ES2922081T3 - Líneas celulares libres de virus y métodos para su obtención - Google Patents

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Abstract

Las enseñanzas actuales están dirigidas a nuevas líneas de células libres de virus derivadas del material mirador contaminado con virus, como un organismo o una línea celular. También se proporcionan métodos para obtener líneas celulares libres de virus obtenidas del material de partida contaminado con virus. Las líneas celulares libres de virus ejemplares incluyen: nuevas líneas celulares derivadas de una línea celular Spodoptera Frugiperda contaminada con SF-Rabdovirus, en el que las nuevas líneas celulares carecen de SF-Rhabdovirus; y nuevas líneas celulares derivadas de una línea celular de Trichoplusia Ni contaminada con un alfanodavirus, en el que la nueva línea celular carece de un alfanodavirus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Líneas celulares libres de virus y métodos para su obtención
Campo
Las enseñanzas actuales generalmente se refieren a líneas celulares continuas de Spodoptera frugiperda que están libres de Sf-rhabdovirus contaminantes. Las enseñanzas actuales también se refieren a métodos para obtener líneas celulares de Spodoptera frugiperda libres de Sf-rhabdovirus que derivan de células u organismos que están contaminados con Sf-rhabdovirus.
Antecedentes
Las células propagadas in vitro se pueden clasificar en términos generales como células primarias o líneas celulares continuas, también denominadas líneas celulares establecidas. Las células primarias pueden obtenerse aislando un órgano o tejido de un organismo y desagregándolo para crear una mezcla de células individuales. Cuando las células primarias se propagan en cultivo, se dividen solo un número limitado de veces antes de perder su capacidad de proliferar, un evento genéticamente determinado conocido como senescencia. Sin embargo, algunas células pasan por un proceso llamado transformación y adquieren la capacidad de dividirse indefinidamente. Estas células se denominan células transformadas o células continuas. En comparación con las células naturales que se encuentran en el tejido u órgano del que derivan, las líneas celulares continuas suelen tener anomalías genéticas, como aneuploidía o heteroploidía, y carecen de la inhibición por contacto y la dependencia del anclaje que a menudo se observa en las células primarias.
A lo largo de los años, se ha descubierto repetidamente que las células cultivadas utilizadas para la bioproducción están contaminadas con virus. Por ejemplo, a principios de la década de 1960 se descubrió que las vacunas de adenovirus y las vacunas de poliovirus que se producían en células primarias de riñón de mono Rhesus (RMK) estaban contaminadas con el virus simio 40 (SV40). Posteriormente se demostró que SV40 causaba tumores en hámsteres y se detectaron anticuerpos contra SV40 en personas que habían recibido la vacuna de poliovirus inactivado producida en células RMK primarias. En la década de 1970 se descubrió que varios lotes de vacunas vivas contra el sarampión, las paperas, la rubéola y la poliomielitis estaban contaminados con virus bacterianos conocidos como bacteriófagos. Se halló el virus de la leucosis aviar (ALV) y el virus aviar endógeno (AEV) en vacunas atenuadas contra la fiebre amarilla, el sarampión y las paperas producidas en fibroblastos de embrión de pollo. Se pensó que la fuente de los ALV y AEV asociados a la vacuna fueron los retrovirus endógenos integrados en el genoma del pollo. Más recientemente, se descubrió que varios lotes de vacunas contra rotavirus estaban contaminados con circovirus porcino infeccioso-1 (PCV-1).
Desde que se describió por primera vez en la bibliografía revisada por pares a principios de la década de 1980, el sistema de células de insecto-baculovirus (BICS) se ha convertido en una plataforma de producción de proteínas recombinantes ampliamente reconocida y muy utilizada. Las ventajas del BICS incluyen su flexibilidad, velocidad, simplicidad, capacidad de procesamiento de proteínas eucariotas y capacidad de producir complejos de proteínas de múltiples subunidades. Durante casi 30 años, se utilizó el BICS principalmente para producir proteínas recombinantes para la investigación básica en laboratorios académicos e industriales. Sin embargo, más recientemente, el BICS surgió como una auténtica plataforma de fabricación comercial, que ahora se utiliza para producir varios productos biológicos autorizados para su uso en la medicina humana (CeRvARIX®, PROVENGE®, GLYBERA® y FLUBLOK®) o veterinaria (PORCILIS® PESTI, BAYOVAC LCR E2®, CIRCUNVENT® PCV, INGELVAC CIRCOFLEX® y PORCILIS® PCV). Además, se está utilizando el BICS para producir otros diversos productos biológicos, incluidos los candidatos a vacunas contra norovirus, parvovirus, virus del Ébola, virus respiratorio sincitial y virus de la hepatitis E en varias etapas de ensayos clínicos en humanos.
Las líneas celulares de insectos que se usan más comúnmente como huéspedes en el BICS derivan de la oruga de la col, Trichoplusia ni (Tn), o gusano cogollero, Spodoptera frugiperda (Sf), y la mayoría de los productos biológicos fabricados con BICS se producen utilizando este último. La línea celular Sf original, denominada IPLB-SF-21, también conocida como Sf-21, se obtuvo de ovarios de pupas en 1977. Otras líneas celulares Sf comúnmente utilizadas incluyen Sf9 (un subclón de IPLB-SF-21) y sus subclones derivados, incluidos Super 9 y Sf900+, también conocidos como EXPRESSF+®. La línea celular Tn original, denominada TN-368, se obtuvo de tejido ovárico aislado de polillas hembra vírgenes recién emergidas, según informó Hink en 1970. Otras líneas de células Tn comúnmente utilizadas incluyen BTI-Tn-5B1-4 (comercializada como HIGH FIVE™) y células Tni PRO.
En 2007, un grupo de científicos de Japón y Nueva Zelanda descubrió que las células BTI-Tn-5B1-4 estaban contaminadas con un nuevo nodavirus (Li et al., J. Virol. 81:10890-96), denominado en la presente memoria "Tnnodavirus". Se confirmó y amplió este hallazgo cuando se descubrió que todas nuestras líneas celulares Tn de laboratorio, incluidas TN-368, BTI-Tn-5B1-4 y Tni PRO, estaban contaminadas con este virus. Posteriormente, en 2014, los científicos del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (CBER) de la FDA de EE. UU. descubrieron que todas las líneas celulares Sf analizadas, incluidas las células Sf-21 y Sf9 obtenidas de dos fuentes comerciales acreditadas, estaban contaminadas con un rhabdovirus, ahora conocido como Sf-rhabdovirus (Ma et al., J. Virol. 88: 6576-85, 2014). Un grupo de investigación de Takeda Vaccines, Inc. confirmó de forma independiente la presencia de Sf-rhabdovirus en las células Sf9 utilizadas para producir su candidata a vacuna contra el norovirus (Takeda Vaccines, Inc., publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2016/0244487; documento PCT/US14/59060). Además, se descubrió que todas nuestras líneas celulares Sf de laboratorio, incluidas Sf-21, Sf9 y EXPRESSF+ ®, obtenidas de una variedad de fuentes, estaban contaminadas con este virus.
Existe la necesidad de líneas celulares que estén libres de virus contaminantes y de métodos para generar líneas celulares libres de virus obtenidas a partir de líneas celulares infectadas con virus u organismos que estén persistentemente infectados o que contengan un virus endógeno.
J. L. Vaughn et al: " The establishment of two cell lines from the insect spodoptera frugiperda (lepidoptera; noctuidae)", In Vitro vol. 13, núm. 4, 1 de abril de 1977 describe un método para establecer líneas celulares de Spodoptera frugiperda a partir de células libres de virus. A. Saulnier et al: "Complete Cure of Persistent Virus Infections by Antiviral siRNAs", Molecular Therapy: The Journal Of The American Society of Gene Therapy, vol. 13, núm. 1, 1 de enero de 2006 describe un método para curar una infección persistente por poliovirus en células HEp-2 utilizando siARN.
Resumen
La presente invención se refiere a un método para obtener una línea celular de Spodoptera frugiperda libre de Sfrhabdovirus como se define en la reivindicación independiente 1.
Las enseñanzas actuales se dirigen a líneas celulares establecidas derivadas de células u organismos contaminados con virus, en las que la línea celular se caracteriza por la falta de virus a la vez que conserva las funciones celulares relevantes. Tales líneas celulares establecidas son particularmente útiles como componentes de plataformas biológicas utilizadas para la producción de vacunas, proteínas recombinantes y productos biológicos para uso humano y veterinario, por ejemplo, el BICS. Las enseñanzas actuales también se dirigen a métodos para obtener líneas celulares establecidas libres de virus a partir de células contaminadas con virus u organismos que están contaminados con virus, por ejemplo, pero sin limitación, una infección persistente o debida a un virus endógeno.
De acuerdo con una realización ejemplar, se obtiene directa o indirectamente una línea celular de insecto establecida del gusano cogollero, Spodoptera frugiperda. Esta línea celular se caracteriza por la falta de Sf-rhabdovirus, a diferencia de las células Sf9 y el gusano cogollero, de los que derivó la línea celular Sf9. Cuando se compara con la línea celular Sf9, las células de esta línea celular establecida ejemplar: crecen a densidades celulares iguales o muy similares en cultivo, tienen diámetros (tamaño) celulares iguales o muy similares, tienen tiempos de duplicación iguales o muy similares (tasa de crecimiento), y producen patrones similares de W-glicosilación. Las células de esta nueva línea celular establecida son funcionalmente diferentes de las células Sf9 porque producen más partículas de baculovirus recombinantes infecciosas con AcP(-)p6.9hEPO o AcP(-)p6.9hSEAP y no están contaminadas con Sfrhabdovirus. Esta nueva línea celular establecida se caracteriza además por ser estructuralmente (genéticamente) diferente de Spodoptera frugiperda y de las células Sf-21, de las que derivaron las células Sf9.
