、実施例8で記載したように、プラークアッセイで感染性ウイルスの力価を比較した。3回独立して繰り返し取得した生物サンプルの結果によれば、両方のバキュロウイルス(AcP(-)p6.9hEPO及びAcP(-)p6.9hSEAP)のワーキングストックは、Sf-RVN細胞によって産生された場合、Sf9細胞によって産生されたものと比較して、約5から10倍高い力価を示した(図11)。
Sf細胞ゲノム及びトランスクリプトームのバイオインフォマティクス検索は、公的にアクセス可能なNCBI BLASTNインターフェース(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)を用いて行った。既定の設定としたmegaBLASTを使い、公開されているSf-ラブドウイルスゲノム(Genbankアクセッション番号NC_025382.1)をクエリーとして、Sf-21細胞株の転写配列アセンブリ(Genbankアクセッション番号GCTM00000000.1、BioProjectID 271593(Kakumani \et al., Biol. Direct 10, 1-7,2015)及びツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)幼虫頭部転写配列アセンブリ(Genbankアクセッション番号GESP00000000.1、BioProjectID 318819(Cinel et al.))を検索した。
Sf9細胞株を10%(v/v)ウシ胎児血清(アトランタ・バイオロジカル(Atlanta Biologicals, Inc.)、フローリーブランチ(Flowery Branch)、GA)を添加したTNM-FH培地に、50mLの振盪フラスコ中で1.0×106細胞/mLの開始密度で播種した。細胞を振盪インキュベーター内、28℃で3日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を低速遠心分離によってペレット化し、無細胞上清を0.22μMフィルター(セルトリート・サイエンティフィック(CELLTREAT Scientific)、シャーリー(Shirley)、MA)で濾過した。この濾液をSf-ラブドウイルス接種物として用いて、このウイルスに対するSf-RVN細胞の感受性を調べた。
本願発明者らはまた、10%(v/v)のウシ胎仔血清及びリバビリン、アザウリジン及びビダラビンを含む種々の濃度の抗ウイルス薬のカクテルを添加したTNM-FH培地中で、ポリクローナルTN-368細胞集団を培養することによってTn-ノダウイルスフリーの細胞を単離することを試みた。前記細胞をこれらの3つの薬物を用いて15日間随時継代しながら培養し、サンプルを実施例16に記載するようにRT-PCRでTn-ノダウイルスの存在・非存在についての試験を規定通りに行った。図13Aと図13Bに示すように、試験した抗ウイルス性カクテルの全ての濃度でインキュベートしたTN-368細胞において、Tn-ノダウイルスセグメント1及び2に対応するアンプリコンが存在した(それぞれ図13A及び13B)。したがって、Sf9細胞の場合と同様に、本願発明者らは、この抗ウイルス性カクテルで処理したTN-368細胞の集団を用いてノダウイルスフリーのT. ni細胞を得ることができなかった。
抗ウイルス薬カクテルで処理したポリクローナルTN-368細胞培養物がTn-ノダウイルス陽性のままであることを発見した後、本願発明者らは、ウイルスフリーの細胞株を得るために、本願発明の方法を用いた。この例示する方法の実施形態では、単一細胞を単離するための限界希釈によって単一のTN-368細胞を単離し、この単離した細胞を10%(v/v)ウシ胎仔血清及び200μg/mLリバビリンを添加したTNM-FH培地中で96ウェルプレートに播種して第1の培養組成物を作製した。第1の培養組成物を約1ヶ月間、随時増幅をしながら段々により大きな培養物とする。25cm2のフラスコレベルに到達した後、実施例16に記載するように、サンプルについてRT-PCRを行った後にnested PCRを行うことによりTn-ノダウイルスの存在を確認する試験をした。Tn-ノダウイルスが存在しないクローン(図14A、レーンCL#3)を、抗ウイルス薬を含まない培地に移して第2の培養組成物とした。Tn-NVN細胞継代ゼロ代目(P0)と称するとしたクローンを、血清を含まないESF921培地に馴化させ、懸濁液中で増殖させた。続いてTn-NVN細胞株をこの第2の培養組成物及び増殖様式で維持した。