De acuerdo con ciertas realizaciones de las líneas celulares, una línea celular establecida a modo de ejemplo, caracterizada por la falta de virus, se obtiene de un organismo contaminado con virus o de células contaminadas con virus. En ciertos ejemplos divulgados en la presente memoria, la línea celular se obtiene de una célula de Trichoplusia ni contaminada con virus. En ciertos ejemplos descritos en la presente memoria, la línea celular de Trichoplusia ni es la línea celular TN-368. En ciertos ejemplos descritos en la presente memoria, el virus es un alfanodavirus. Como también se describe en la presente memoria, la línea celular se caracteriza además por una densidad celular, un diámetro celular promedio, una morfología y un patrón de W-glicosilación que es el mismo o sustancialmente el mismo que las células TN-368 cuando la línea celular y las células TN-368 se propagan en las mismas condiciones.
También se describe en la presente memoria otra línea celular establecida ejemplar, una línea celular de insecto que se obtiene directa o indirectamente de la oruga de la col, Trichoplusia ni. Esta línea celular se caracteriza por la falta de nodavirus, a diferencia de las células TN-368, derivadas de Trichoplusia ni. Cuando se compara con la línea celular TN-368, las células de esta línea celular ejemplar establecida: crecen a densidades celulares iguales o muy similares en cultivo, tienen diámetros celulares (tamaño) iguales o muy similares y producen patrones de n-glicosilación.
Según un método ejemplar para obtener una línea celular libre de virus derivada de un organismo contaminado por virus o células contaminadas por virus, comprende: aislar una célula de un organismo contaminado por virus o de células contaminadas por virus; combinar la célula aislada con un medio de cultivo celular que comprende un compuesto antiviral para formar una primera composición de cultivo; incubar la primera composición de cultivo en condiciones adecuadas para que la célula crezca y se divida, generando así una multiplicidad de células; retirar una porción de la multiplicidad de células o del medio de cultivo celular y probar la presencia o ausencia de un virus; combinar al menos parte de la multiplicidad de células con medios de cultivo celular sin un compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo; e incubar la segunda composición de cultivo en condiciones adecuadas para que las células crezcan y se dividan, obteniendo así una línea celular libre de virus.
De acuerdo con ciertos métodos ejemplares, se obtiene una línea celular establecida aislando una sola célula o un pequeño número de células a partir de células primarias infectadas con virus, una línea celular contaminada con virus o un organismo contaminado. La(s) célula(s) aislada(s) se combinan con medios de cultivo celular que contienen un compuesto antiviral, formando una primera composición de cultivo. La primera composición de cultivo se incuba en condiciones que permiten que las células crezcan y se dividan, generando así una multiplicidad de células. Los medios de cultivo se reemplazan periódicamente con medios de cultivo nuevos que contienen el compuesto antiviral. Se analiza la presencia o ausencia de virus en un pequeño número de células obtenidas de la primera composición de cultivo o un volumen de medio de cultivo obtenido de la primera composición de cultivo. Cuando no se detecta ácido nucleico viral, al menos algunas de las células de la primera composición de cultivo se combinan con medios de cultivo sin el compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo. La segunda composición de cultivo se incuba en condiciones que permiten que las células crezcan y se dividan y el medio de cultivo se reemplaza periódicamente con medio de cultivo fresco. En ciertas realizaciones, a medida que las células continúan creciendo, el número de células aumenta y las células se expanden desde un recipiente de cultivo a múltiples recipientes, incluso cuando las células se dividen periódicamente (también conocido como pase). En determinadas realizaciones, se analiza una muestra de células o medios de cultivo de al menos un recipiente de cultivo para determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico viral, un indicador de la presencia de virus. Una vez que el número de células ha alcanzado una cantidad suficiente, se pueden congelar o almacenar alícuotas de las células usando métodos conocidos.
Breve descripción de las figuras
Estas y otras características y ventajas de las enseñanzas actuales se comprenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y las figuras adjuntas. El experto en la técnica comprenderá que las figuras, descritas a continuación, tienen solamente fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las enseñanzas descritas de ninguna manera.
FIGS. 1A-1C: Sf-rhabdovirus en células Sf9 policlonales tratadas con fármaco antiviral. Las poblaciones de células Sf9 policlonales se trataron durante aproximadamente un mes con varias concentraciones de ribavirina (FIGS. 1A y 1B) o ribavirina, 6-azauridina y vidarabina (FIG. 1C), y luego se extrajo el ARN total y se analizó para determinar el ARN del Sf-rhabdovirus mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados mostrados en las FIGS. 1A y 1C se obtuvieron usando ARN de células que aún se estaban cultivando en presencia de fármacos antivirales, mientras que los que se muestran en la FIG. 1B se obtuvieron usando ARN de células que habían sido tratadas con ribavirina, pero luego se pasaron 12 veces en ausencia de fármacos antivirales, como se describe en el Ejemplo 2. Se usaron los ARN totales extraídos de células Sf9 o células S2R+ de Drosophila melanogaster ("S2" en las Figuras 1A-1C, 2A-2B, 3A-3C) como controles positivo y negativo, respectivamente. Se realizó una reacción de control negativo adicional sin molde (H2O). Los carriles marcados con "M" muestran los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIGS. 2A-2B: Sf-rhabdovirus en subclones de células Sf9 tratados con fármacos antivirales aislados. Se aislaron subclones de células Sf9 individuales mediante dilución limitante y se trataron durante aproximadamente un mes con varios fármacos antivirales, y luego se extrajo el ARN total de los clones individuales y se analizó el ARN del Sfrhabdovirus mediante RT-PCr (FIG. 2A) o Rt -PCR, seguido de PCR anidada (FIG. 2B), como se describe en el Ejemplo 4. Todos los resultados mostrados en las FIGS. 2A-2B se obtuvieron utilizando ARN de células que aún se estaban cultivando en presencia de fármacos antivirales. Los controles positivo y negativo y los marcadores de 100 pb fueron como se describe en la breve descripción de las FIGS. 1A-1C.
FIGS. 3A-3C: Ausencia de Sf-rhabdovirus en células Sf-RVN. Se aisló el ARN total de una línea celular de ejemplo, denominada "Sf-RVN", a varios niveles de pases y se analizó la presencia de Sf-rhabdovirus usando la RT-PCR específica de Sf-rhabdovirus, seguida de PCR anidada, como se describe en el Ejemplo 4. Esta línea celular ejemplar se generó expandiendo un subclón de Sf9 tratado con 6-azauridina que se descubrió que era negativo para la contaminación por Sf-rhabdovirus en la FIG. 2B. Los resultados de la RT-PCR/PCR anidada específica de Sfrhabdovirus demostraron que no había presencia de Sf-rhabdovirus en el transcurso de 60 pases y 120 pases de las células Sf-RVN (Figuras 3A y 3B, respectivamente). También se aisló el ARN total de la fracción del sedimento obtenido mediante ultracentrifugación de los medios libres de células (CFM) de las células Sf-RVN en el pase 60. El ARN total de este sedimento de CFM se analizó para detectar Sf-rhabdovirus utilizando la RT-PCR/PCR anidada específica de Sf-rhabdovirus. Como se muestra en la FIG. 3C, se observó un amplicón de Sf-rhabdovirus en los carriles correspondientes al ARN aislado de las células Sf9 y al ARN aislado del sedimento de medio libre de células Sf9 (FIG.
3C, carriles Sf9 y Sf9 CFM, respectivamente). Por el contrario, el amplicón de Sf-rhabdovirus no se detectó en el ARN aislado del sedimento de medio libre de células Sf-RVN (FIG. 3C, carril Sf-RVN CFM). Todos los resultados mostrados en las FIGS. 3A-3C se obtuvieron utilizando ARN de células que se cultivaron en ausencia de fármacos antivirales. Los ARN extraídos de las células Sf9 y del sedimento obtenido mediante ultracentrifugación de Sf9 CFM se utilizaron como controles positivos; y los ARN extraídos de células S2R+ (S2) se utilizaron como controles negativos. Se realizó una reacción de control negativo adicional sin molde (H2O), y los carriles marcados con M muestran los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIG. 4: Ensayos de micoplasmas. Los extractos de células Sf-RVN y Sf9 (-) se analizaron para detectar contaminación por micoplasmas usando el kit universal de detección de micoplasmas basado en PCR (American Type Culture Collection), como se describe en el Ejemplo 6. Se usó un plásmido que codifica una secuencia objetivo de ARNr de M. arginini como control positivo (FIG. 4, carril "M. arginini”). Se realizaron controles adicionales utilizando lisados celulares de Sf-RVN y Sf9 enriquecidos con este plásmido (FIG. 4, carriles marcados como Sf-RVN (+) y Sf9 (+), respectivamente) para determinar si el lisado interfería con el ensayo. Se realizó una reacción de control negativo sin molde (FIG. 4, carril H2O). El carril marcado con M muestra los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIGS. 5A-5D: Cultivo y morfología de células de Spodoptera. Las células Sf-RVN y Sf9 se sembraron en matraces de agitación a una densidad de 1,0 x 106 células/mL en medio ESF 921. Se recolectaron muestras por triplicado en varios momentos después de la siembra y se midieron los recuentos de células viables y los diámetros con un contador de células automatizado, como se describe en el Ejemplo 7. La figura muestra las densidades de células viables promedio (FIG. 5A), diámetros (FIG. 5B), y tiempos de duplicación (FIG. 5C) medidos en tres experimentos independientes, así como micrografías de contraste de fases de células Sf-RVN y Sf9 con un aumento de 10X, FIG. 5D). Las barras de error representan los intervalos de confianza (P<0,05).
FIGS. 6A-6B: Viabilidad celular después de la infección por baculovirus. Las células Sf-RVN y Sf9 se infectaron con una reserva libre de Sf-rhabdovirus de AcP(-)p6.9hSEAp a una MOI de 0,1 ufc/célula (FIG. 6a ) o 5 ufc/célula (FIG.
6B). Se recogieron muestras por triplicado en varios momentos después de la infección y se midió la viabilidad utilizando un contador de células automatizado, como se describe en el Ejemplo 7. Los gráficos muestran el porcentaje medio de viabilidad medido en dos experimentos independientes. Las barras de error representan los intervalos de confianza (P<0,05).
FIGS. 7A-7C: Producción de p-gal recombinante. Las células Sf-RVN y Sf9 se infectaron con una reserva libre de Sfrhabdovirus de BacPAK6-AChi/Cath a una MOI de 5 ufc/célula. Se recolectaron muestras por triplicado en varios momentos posteriores a la infección y se analizaron los extractos intracelulares clarificados para determinar la actividad de p-gal (FIG. 7A), como se describe en el Ejemplo 9. Este gráfico muestra los resultados promedio con barras de error que representan los intervalos de confianza (P< 0,05). También se utilizó un conjunto de extractos para medir los niveles de producción de p-gal intracelular total mediante análisis de inmunotransferencia (FIG. 7B) con densitometría láser de barrido (FIG. 7C) para estimar las densidades relativas de las bandas inmunorreactivas. Se observaron las mismas tendencias generales en dos réplicas biológicas independientes de este experimento.
FIGS. 8A-8F: Producción de hSEAP recombinante. Las células Sf-RVN y Sf9 se infectaron con una reserva libre de Sf-rhabdovirus de AcP(-)p6.9hSEAP a una MOI de 0,1 ufp/célula (FIGS. 8A, 8B y 8C) o 5 ufp/célula (FIGS. 8D, 8E y 8F). Se recolectaron muestras por triplicado en varios momentos posteriores a la infección, se prepararon medios libres de células y se analizaron para determinar la actividad de hSEAP, como se describe en el Ejemplo 9, y los resultados promedio se representaron gráficamente con barras de error que representan los intervalos de confianza (P<0,05; FIGS. 8A y 8D). También se usó un conjunto de medios sin células para medir los niveles de producción de hSEAP extracelular total mediante análisis de inmunotransferencia (FIGS. 8B y 8E) con densitometría láser de barrido (FIGS. 8C y 8F) para estimar las densidades relativas de las bandas inmunorreactivas.
FIGS. 9A-9B: Producción de hEPO recombinante. Las células Sf-RVN y Sf9 se infectaron con una reserva libre de Sfrhabdovirus de AcP(-)p6.9hEPO a una MOI de 5 ufc/célula. Las muestras se recogieron en varios momentos después de la infección y se prepararon medios libres de células y se analizaron para determinar los niveles de producción de hEPO extracelular total mediante análisis de inmunotransferencia (FIG. 9A), con densitometría láser de barrido (FIG.
9B) para estimar las densidades relativas de las bandas inmunorreactivas, como se describe en el Ejemplo 9.
FIGS. 10A-10B: Perfiles de n-glicosilación. Las células Sf-RVN y Sf9 se infectaron con una reserva libre de Sfrhabdovirus de AcP(-)p6.9hEPO a una MOI de 3 ufp/célula, y hEPO-His se purificó por afinidad del medio libre de células, como se describe en el Ejemplo 10. Los W-glicanos se liberaron enzimáticamente, se recuperaron, se permetilaron y se analizaron mediante MALDI-TOF MS (FIG. 10A), de acuerdo con los métodos conocidos, con los iones moleculares detectados como estructuras asignadas [M Na]+, anotadas utilizando las representaciones simbólicas en viñetas estándar, numeradas para simplificar y presentadas como porcentajes del total (FIG. 10B).
FIG. 11: Producción de baculovirus recombinantes. Se infectaron células Sf-RVN y Sf9 con reservas libres de Sfrhabdovirus de AcP(-)p6.9hSEAP o AcP(-)p6.9hEPO. La progenie resultante se recolectó y se tituló mediante ensayos de placas, como se describe en el Ejemplo 11. Los títulos resultantes se trazaron como los títulos virales promedio obtenidos en tres experimentos independientes, con barras de error que representan los intervalos de confianza representados como (P<0,05) o '**' (P<0,001).
FIG. 12: Infección por Sf-rhabdovirus de células Sf-RVN. Las células Sf-RVN se infectaron de forma simulada o se infectaron con medio libre de células derivado de células Sf9, como se describe en el Ejemplo 13, y luego se extrajo el ARN total y se analizó en busca de Sf-rhabdovirus mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 4. El carril marcado como: M contiene marcadores de pares de bases; Sf9 contiene material amplificado a partir de ARN de células Sf9; el simulado contiene material amplificado a partir de ARN de células Sf-RVN obtenido después de que las células se infectaran de forma simulada; P0 (24) y (72) contienen material amplificado a partir de ARN de células Sf-RVN obtenido después de que las células se infectaran con Sf-rhabdovirus durante 24 y 72 h, respectivamente; P1 (72), P2 (72) y P3 (72) contienen material amplificado a partir de ARN de células Sf-RVN obtenido 72 h después de la primera, segunda o tercera vez que se pasaron las células después de infectarlas con Sf-rhabdovirus, respectivamente; S2 contiene material amplificado a partir de ARN de células S2R+; y H2O contiene agua destilada.
FIGS. 13A-13B: Tn-nodavirus en células policlonales TN-368 tratadas con fármacos antivirales. Las poblaciones de células policlonales TN-368 se trataron durante 15 días con varias concentraciones de un cóctel de tres fármacos antivirales, ribavirina, 6-azauridina y vidarabina. El ARN total se extrajo de las células que aún se estaban cultivando en presencia de estos fármacos y se analizó para detectar el segmento 1 (FIG. 13A) o 2 (FIG. 13B) de ARN de nodavirus Tn mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 16. Se usaron los ARN totales extraídos de células TN-368 o Sf9 como controles positivos o negativos, respectivamente. Se realizó una reacción de control negativo adicional sin molde (H2O). Los carriles marcados con "M" muestran los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIGS. 14A-14B: Ausencia de Tn-nodavirus en subclones de células TN-368 tratadas con ribavirina. Se aisló el ARN total de seis subclones de TN-368 de una sola célula tratados durante un mes con 200 pg/ml de ribavirina. A continuación, las muestras se analizaron para detectar el segmento 1 de ARN de nodavirus Tn mediante RT-PCR (FIG. 14A) o RT-PCR, seguido de PCR anidada (FIG. 14B), como se describe en el Ejemplo 16. Los ARN totales extraídos de las células TN-368 o Sf9 se usaron como controles positivos o negativos, respectivamente. Los carriles marcados con "M" muestran los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIGS. 15A-15C: Ausencia de Tn-nodavirus en células Tn-NVN. Se aisló el ARN total de una línea celular ejemplar, denominada "Tn-NVN", cultivada en varios pases en ausencia de fármacos antivirales y se analizó la presencia de Tnnodavirus mediante RT-PCR, seguida de PCR anidada con cebadores específicos del segmento 1 (FIG. 15A) o del segmento 2 (FIG. 15B) de Tn-nodavirus, como se describe en el Ejemplo 16. Esta línea celular ejemplar, denominada Tn-NVN, se generó mediante la expansión de un clon de TN-368 tratado con ribavirina (Cl n.° 3), que resultó ser negativo para la contaminación por Tn-nodavirus (Figuras 15A-15C). Los resultados de la RT-PCR específica de Tnnodavirus, seguida de la PCR anidada, demostraron que no había presente Tn-nodavirus después de 55 pases de las células Tn-NVN (Figuras 15A y 15B). También se aisló el ARN total de la fracción del sedimento obtenido al ultracentrifugar el CFM de las células Tn-NVN en el paso 55 y se usó para analizar el Tn-nodavirus usando la RT-PCR específica de Tn-nodavirus, seguida de PCR anidada, como se describe en Ejemplo 16. Como se muestra en la FIG.
15C, se observó un amplicón de Tn-nodavirus en los carriles correspondientes al ARN aislado de células TN-368 y al ARN aislado del sedimento de medio libre de células TN-368 (FIG. 15C, carriles TN-368 y TN-368 c Fm , respectivamente). Por el contrario, el amplicón de Tn-nodavirus no se detectó en el ARN aislado del sedimento de medio libre de células Tn-NVN. Nuevamente, todos los resultados mostrados en la FIG. 15A-15C se obtuvieron usando ARN de células cultivadas en ausencia de fármacos antivirales. Los ARN extraídos de células TN-368 y del sedimento obtenido mediante ultracentrifugación de medios libres de células TN-368 (CFM) se utilizaron como controles positivos, y el ARN extraído de células Sf9 se utilizó como control negativo. Se realizó una reacción de control negativo adicional sin molde (H2O), y los carriles marcados con M muestran los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIG. 16: Ensayos de micoplasmas. Los extractos de células Tn-NVN y TN-368 (-) se analizaron para determinar la contaminación por micoplasmas usando el kit universal de detección de micoplasmas basado en PCR (American Type Culture Collection), como se describe en los Ejemplos 6 y 18. Se usó un plásmido que codifica una secuencia objetivo de ARNr de M. argininicomo control positivo (FIG. 16, carril "M. arginini'). Se realizaron controles adicionales usando lisados de células Tn-NVN y TN-368 enriquecidos con este plásmido (FIG. 16, carriles Tn-NVN (+) y TN-368 (+), respectivamente) para determinar si el lisado interfería con el ensayo. Se realizó una reacción de control negativo sin molde (H2O). El carril marcado con M muestra los marcadores de 100 pb, con los tamaños seleccionados indicados a la izquierda.