1×106細胞を含有するTN-368細胞培養物及びTn-NVN細胞培養物のサンプルを採取し、低速遠心分離によって細胞をペレットとした。細胞を含まない上清を0.22μmフィルター(セルトリート・サイエンティフィック(CELLTREAT Scientific)、シャーリー(Shirley)、MA)で濾過し、次に131,000xg、22時間、4℃で超遠心分離した。製造業者のプロトコールに従って、RNASolv試薬(オメガ・バイオテック(OmegaBio-Tek, Inc.),ノルクロス(Norcross),GA)を用いて低速遠心による細胞ペレット及び高速遠心による無細胞ペレットの両方から全RNAを抽出した。次いで前記RNAを定量し、これをテンプレートとして、ProtoScript II First Strand cDNA合成キット(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)、イプスウィッチ(Ipswich)、MA)及びNoda-7(配列番号24)と名付けたTn-ノダウイルス特異的プライマーを用いて、製造業者のプロトコールに従って、cDNAを合成した。等量の各cDNA調製物を用いて、TaqDNAポリメラーゼ、ThermoPol反応バッファー(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs))、及びTn-ノダウイルスRNAセグメント1-(Noda-1;配列番号19及びNoda-2;配列番号20)又はセグメント2-(Noda-6;配列番号23及びNoda-7;配列番号24)特異的プライマー対によるnested PCRを行った。反応混合物を94℃で3分間インキュベートし、94℃で30秒、60℃で1分、及び72℃で1分のサイクルを35回行い、最後に72℃で10分間インキュベートした。次いで、Tn-ノダウイルスRNAセグメント1-(Noda-1i;配列番号21及びNoda-2i;配列番号22)又はセグメント2-(Noda-6i;配列番号25及びNoda-7i;配列番号26)特異的プライマー対を用いて、同じ条件の下で、各1次PCR産物の1μLを、nested PCRのテンプレートとして用いた。RT-PCR及びRT-PCRを行った後にnested PCRを行って得られた産物を、標準的方法に従ってアガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって分析した。これらのアッセイに使用した各プライマーの配列を表5に示す。
実施例16で記載したように、種々の継代レベルにおけるTn-NVN細胞から全RNA単離し、Tn-ノダウイルスの存在についてTn-ノダウイルスセグメント1(図15A)又は2(図15B)に特異的なプライマーを用いたRT-PCRを行った後にnested PCRを行うことによりアッセイした。Tn-ノダウイルス特異的RT-PCR/nested PCRの結果によれば、いずれの抗ウイルス薬も存在しない状態で、Tn-NVN細胞は少なくとも55代の連続継代の間に検出可能なTn-ノダウイルスを有さないことが示された(図15Aから15C)。本願発明者らは、実施例16に記載したように、継代55代目のTn-NVN細胞からの無細胞培地(CFM)を超遠心分離して得られたペレット画分から全RNAを単離し、Tn-ノダウイルス特異的RT-PCR/nested PCRを用いてTn-ノダウイルスのアッセイを実施した。図15Cで示すように、TN-368細胞及びTN-368無細胞培地のペレットから単離されたRNAに対応するレーンにTn-ノダウイルスのアンプリコンが観察された。対照的に、前記Tn-ノダウイルスのアンプリコンは、Tn-NVN無細胞培地のペレットから単離されたRNAでは検出されなかった。図15Aから15Cに示す全ての結果は、抗ウイルス薬の非存在下で培養された細胞由来のRNAを用いて得られたものである。まとめると、これらの結果により、いずれの抗ウイルス薬も存在しない状態で、継代55代目までのTn-NVN細胞又は無細胞培地中には検出可能なTn-ノダウイルスRNAは存在せず、これらの細胞がTn-ノダウイルスフリーであることが示された。
本願発明者らはまた、約105個のTn-NVN細胞又はTN-368細胞を含むサンプルについて、マイコプラズマの有無を、ATCC(マナサス(Manassas)、VA)のユニバーサルマイコプラズマ検出キットを製造者のプロトコールに従って使用し、試験をした。このPCRをベースとしたアッセイでは、60種類以上のマイコプラズマ、アコレプラズマ、スピロプラズマ及びウレアプラズマ種、細胞培養の汚染要因としてしばしば見出される8種を含めての16SrRNA遺伝子間で保存された配列に相補的なプライマーを使用する。図16に示す結果によれば、TN-368細胞とTn-NVN細胞のいずれも検出可能な程度にマイコプラズマに汚染されていないことが示された。両方の場合において、PCR産物が存在しないことは、昆虫細胞溶解物による前記PCR反応の阻害によるものではなかった。コントロールテンプレートをスパイクした溶解物を用いて行ったPCRでは予想されるサイズのアンプリコンが観察されたからである(図16、レーンTn-NVN(+)及びTN-368(+))。