FIGS. 17A-17C: Cultivo y morfología celular. Las células Tn-NVN y TN-368 se sembraron en matraces de agitación a una densidad de 1,0 x 106 células/mL en medio ESF 921. Se recogieron muestras por triplicado en varios momentos después de la siembra y se midieron los recuentos de células viables y los diámetros con un contador de células automatizado, como se describe en los Ejemplos 7 y 19. La figura representa las densidades de células viables promedio (FIG. 17A) y los diámetros (FIG. 17B) medidos en tres experimentos independientes, así como micrografías de contraste de fases de células Tn-NVN y TN-368 con un aumento de 10X (FIG. 17C). Las barras de error representan los intervalos de confianza (P<0,05).
FIGS. 18A-18C: Producción de p-gal recombinante. Las células Tn-NVN y TN-368 se infectaron con una reserva libre de Tn-nodavirus de BacPAK6-AChi/Cath a una MOI de 5 ufc/célula. Se recogieron muestras por triplicado en varios momentos después de la infección y se analizó la actividad de p-gal en los extractos intracelulares clarificados (FIG.
18A), como se describe en los Ejemplos 9 y 20. Este gráfico muestra los resultados promedio con barras de error que representan los intervalos de confianza (P< 0,05). También se usó un conjunto de extractos para medir los niveles de producción de p-gal intracelular total mediante análisis de inmunotransferencia (FIG. 18B), con densitometría láser de barrido (FIG. 18C) para estimar las densidades relativas de bandas inmunorreactivas. Se observaron las mismas tendencias generales en dos réplicas biológicas independientes de este experimento.
FIGS. 19A-19C: Producción de hSEAP recombinante. Las células Tn-NVN y TN-368 se infectaron con una reserva libre de Tn-nodavirus de AcP(-)p6.9hSEAP a una MOI de 5 ufc/célula. Se recogieron muestras por triplicado en varios momentos posteriores a la infección, se prepararon medios libres de células y se analizaron para determinar la actividad de hSEAP, como se describe en los Ejemplos 9 y 20, y los resultados promedio se representaron con barras de error que representan los intervalos de confianza (P<0,05; FIG. 19A). También se usó un conjunto de medios libres de células para medir los niveles de producción total de hSEAP extracelular mediante análisis de inmunotransferencia (FIG. 19B), con densitometría láser de barrido (FIG. 19C) para estimar las densidades de las banda inmunorreactivas relativas.
FIGS. 20A-20B: Producción de hEPO recombinante. Las células Tn-NVN y TN-368 se infectaron con una reserva libre de Tn-nodavirus de AcP(-)p6.9hEPO a una MOI de 5 ufc/célula. Las muestras se recogieron en varios momentos después de la infección y se prepararon medios libres de células y se analizaron para determinar los niveles de producción de hEPO extracelular total mediante análisis de inmunotransferencia (FIG. 20A), con densitometría láser de barrido (FIG. 20B) utilizada para estimar las densidades relativas de las bandas inmunorreactivas, como se describe en los Ejemplos 9 y 20.
FIGS. 21A-21B: Perfiles de W-glicosilación. Las células Tn-NVN y TN-368 se infectaron con una reserva libre de Tnnodavirus de AcP(-)p6.9hEPO a una MOI de 3 ufp/célula y hEPO-His se purificó por afinidad a partir del medio libre de células, como se describe en los Ejemplos 10 y 21. Los W-glicanos se liberaron enzimáticamente, se recuperaron, se permetilaron y se analizaron mediante MALDI-TOF MS (FIG. 21A), según métodos conocidos, y a los iones moleculares detectados como [M Na]+ se les asignaron las estructuras, anotadas usando las representaciones simbólicas de viñetas estándar, numeradas para simplificar y presentadas como porcentajes del total (FIG. 21B).
FIG. 22: Sf-rhabdovirus en células BmN. El ARN total se extrajo de la línea celular BmN, derivada del insecto lepidóptero, Bombyx mori, como se describe en el Ejemplo 4. Luego, las muestras se analizaron en busca de varios ARN de Sf-rhabdovirus (N, P, M, G, X y L) mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 22.
Descripción detallada de ciertas realizaciones ejemplares
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como las siguientes descripciones detalladas son únicamente ilustrativas y ejemplares, y no pretenden limitar el alcance de las enseñanzas descritas. Los encabezados de las secciones utilizados en la presente memoria tienen solo fines organizativos, y no deben interpretarse como una limitación de la materia de las enseñanzas descritas.
En el Resumen anterior, la Descripción detallada, las Figuras adjuntas y las reivindicaciones a continuación, se hace referencia a características particulares (incluyendo etapas del método) de las enseñanzas actuales. Debe entenderse que la descripción en esta memoria descriptiva incluye las posibles combinaciones de tales características particulares. Por ejemplo, pero sin limitación, cuando se describe una característica particular en el contexto de una realización particular de las enseñanzas actuales, o una reivindicación particular, esa característica también puede usarse, en la medida de lo posible, en combinación con y/o en el contexto de otras realizaciones particulares, y en las enseñanzas actuales en general.
Cuando se haga referencia a un método que comprende dos o más etapas combinadas, las etapas definidas pueden realizarse en cualquier orden o simultáneamente (excepto cuando el contexto excluya esa posibilidad), y el método puede incluir una o más etapas adicionales que se llevan a cabo antes de cualquiera de las etapas definidas, entre dos de las etapas definidas, o después de todas las etapas definidas (excepto donde el contexto excluya esa posibilidad).
Definiciones
La expresión "línea celular", utilizada en referencia a las enseñanzas actuales, significa una población de células que se expandieron a partir de una o unas pocas células predecesoras comunes, por ejemplo, pero sin limitación, una población clonal de células que se expandieron a partir de una sola célula aislada. Una "línea celular establecida" es una línea celular que tiene el potencial de proliferar indefinidamente cuando se le proporciona un medio de cultivo fresco, espacio para crecer y cuando se incuba en condiciones adecuadas. Estas líneas celulares han sufrido cambios in vitro (por ejemplo, pero sin limitación, transformación, cambios cromosómicos o ambos) en comparación con la célula homóloga natural que se encuentra en el organismo. Una línea celular que se obtiene aislando una sola célula de una primera línea celular y luego expandiendo la célula aislada para obtener una multiplicidad de células para obtener una segunda línea celular, a veces se denomina "subclón" de la primera línea celular de la que derivó.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que comprende", que es sinónima de "que incluye" o "caracterizado por", y cognados de cada uno (como comprende e incluye), es inclusiva o abierta, y no excluye componentes, elementos, o etapas de método, es decir, otros componentes, etapas, etc., están opcionalmente presentes. Por ejemplo, pero sin limitación, un artículo que "comprende" los componentes A, B y C puede consistir en (es decir, contener solo) los componentes A, B y C; o el artículo puede contener no solo los componentes A, B y C, sino también uno o más componentes adicionales.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "derivado" significa obtenido de una fuente, directa o indirectamente. Por ejemplo, las células se pueden derivar directamente de un organismo obteniendo un tejido u órgano del organismo y luego desagregando el tejido u órgano para obtener células primarias. Las células se pueden obtener indirectamente de un organismo, por ejemplo, pero sin limitación, obteniendo un aislamiento, típicamente un aislado de una sola célula de una línea celular que se obtuvo del organismo, luego expandiendo el aislamiento para obtener una línea celular que comprende una multiplicidad de células, a veces denominadas subclones.
La expresión "insecto lepidóptero" se refiere a cualquier miembro de un gran orden (lepidópteros) de insectos que comprende mariposas, polillas y saltamontes que, cuando son adultos, tienen cuatro alas anchas o lanceoladas, generalmente cubiertas con diminutas escamas superpuestas y, a menudo, de colores brillantes y que como larvas son orugas. Los insectos lepidópteros ejemplares incluyen, pero sin limitación, Spodoptera frugiperda, Bombyx mori, Heliothis subflexa, y Trichoplusia ni.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "sustancialmente" se refiere a una variación de no más o menos un diez por ciento en relación con el artículo o artículos mencionados. Por ejemplo, pero sin limitación, una línea celular que tiene un diámetro celular promedio que está entre el 90 % y el 110 % del diámetro promedio de las células Sf9, respecto de un tamaño de muestra estadísticamente significativo, cuando la línea celular y las células Sf9 se propagan bajo las mismas condiciones, y el diámetro celular promedio se determina como se describe en la presente memoria; o una línea celular que tiene una densidad celular que está entre el 90 % y el 110 % de la densidad celular de las células Sf9, respecto de un tamaño de muestra estadísticamente significativo, cuando la línea celular y las células Sf9 se propagan en las mismas condiciones, y la densidad celular se determina como se describe en la presente memoria.