本願発明者らは、実施例7に記載の技術を用いて、培養密度、直径及び形態を含めて、Tn-NVN細胞の特性をTn-368細胞の特性と比較した。その結果、ESF-921培地中の平行振盪フラスコ培養に播種した後5日間にわたって、Tn-NVN細胞及びTN-368細胞は、実質的に同一の平均密度となった(図17A)。この結果によりまた、これらの細胞培養実験を通じて、Tn-NVN細胞及びTN-368細胞の平均直径(図17B)又は形態(図17C)に有意差がないことが明らかになった。全体として、これらの結果は、この研究で調べたTn-NVN細胞及びTN-368細胞の一般的性質が同じであるか又は実質的に同じであることを示した。
本願発明者らはまた、実施例9に記載したように、β-gal、hSEAP及びhEPOを用いて、Tn-NVN細胞及びTN-368細胞におけるバキュロウイルスを介した組換えタンパク質の産生レベルを比較した。実施例8に記載したように、各組換えバキュロウイルスのTn-ノダウイルスフリーのワーキングストックを調製し、これらの研究に使用したことを強調することは重要である。
実施例10で記載した通り、本願発明者らはTn-NVN細胞及びTN-368細胞のN-グリコシル化プロファイルを分析した。Tn-NVN細胞及びTN-368細胞によって産生されたhEPOから単離されたN-グリカンをMALDI-TOF-MS分析すると、両方の細胞株が本質的に同一のグリコシル化パターンを生じることが示された。両方の細胞株由来のhEPO上のN-グリカンの大部分はバイマンノシルコア構造(図21A、構造1)であった。しかし、本願発明者らは僅かながら、末端N-アセチルグルコサミンが付いているあるいは付いていないフコシル化されたトリマンノシルコア構造も観察した(図21A、構造3及び6)。
鱗翅目の昆虫であるカイコガ(Bombyx mori)由来の細胞が汚染しているかどうかを調べるために、本願発明者らはSf-ラブドウイルスの存在についてBmN細胞株を分析した。本願発明者らの実験室細胞バンクからのBmN細胞(ATCC-CRL8910)のバイアルを解凍し、実施例4に記載のように、細胞を低速遠心分離によってペレット化し、全RNAを抽出し、定量し、RT-PCRによってアッセイした。この場合、6つすべてのSf-ラブドウイルス遺伝子に特異的なプライマーを用いて、それぞれ独立してRT-PCRを行った以外は、基本的に記載のように実施した。
Claims (30)
- ウイルスに汚染した生物又はウイルスに汚染した細胞に由来する細胞株であって、ウイルスが存在していないことを特徴とし、ウイルスに汚染した前記生物又はウイルスに汚染した前記細胞とは構造的及び機能的に異なる、細胞株。
- ウイルスに感染した昆虫に由来する、請求項1に記載の細胞株。
- 鱗翅目の昆虫に由来する、請求項2に記載の細胞株。
- 前記鱗翅目の昆虫がツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)又はカイコガ(Bombyx mori)を含む、請求項3に記載の細胞株。
- ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞株に由来する、請求項4に記載の細胞株。
- Sf-ラブドウイルスが存在しないことを更に特徴とする、請求項5に記載の細胞株。
- Sf9細胞と同じ条件で増殖させた場合、細胞密度、倍加時間、平均細胞直径、形態及びN-グリコシル化パターンがSf9細胞と同じであるか又は実質的に同じであることを更に特徴とする、請求項6に記載の細胞株。
- Sf9細胞と同じ条件でAcP(-)p6.9hEPO又はAcP(-)p6.9hSEAPに感染させた場合、Sf9細胞と比較して感染性組換えバキュロウイルス粒子の産生が増加することを更に特徴とする、請求項6に記載の細胞株。
- Sf-ラブドウイルス感染に感受性のある、請求項6に記載の細胞株。
- Sf9細胞と同じ条件で増殖させた場合、細胞密度、倍加時間、平均細胞直径、形態及びN-グリコシル化パターンが、Sf9細胞と同じであるか又は実質的に同じであることを更に特徴とする、請求項10に記載の細胞株。
- ウイルスに汚染した生物又はウイルスに汚染した細胞から得られる細胞株であって、ウイルスが存在しないことを特徴とする細胞株。
- ウイルスに汚染したイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞に由来する、請求項12に記載の細胞株。