Las expresiones "prueba de la presencia de virus", "prueba de la presencia de Sf-rhabdovirus", "prueba de la presencia de Tn-nodavirus", "detección de la presencia o ausencia de virus" y la terminología relacionada se utilizan en un sentido amplio en la presente memoria. Los expertos en la técnica entienden que existen numerosas técnicas de prueba conocidas en la técnica que pueden emplearse en el contexto de las enseñanzas actuales. Los ejemplos de técnicas adecuadas para probar la presencia de virus incluyen la transcripción inversa (RT), RT-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR junto con PCR anidada (por ejemplo, pero sin limitación, las técnicas ejemplares descritas en los Ejemplos 4, 16 y 22), PCR cuantitativa (a veces denominada PCR en tiempo real), varias técnicas de hibridación de sondas, microscopía electrónica y varias técnicas de detección basadas en anticuerpos conocidas en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, un ensayo ELISA que comprende al menos un anticuerpo anti-virus. En el caso de un virus que es lítico o que provoca un efecto citopático observable (CPE) en la célula, las técnicas de prueba ejemplares incluyen, entre otras, ensayo de placas y observación de CPE, que puede comprender el uso de microscopía. Las técnicas bioinformáticas, por ejemplo, pero sin limitación, bases de datos electrónicas de búsqueda BLAST de secuencias de ARN o ADN contenidas en líneas celulares u organismos de interés, también están dentro del alcance de las enseñanzas actuales.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una línea celular establecida caracterizada por la falta de virus puede derivar de un organismo que está infectado con un virus, por ejemplo, pero sin limitación, una línea celular establecida libre de virus derivada de un organismo contaminado con virus. En la presente invención, la línea celular deriva de Spodoptera frugiperda (Sf). También se describen en la presente memoria líneas celulares derivadas de un insecto contaminado con un virus. También se describen en la presente memoria líneas celulares derivadas de insectos en las que el insecto comprende un insecto lepidóptero, por ejemplo, pero sin limitación, Bombyx mori, Heliothis subfloxa o Trichoplusia ni. En ciertas realizaciones, la línea celular deriva de una línea celular de Sf, por ejemplo, pero sin limitación, las líneas celulares Sf9 o Sf-21. También se describen en la presente memoria líneas celulares derivadas de Trichoplusia ni contaminado con un virus o una línea celular de Trichoplusia ni contaminada con un virus, por ejemplo, pero sin limitación, la línea celular TN-368 contaminada con un alfanodavirus.
Como se describe en la presente memoria, una línea celular establecida se caracteriza por tener la misma o sustancialmente la misma densidad celular, tiempo de duplicación, diámetro celular promedio, morfología y patrón de W-glicosilación que las células contaminadas con virus de las que derivó la línea celular, cuando: (1) las líneas celulares libres de virus e infectadas con virus se propagan en las mismas condiciones, (2) la comparación se realiza como se describe en la presente memoria, y (3) las comparaciones se basan en un tamaño de muestra estadísticamente significativo. Como se describe en la presente memoria, las líneas celulares se caracterizan por la producción de más baculovirus recombinantes infecciosos que las células infectadas por virus de las que derivó la línea celular, cuando cada una está infectada con AcP(-)p6.9hEPO o AcP(-)p6.9hSEAP en las mismas condiciones, y la comparación se realiza de acuerdo con el Ejemplo 11. Como se describe en la presente memoria, las líneas celulares de las enseñanzas actuales son susceptibles a la infección por Sf-rhabdovirus.
De acuerdo con ciertos métodos ejemplares para obtener líneas celulares que carecen de virus, se aíslan una o unas pocas células de una población de células que están infectadas con virus, como una línea celular que está contaminada con un virus o células de un tejido u órgano desagregado o de un organismo que está infectado con un virus. La célula o células aisladas se combinan con un medio de cultivo celular apropiado que contiene uno o más compuestos antivirales para formar una primera composición de cultivo. Esta primera composición de cultivo se incuba en condiciones adecuadas para que las células crezcan y se dividan; y durante un período de tiempo suficiente para permitir que uno o más compuestos antivirales afecten a la replicación viral. En ciertas realizaciones del método, se extrae del cultivo una alícuota de las células o del medio de cultivo y se analiza la presencia de virus. Las células que carecen de virus se combinan con medios de cultivo que no contienen un compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo. Esta segunda composición de cultivo se incuba en condiciones que permitan que las células crezcan y se dividan. Las células se expanden para obtener una línea celular que carece del virus que contaminó el organismo o las células de las que se obtuvo la línea celular.
En ciertas realizaciones, los métodos para obtener una línea celular libre de virus comprenden: aislar una sola célula de una población de células de insecto de Spodoptera frugiperda; combinar la célula aislada con medios de cultivo celular que comprenden al menos un compuesto antiviral para formar una primera composición de cultivo; incubar la primera composición de cultivo en condiciones adecuadas para que la célula crezca y se divida, generando así una multiplicidad de células; opcionalmente, retirar una parte de las células o del medio de cultivo celular y analizar la presencia de Sf-rhabdovirus o un nodavirus; combinar al menos parte de la multiplicidad de células de la primera composición de cultivo con medios de cultivo celular sin un compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo; e incubar la segunda composición de cultivo en condiciones adecuadas para que las células crezcan y se dividan, obteniendo así una línea celular caracterizada por la ausencia de virus.
De acuerdo con ciertas realizaciones del método, se obtienen líneas celulares establecidas que carecen de Sfrhabdovirus. Como se describe en la presente memoria, una célula individual o pequeños grupos de células, por ejemplo, entre otros, grupos de 2 células, 3 células, 4 células, 5 células, 10 células o menos, o 20 células o menos (incluido cada número entero entre 1 y 20) se aíslan de una población de células que está infectada con un virus. Los ejemplos no limitantes de técnicas para aislar una sola célula o pequeñas cantidades de células incluyen la clonación mediante dilución limitante (a veces denominada clonación mediante dilución en serie), la clonación de células en agar blando y, posteriormente, la selección de colonias de células, la clasificación de células para aislar cantidades únicas o pequeñas de células, microdisección por captura láser (LCM), uso de micropipetas (por ejemplo, pero sin limitación, capilares ultradelgados) para capturar manualmente cantidades individuales o pequeñas de células, técnicas microfluídicas o uso de micromanipuladores para asistir microscópicamente en la selección de cantidades individuales o pequeñas de células. En ciertas realizaciones, el aislamiento de una sola célula comprende la clonación mediante dilución limitada.
En ciertas realizaciones del método, se combinan células individuales aisladas o pequeños grupos de células con medios de cultivo celular que comprenden al menos un compuesto antiviral para formar una primera composición de cultivo. Los ejemplos de compuestos antivirales incluyen, entre otros, fármacos tales como análogos de nucleósidos, interferón y anticuerpos virales específicos, por ejemplo, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales o policlonales neutralizantes. Los ejemplos no limitantes de análogos de nucleósidos incluyen ribavirina, 6-azauridina, vidarabina, aciclovir, 9-/3-D-arabinofuranosiladenina (Ara-A), citosina arabinosa, adenina arabinósido y Guanina 7-N-óxido (G-7-Ox). En ciertas realizaciones del método, el al menos un compuesto antiviral comprende 6-azauridina. En ciertas realizaciones, el compuesto antiviral se selecciona de ribavirina, 6-azauridina, vidarabina, aciclovir, 9-/3-D-arabinofuranosiladenina (Ara-A), citosina arabinosa, arabinósido de adenina y 7-N-óxido de guanina (G-7-Ox). En ciertas realizaciones, el compuesto antiviral es 6-azauridina. En ciertas realizaciones, el compuesto antiviral comprende ribavirina.
De acuerdo con ciertas realizaciones del método, la primera composición de cultivo se incuba en condiciones adecuadas para el crecimiento celular. De acuerdo con ciertos métodos descritos, las células o el sobrenadante de cultivo celular obtenido de la primera composición de cultivo se analizan para determinar la presencia o ausencia de virus, por ejemplo, pero sin limitación, RT-PCR, PCR anidada o RT-PCR y PCR anidada, seguido del análisis de los amplicones resultantes para determinar la presencia o ausencia de productos de amplificación específicos del virus. En determinadas realizaciones del método, la presencia o ausencia de virus infecciosos se determina mediante: (1) la combinación de (a) células potencialmente infectadas o sobrenadante de cultivo celular en el que se incubaron las células potencialmente infectadas con (b) células que son susceptibles de infección por el virus potencial (c) en un medio de cultivo celular adecuado; (2) incubar este cultivo en condiciones adecuadas para que el virus infecte las células; y (3) monitorizar las células cultivadas o los medios en los que se han cultivado para detectar la presencia de ácido nucleico viral. En ciertas realizaciones, las células o los medios de cultivo se analizan periódicamente para detectar la presencia de virus, por ejemplo, entre otros, mediante el uso de una RT-PCR específica del virus seguida de una PCR anidada, y luego se determina la presencia o ausencia de amplicones específicos.
De acuerdo con ciertas realizaciones, después de que las células aisladas se hayan incubado en la primera composición de cultivo durante un período adecuado para inhibir la replicación viral y se hayan analizado muestras de las células o medios de cultivo correspondientes y se haya determinado que no contienen virus, las células se combinan con medio de cultivo celular que no contiene un compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo. La segunda composición de cultivo se incuba en condiciones adecuadas para el crecimiento celular. En determinadas realizaciones, las células o los medios de cultivo de la segunda composición de cultivo se analizan para determinar la presencia o ausencia de virus.
Los expertos en la técnica apreciarán que las condiciones adecuadas para cultivar un tipo de célula particular se pueden determinar fácilmente a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, pero sin limitación, manuales de cultivo celular, bancos de células comerciales o proveedores de medios de cultivo y/o artículos de plástico. Las condiciones de cultivo celular apropiadas también pueden determinarse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, las líneas celulares derivan de células primarias que están contaminadas con Sf-rhabdovirus. En ciertas realizaciones, las líneas celulares derivan de una línea celular que está infectada con Sf-rhabdovirus. En determinadas realizaciones, la población de células infectadas forma parte de una línea celular infectada. En ciertas realizaciones, la línea celular infectada se obtuvo de un organismo infectado, por ejemplo, pero sin limitación, polillas, orugas u otros insectos que están persistentemente infectados con un virus. En ciertas realizaciones, la línea celular deriva de una línea celular contaminada que deriva de un insecto infectado con virus, por ejemplo, pero sin limitación, líneas celulares de Sf infectadas con Sf-rhabdovirus. También se describen en la presente memoria líneas celulares que son una línea celular de Célula Trichoplusia ni contaminada con Tn-nodavirus, por ejemplo, pero sin limitación, TN-368, BTI-Tn-5B1-4 (también conocido como HIGH FIVE™), o células Tni PRO.
De acuerdo con ciertos métodos descritos, las células o los medios de cultivo celular en los que se cultivaron las células se analizan para determinar la presencia o ausencia de virus. En ciertos métodos, la prueba comprende RT-PCR y PCR anidada; PCR cuantitativa; técnicas de hibridación de sondas; métodos bioinformáticos que incluyen, entre otros, búsqueda BLAST; ensayo de placas, observación de CPE o métodos de detección basados en anticuerpos.
Ciertas realizaciones ejemplares
Ejemplo 1. Cultivo de células de insecto. Las células Sf9, que se sabe que están contaminadas con Sf-rhabdovirus, se mantuvieron de forma rutinaria como cultivos en matraces agitados a 28 °C en medio ESF 921 (Expression Systems, Woodland, CA). Las células TN-368, que se sabe que están contaminadas con Tn-nodavirus, se mantuvieron de forma rutinaria como cultivos adherentes a 28 °C en medio TN-MFH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) y 1 % de Pluronic F-68 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Ejemplo 2. La metodología convencional no es capaz de producir una línea celular de S. frugiperda establecida que carezca de virus. Los esfuerzos iniciales para aislar un derivado libre de Sf-rhabdovirus involucraron el cultivo de poblaciones de células Sf9 policlonales en medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) más varias concentraciones de ribavirina (Oxchem Corporation, Irwindale, CA). Posteriormente, tratamos poblaciones de células Sf9 policlonales con varias concentraciones de tres medicamentos antivirales, ribavirina, 6-azauridina (Alfa Aesar, Ward Hill, MA) y vidarabina (TCI America, Portland, OR). Las células Sf9 se cultivaron con estos tres fármacos durante aproximadamente un mes con pases en serie a medida y las muestras se analizaron de forma rutinaria en busca de contaminación por Sf-rhabdovirus mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 4. Después de aproximadamente un mes de tratamiento con 100 pg/mL de ribavirina, se obtuvo un subclón de Sf9 que no contenía Sf-rhabdovirus detectable mediante RT-PCR (Figura 1A). Este subclón libre de Sfrhabdovirus se transfirió a medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v), pero sin fármacos antivirales, y se volvió a analizar mediante RT-PCR/PCR anidada, como se describe en el Ejemplo 4. Sorprendentemente, cuando estas células se transfirieron a un medio de cultivo que carecía de fármacos antivirales, revirtieron al fenotipo positivo para Sf-rhabdovirus (Figura 1B). Posteriormente, se trataron poblaciones de células Sf9 policlonales con varias concentraciones de una combinación de tres medicamentos antivirales, ribavirina, 6-azauridina y vidarabina. Nuevamente, sorprendió descubrir que las células tratadas con estos tres fármacos durante aproximadamente un mes seguían siendo positivas para Sf-rhabdovirus (FIG. 1C). Por lo tanto, en marcado contraste con el trabajo anterior, en el que las células de vertebrados se curaron de la contaminación rhabdoviral mediante el tratamiento con estos mismos medicamentos antivirales, este enfoque no logró eliminar el Sf-rhabdovirus de las células Sf9.
Ejemplo 3. Método ejemplar para obtener una línea celular Sf establecida caracterizada por la falta de virus. Después de descubrir que los cultivos de células Sf9 policlonales tratados con medicamentos antivirales revertían al fenotipo Sf-rhabdovirus positivo cuando se cultivaban en medios sin medicamentos, se desarrollaron métodos novedosos para obtener líneas celulares libres de virus establecidas derivadas de material de partida contaminado con virus. Esta realización ejemplar comprendió aislar células Sf9 individuales mediante dilución limitante y luego tratar los subclones de células aisladas con fármacos antivirales. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos en medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) más 10 pg/mL de ribavirina (Oxchem Corporation, Irwindale, CA), 6-azauridina (Alfa Aesar, Ward Hill, MA) o vidarabina (TCI America, Portland, OR). Las células se cultivaron durante aproximadamente un mes con amplificación a medida para producir cultivos progresivamente más grandes y, después de alcanzar el nivel de matraz de 25 cm2, las muestras se analizaron para detectar la contaminación por Sf-rhabdovirus mediante PCR, como se describe en el Ejemplo 4. Un clon que carecía de contaminación por Sf-rhabdovirus (FIG. 2B) se transfirió a medios que carecían de fármacos antivirales, designados pase cero de Sf-RVN (P0) y, en P2, se transfirieron a un cultivo en matraz agitado en medio ESF 921 sin suero y posteriormente se mantuvieron en este medio y formato de cultivo.
Ejemplo 4. PCR con transcripción inversa específica de Sf-rhabdovirus (RT-PCR)/PCR anidada. Se recogieron muestras de cultivos de Sf9 y Sf-RVN que contenían 1 x 106 células, y las células se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad. Los sobrenadantes sin células se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm (CELLTREAT Scientific, Shirley, MA) y luego se ultracentrifugaron a 131.000 x g durante 22 h a 4 °C. El ARN total se extrajo tanto de los sedimentos con células a baja velocidad como de los sedimentos sin células a alta velocidad utilizando el reactivo RNASo/y (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA), según el protocolo del fabricante. Luego, los ARN se cuantificaron y se usaron como moldes para la síntesis de ADNc con el kit de síntesis de ADNc ProtoScript II First Strand (New England Biolabs, Ipswich, MA) y un cebador específico de Sf-rhabdovirus denominado 320-SP1 (SEQ ID NO: 9), según el protocolo del fabricante. Se usaron cantidades equivalentes de cada preparación de ADNc para las PCR con Taq ADN polimerasa, tampón de reacción ThermoPol (New England Biolabs) y cebadores específicos de Sfrhabdovirus Mono-1 (SEQ ID NO: 1 ) y Mono-2 (SEQ ID NO: 2). Las mezclas de reacción se incubaron a 94 °C durante 3 min, se ciclaron 35 veces a 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, y finalmente se incubaron a 72 °C durante 10 min. A continuación, se usó un pL de cada PCR primaria (RT-PCR) como molde para las PCR secundarias (RT-PCR/PCR anidada) en las mismas condiciones, excepto que los cebadores fueron cebadores anidados específicos de Sf-rhabdovirus Mono-1i (SEQ ID N°: 7) y Mono-2i (SEQ ID N°: 8). La RT-PCR y la RT-PCR seguida de los productos de la PCR anidada se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa con tinción con bromuro de etidio de acuerdo con la metodología estándar. La secuencia de cada cebador utilizado para estos ensayos se muestra en la Tabla 1.
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Ejemplo 5. El subclón de Sf ejemplar "Sf-RVN" carece de Sf-rhabdovirus. Se aisló el ARN total de extractos de células Sf-RVN a varios niveles de pases y se analizó la presencia de Sf-rhabdovirus mediante RT-PCR/PCR anidada, como se describe en el Ejemplo 4. Se observó un fuerte producto de amplificación del tamaño esperado cuando se usó el ARN total de células Sf9 como control positivo para este ensayo, como se esperaba (Figuras 3A, 3B y 3C). Por el contrario, no se observaron productos cuando se usó ARN totales aislados de células Sf-RVN cada cinco pases durante el transcurso de 60 (FIG. 3A) o 120 (FIG. 3B) pases secuenciales en ausencia de cualquier medicamento antiviral en el laboratorio. Tampoco se observaron productos de amplificación en controles negativos con ARN total aislado de células S2R+ de D. melanogaster, que no soportan la replicación de Sf-rhabdovirus. Se observaron fuertes productos de amplificación de los tamaños esperados cuando se usaron otros dos pares de cebadores específicos de Sf-rhabdovirus (Mono-3 (SEQ ID N2: 3)/Mono-4 (SEQ ID N2: 4) y Mono-5 (SEQ ID N2: 4) N.2: 5)/Mono-6 (SEQ ID N2: 6); véase la Tabla 1), que derivaron de otras regiones de la secuencia codificante de la proteína L del Sf-rhabdovirus, para RT-PCR con ARN total aislado de células Sf9, pero no de células Sf-RVN (datos no mostrados). Finalmente, observamos un fuerte producto de amplificación del tamaño esperado en ensayos de RT-PCR/PCR anidada con ARN total aislado de sedimentos obtenidos mediante ultracentrifugación de medios sin células Sf9, pero no medios sin células Sf-RVN, cuando se analizaron después de 60 pases (FIG. 3C). Juntos, estos resultados demostraron que no había ARN detectable de Sf-rhabdovirus en las células Sf-RVN o en los medios sin células en el transcurso de 120 pases en ausencia de medicamentos antivirales, lo que indica que estas células están libres de Sf-rhabdovirus.