- アルファノダウイルスが存在しないことを更に特徴とする、請求項13に記載の細胞株。
- イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞株がTN-368細胞株を含む、請求項13に記載の細胞株。
- TN-368細胞と同じ条件で増殖させた場合、細胞密度、倍加時間、平均細胞直径、形態及びN-グリコシル化パターンがTN-368細胞と同じであるか又は実質的に同じであることを更に特徴とする、請求項14に記載の細胞株。
- ウイルスに汚染した生物又はウイルスに汚染した細胞に由来するウイルスフリーの細胞を得るための方法であって、
ウイルスに汚染した生物又はウイルスに汚染した細胞から細胞を単離する工程;
単離した前記細胞を、抗ウイルス化合物を含む細胞培養培地と混合して第1の培養組成物を作製する工程;
前記細胞が増殖及び分裂するのに適した条件下で前記第1の培養組成物をインキュベートし、それにより多数の細胞を生成する工程;
前記多数の細胞又は前記細胞培養培地の一部を除去し、ウイルスの存在又は非存在について試験する工程;
前記多数の細胞の少なくともいくつかを、抗ウイルス化合物を含まない細胞培養培地と混合して第2の培養組成物を作製する工程;及び
前記細胞が増殖及び分裂するのに適した条件下で前記第2の培養組成物をインキュベートし、それによりウイルスフリーの細胞株を得る工程を含む、方法。 - 前記ウイルスがSf-ラブドウイルス又はアルファノダウロウイルスを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞株が昆虫由来である、請求項16に記載の方法。
- 前記昆虫が鱗翅目の昆虫を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記鱗翅目の昆虫がツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)又はカイコガ(Bombyx mori)を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞株がウイルスに汚染した初代細胞に由来する、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞株がウイルスに汚染した細胞株に由来する、請求項16に記載の方法。
- 前記ウイルスに汚染した細胞株がSf-21細胞又はSf9細胞を含み、前記ウイルスがSf-ラブドウイルスを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞株がアルファノダウイルスに汚染したイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞株を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞株がTN-368細胞、BTI-Tn-5B1-4細胞又はTniPRO細胞を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記試験が、(a)RT-PCR;(b)RT-PCR及びnested PCR;(c)定量RT-PCR;又は、(d)抗体をベースとした検出技術を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記抗ウイルス化合物がヌクレオシド類似体である、請求項16に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド類似体が、リバビリン、6-アザウリジン、ビダラビン、アシクロビル、9-/3-D-アラビノフラノシルアデニン(Ara-A)、シトシンアラビノース、アデニンアラビノシド及びグアニン7-N-オキシド(G-7-Ox)の少なくとも1つを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド類似体が6-アザウリジンである、請求項28に記載の方法。
- 前記ウイルスがSf-ラブドウイルス又はアルファノダウロウイルスを含み;前記単離工程が限界希釈を含み;樹立された前記細胞株がツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)又はイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来であり;前記抗ウイルス化合物が6-アザウリジンであり;前記試験が(a)RT-PCR又は(b)RT-PCR及びnested PCRを含む、請求項16に記載の方法。
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