Ejemplo 6. Detección de micoplasmas. También se analizaron muestras que contenían alrededor de 105 células Sf-RVN o Sf9 en busca de micoplasmas utilizando el kit Universal Mycoplasma Detection de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), según el protocolo del fabricante. Este ensayo basado en PCR utiliza cebadores complementarios a las secuencias conservadas en los genes de rARN 16S de más de 60 especies diferentes de micoplasmas, acoleplasmas, espiroplasmas y ureaplasmas, incluidas ocho especies que se encuentran con frecuencia como contaminantes de cultivos celulares. Los resultados mostrados en la FIG. 4 demostraron que ni las células Sf9 ni las Sf-RVN estaban contaminadas de forma detectable con micoplasmas. La ausencia de un producto de PCR no se debió a la inhibición de la reacción de PCR por los lisados de células de insecto, ya que se observaron amplicones de los tamaños esperados en las PCR realizadas usando lisados enriquecidos con los moldes de control (FIG. 4).
Ejemplo 7. Propiedades de crecimiento, morfologías y diámetros celulares. Se sembraron células Sf-RVN o Sf9 a una densidad inicial de 1,0 x 106 células/mL en cultivos en matraces de agitación de 50 mL, se extrajeron muestras por triplicado cada 24 h durante 4 días y se midieron las densidades y tamaños de las células viables usando un contador de células automatizado COUNTESS® (ThermoFisher Scientific, Inc.). Los tiempos de duplicación se calcularon utilizando la fórmula: Td = T x Log2/Log(Q2/Q1) donde Td = tiempo de duplicación, T = tiempo (h) transcurrido desde el último pase, Q1 = densidad de siembra de células y Q2 = recuento de células viables. Las morfologías celulares se documentaron mediante la recopilación de imágenes de contraste de fases con un aumento de 10X utilizando un microscopio Olympus FSX-100 y el software de imágenes FSX-BSW (Olympus Life Sciences Solutions, Center Valley, Pensilvania).
Para comparar varias propiedades generales de las células Sf-RVN con las de Sf9, se evaluaron sus densidades de cultivo, diámetros, tiempos de duplicación, morfologías y viabilidades en respuesta a la infección por baculovirus. Los resultados mostraron que las células Sf-RVN y Sf9 alcanzaron densidades medias prácticamente idénticas en el transcurso de cuatro días después de sembrarse en cultivos paralelos en matraces con agitación en medio ESF-921 (FIG. 5A). Este marco de tiempo abarcó los 2-3 días de crecimiento que normalmente se permiten entre los pases en serie durante el mantenimiento rutinario de líneas celulares de insectos. Los resultados tampoco revelaron diferencias significativas en los diámetros promedio (FIG. 5B), los tiempos de duplicación (FIG. 5C) o las morfologías (FIG. 5D) de las células Sf-RVN y Sf9 durante el curso de estos experimentos de cultivo celular. Finalmente, no encontramos diferencias significativas en las viabilidades de las células Sf-RVN y Sf9 en respuesta a la infección por baculovirus, que fueron indistinguibles durante 4 días después de la infección a multiplicidades de 0,1 (FIG. 6A) o 5 (FIG. 6B) ufc/célula. El marco de tiempo y dos MOI diferentes usados en este experimento abarcaron las condiciones típicamente usadas para producir reservas de trabajo de baculovirus o proteínas recombinantes a MOI bajos o altos, respectivamente. En general, los resultados de estos experimentos demostraron que las propiedades generales de las células Sf-RVN y Sf9 examinadas en este estudio son indistinguibles.
Ejemplo 8. Vectores de expresión de baculovirus. Se produjo un vector de expresión de baculovirus denominado BacPAK6-AChi/Cath que codificaba p-galactosidasa (p-gal) de E. coli en dos etapas secuenciales. En la primera etapa, el ADN viral de BacPAK6 se recombinó con un plásmido que codificaba p-glucuronidasa de E. coli bajo el control del promotor p6.9 de baculovirus. En este plásmido, se insertó el gen p6.9-p-glucuronidasa en lugar de los genes AcMNPV chiA y v-cath y se incrustó dentro de secuencias flanqueantes de AcMNPV de tipo natural. El recombinante deseado se identificó provisionalmente por su fenotipo de placas azules en presencia de X-GlcA (RPI Corp., Mount Prospect, IL). El sitio de recombinación se confirmó mediante PCR con cebadores específicos para el gen de la p-glucuronidasa y 5'UTR del gen AcMNPV gp64, que eran internos y externos al plásmido de transferencia, respectivamente. Este virus se amplificó y el ADN viral se aisló y digirió con I-sceI para eliminar todo el casete de expresión de p-glucuronidasa. En la segunda etapa, las células Sf9 se transfectaron con el ADN viral digerido con I-sceI. La progenie resultante se resolvió mediante un ensayo de placas en presencia de X-GlcA y se identificó el baculovirus recombinante final, BacPAK6-AChi/Cath, por su fenotipo de placas blancas.
Los vectores de expresión de baculovirus recombinantes denominados AcP(-)p6.9hSEAP y AcP(-)p6.9hEPO codificaron formas marcadas con 8X HIS de fosfatasa alcalina secretada humana (hSEAP) y eritropoyetina humana (hEPO), respectivamente, bajo el control de promotores AcMNPV p6.9 y péptidos señal de prepromellitina de abeja. Los genes sintéticos que codifican SEAP y EPO maduros (Genbank NP_001623.3, aminoácidos 23-511 y Genbank NP_000790.2, aminoácidos 28-193, respectivamente) con sitios de escisión de proteasa TEV N-terminales (ENLYFQG) se diseñaron utilizando OPTIMIZER (Puigbo et al., 2007) para coincidir con el uso del codón AcMNPV (http://www.kazusa.or.jp). Estas secuencias se sintetizaron, se clonaron y se secuenciaron mediante Genscript (Piscataway, N.J.), y se usaron clones sin errores para producir vectores de expresión de baculovirus recombinantes mediante recombinación in vitro con Ac6.9GT, como se describió anteriormente (Toth et al., 2011).
Se usaron métodos estándar para purificar en placas, amplificar y titular los vectores de expresión de baculovirus recombinantes en células Sf9. Además, para este estudio se produjeron reservas libres de Sf-rhabdovirus y Tnnodavirus. En primer lugar, las células Sf9 se infectaron con disoluciones madre de trabajo de cada vector de baculovirus y, a continuación, se aisló el ADN baculoviral utilizando un método estándar. Este método incluye tratamientos con proteinasa K, SDS y RNasaA, seguidos de extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación de ADN con isopropanol, que se esperaba que eliminara los Sf-rhabdovirus y Tn-nodavirus. Las preparaciones de ADN baculoviral resultantes se usaron luego para transfectar células Sf-RVN y la progenie se purificó en placas, se amplificó y se tituló, excepto que se usaron Sf-RVN como huéspedes para la purificación y amplificación de las placas, en lugar de células Sf9. Durante este proceso, analizamos los extractos de células Sf-RVN transfectadas con ADN baculoviral e infectadas con baculovirus, así como los sedimentos obtenidos mediante ultracentrifugación de muestras de las reservas de virus de trabajo finales, para determinar la presencia o ausencia de Sf-rhabdovirus y Tnnodavirus usando los ensayos de RT-PCR/PCR anidada descritos en el Ejemplo 4. No se detectaron secuencias de Sf-rhabdovirus o Tn-nodavirus.
Ejemplo 9. Expresión de proteína recombinante. Se sembraron células Sf-RVN o Sf9 en medios de cultivo ESF 921 en placas de seis pocillos a densidades de 1 x 106 células/pocillo. A continuación, las células se infectaron de forma simulada con medio ESF 921 o se infectaron con reservas libres de Sf-rhabdovirus de BacPAK6-AChi/Cath, AcP(-)p6.9hSEAP o AcP(-)p6.9hEPO a multiplicidades de infección (MOI) de 0,1 o 5 unidades formadoras de placas (ufp)/célula. En varios momentos posteriores a la infección, se recogieron las células infectadas, se midieron las densidades celulares y se sedimentaron las células mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, las células y los medios libres de células se procesaron de varias formas, según la naturaleza de la proteína modelo que se expresaba y el propósito del experimento, como se describe a continuación. En cada caso, sin embargo, los niveles de proteína recombinante en extractos celulares y/o medios sin células se midieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE; (Laemmli, 1970)) e inmunotransferencia (Towbin et al., 1979) con anticuerpos primarios específicos de proteína o etiqueta y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, como se especifica a continuación. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando una reacción de color basada en fosfatasa alcalina estándar y las intensidades relativas se estimaron escaneando y cuantificando las bandas usando el programa informático Image J versión 1.48 (Institutos Nacionales de Salud de e E. UU.).
Para p-gal, se usaron sedimentos de células infectadas para preparar extractos citoplásmicos para ensayos de actividad enzimática, usando un método conocido. La inmunotransferencia se realizó usando anti-p-gal de conejo (EMD Millipore Corporation, Alemania) y IgG anti-conejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como sondas primaria y secundaria, respectivamente.
Para hSEAP, se prepararon medios libres de células infectadas para ensayos de actividad enzimática, y se realizó la inmunotransferencia usando anti-penta-His de ratón (ThermoFisher) e IgG de conejo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) como sondas primaria y secundaria, respectivamente.
Para hEPO, se prepararon medios libres de células infectadas para la inmunotransferencia con anti-hEPO de conejo (U-CyTech, Utrecht, Países Bajos) e IgG anti-conejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) como sondas primaria y secundaria, respectivamente.
Se compararon los niveles de producción de proteína recombinante mediada por baculovirus respaldada por células Sf-RVN y Sf9, usando p-gal de E. coli , una proteína intracelular bacteriana modelo; hSEAP, una glicoproteína secretada humana modelo; y hEPO, una glicoproteína secretada humana modelo de importancia biotecnológica. Es importante enfatizar que se prepararon y usaron para estos estudios, como se describió anteriormente, reservas de trabajo libres de Sf-rhabdovirus de cada uno de los baculovirus recombinantes.
Los experimentos de expresión de p-gal de E. coli mostraron que no había diferencias significativas en los niveles de actividad enzimática intracelular producidos por las células Sf-RVN y Sf9 durante 4 días de infección con el baculovirus recombinante (Figura 7A). Los resultados de inmunotransferencia representativos, mostrados en la FIG. 7B, indicaron que Sf-RVN produjo ligeramente más proteína p-gal intracelular total. Una réplica biológica independiente en la que se tiñó el gel con azul brillante de Coomassie produjo el mismo resultado, pero como en los resultados que se muestran en las FIGS. 7A-7C, el aumento de los niveles de p-gal intracelular producida por las células Sf-RVN fue menor (datos no mostrados). Finalmente, se observó que los niveles de actividad enzimática y p-gal intracelular inmunorreactiva producida por las células Sf-RVN y Sf9 fueron más bajos en los 4 días posteriores a la infección, en comparación con los puntos de tiempo anteriores, lo que podría reflejar la citotoxicidad inducida por baculovirus en este momento muy tardío de la infección.
El análisis de la producción y secreción de hSEAP durante 4 días de infección arrojó esencialmente los mismos resultados. En este caso, ampliamos el experimento para incluir infecciones de MOI bajas (0,1 ufp/célula; FIG. 8A, 8B y 8C) y altas (5 ufp/célula; FIG. 8D, 8E y 8F) porque algunos investigadores han informado de una mayor productividad con infecciones de MOI bajas, en lugar de infecciones convencionales de alta MOI en el BICS. Los resultados de estos experimentos mostraron que no había diferencias estadísticamente significativas en los niveles de actividad de hSEAP producidos por las células Sf-RVN y Sf9 infectadas con MOI bajos (FIG. 8A) o altos (FIG. 8D). Los resultados de inmunotransferencia representativos indicaron que Sf9 produjo un poco más de hSEAP cuando se infectó con una MOI baja (FIGS. 8B y 8C) y Sf-RVN produjo un poco más de hSEAP cuando se infectó con una MOI alta (FIGS. 8E y 8F). Sin embargo, estas fueron solo diferencias menores, que no fueron completamente reproducibles en una réplica biológica independiente de este experimento (datos no mostrados). Tanto las células Sf-RVN como las Sf9 produjeron más actividad de hSEAP y proteína extracelular inmunorreactiva en 1 día y aproximadamente 3 veces más actividad de hSEAP a los 4 días después de la infección cuando se infectaron con una MOI alta. También se observó que no hubo diferencias en las viabilidades de las células Sf-RVN y Sf9 durante 4 días de infección a cualquiera de las MOI, como se muestra en las FIGS. 6A-6B, lo que derivó de los datos obtenidos como parte de los experimentos de expresión y secreción de hSEAP descritos en la presente memoria.
Finalmente, se obtuvieron los mismos resultados generales al comparar los niveles de producción y secreción de hEPO por las células Sf-RVN y Sf9. Como no existe un ensayo funcional simple para este producto, el análisis se limitó a comparar los niveles de hEPO inmunorreactiva secretada en el medio extracelular por los dos tipos de células diferentes durante una infección de 4 días. Los resultados de dos réplicas biológicas independientes de este experimento no revelaron diferencias importantes reproducibles en los niveles de hEPO secretada producida por células Sf-RVN y Sf9 (Figuras 9A y 9B).
En conjunto, estos resultados demostraron que las células Sf-RVN y Sf9 producen y secretan tres proteínas recombinantes diferentes a niveles casi idénticos.
Ejemplo 10. Análisis de W-glicanos. Se infectaron cultivos en matraces de agitación de cincuenta ml de células Sf-RVN y Sf9 con reservas libres de Sf-rhabdovirus de AcP(-)p6.9hEPO, y se purificó hEPO por afinidad a partir de los sobrenadantes libres de células y virus usando una resina Ni-NTA (ThermoFisher). Los W-glicanos se liberaron enzimáticamente de las preparaciones de hEPO purificada mediante digestión con PNGasa-F (New England Biolabs), y los W-glicanos liberados se purificaron, se derivatizaron y se analizaron mediante MALDI-TOF-MS según métodos conocidos. Las estructuras se asignaron a los picos en función de las masas predichas y del conocimiento de los Wglucanos producidos en las células Sf, anotados usando las representaciones simbólicas de viñetas estándar, y se numeraron para simplificar. La cuantificación relativa de las diferentes estructuras se logró dividiendo las intensidades máximas combinadas de grupos isotópicos de estructuras de W-glicanos permetilados individuales por la intensidad total de todos los picos de W-glucano anotados.
Otro factor importante a evaluar al comparar las células Sf-RVN y Sf9 son sus patrones de W-glicosilación de proteínas, ya que los patrones proporcionados por las diferentes líneas celulares pueden ser drásticamente diferentes. Por lo tanto, se infectaron células Sf9 y Sf-RVN con AcP(-)p6.9hEPO, se purificó la hEPO secretada de los medios libres de células, se liberaron enzimáticamente los W-glicanos totales y se analizaron los productos permetilados mediante MALDI-TOF MS. Los resultados mostraron que la gran mayoría de los los W-glucanos unidos a la hEPO producida por ambas líneas celulares tenían estructuras centrales de trimanosilo (estructuras 2 y 3 de la FIG. 10A), como se esperaba. También observamos pequeñas proporciones de estructuras de tipo híbrido con un residuo de N-acetilglucosamina terminal (estructuras 4 y 5 en la FIG. 10A), como se esperaba. Al cuantificar estas diferentes estructuras, determinamos que los perfiles de W-glicosilación de hEPO proporcionados por las células Sf-RVN y Sf9 fueron casi idénticos, aunque el producto celular Sf-RVN tuvo un poco más de W-glicanos fucosilados (Figura 10B).
Ejemplo 11. Las células Sf-RVN producen más progenie de baculovirus infecciosos. Además de su utilidad como anfitriones para la producción de proteínas recombinantes, las células Sf9 se consideran ampliamente entre los mejores anfitriones para la producción de reservas de baculovirus. Por lo tanto, tuvo interés comparar las cantidades de la progenie del vector baculoviral recombinante infeccioso producido por las células Sf9 y Sf-RVN. Este experimento implicó infectar ambos tipos de células con dos reservas diferentes de baculovirus libres de Sf-rhabdovirus, AcP(-)p6.9hEPO y AcP(-)p6.9hSEAP, recolectando la progenie viral germinada, es decir, medios de cultivo celular que comprenden baculovirus recombinantes infecciosos, de las cuatro infecciones, y comparando los títulos virales infecciosos en ensayos de placas, como se describe en el Ejemplo 8. Los resultados de tres réplicas biológicas independientes mostraron que las reservas de trabajo de ambos baculovirus, AcP(-)p6.9hEPO y AcP(-)p6.9hSEAP, tenían títulos aproximadamente 5-10 veces más altos cuando se producían mediante Sf-RVN, en comparación con los producidos por células Sf9 (Figura 11).
Ejemplo 12. Búsquedas BLAST. Las búsquedas bioinformáticas del genoma y el transcriptoma de las células Sf se realizaron utilizando la interfaz BLASTN del NCBI de acceso público (blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). El ensamblaje de la secuencia transcrita de la línea celular Sf-21 (número de acceso de Genbank GCTM00000000.1, BioProjectID 271593 (Kakumani et al., Biol. Direct 10, 1-7, 2015) y el ensamblaje de la secuencia transcrita del gusano cogollero Spodoptera frugiperda (número de acceso de Genbank GESP00000000.1, BioProjectlD 318819 (Cinel et al.)) se consultaron con el genoma publicado de Sf-rhabdovirus (número de acceso de Genbank NC_025382.1) utilizando megaBLAST con la configuración predeterminada.
Los resultados obtenidos de una búsqueda de megaBLAST utilizando el genoma de Sf-rhabdovirus publicado (número de acceso de Genbank NC_025382.1) como consulta frente al ensamblaje de la secuencia transcrita de la línea celular IPLB-SF-21 (número de acceso de Genbank GCTM00000000.1, BioProjectlD 271593 (Kakumani et al., Biol. Direct 10, 1-7, 2015) se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
Estos resultados indican que el transcriptoma de la línea celular Sf-21 incluye el genoma del Sf-rhabdovirus ensamblado e intacto. Dado que se demostró previamente que la línea celular Sf-21 estaba persistentemente infectada con Sf-rhabdovirus, se esperaba este resultado.
Los resultados obtenidos de una búsqueda de megaBLAST utilizando el genoma de Sf-rhabdovirus publicado (número de acceso de Genbank NC_025382.1) como consulta frente a los perfiles de expresión génica de cerebro completo ensamblados de machos adultos post-emergencia de Spodoptera frugiperda (gusano cogollero), obtenidos del BioProyecto PRJNA318819 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (Cinel et al.) se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Sorprendentemente, se detectaron varias secuencias ensambladas en el transcriptoma de estos organismos, que colectivamente comprenden un genoma intacto de Sf-rhabdovirus. Estos datos muestran que la oruga (Spodoptera frugiperda), de la que derivan todas las líneas celulares de Sf, está infectada con Sf-rhabdovirus. Por lo tanto, la razón por la cual todas las líneas celulares derivadas de Spodoptera frugiperda están contaminadas con Sf-rhabdovirus es que el organismo se infectó naturalmente con este virus en el medio ambiente antes de que se aislara la primera línea de células Sf, no porque la(s) línea(s) celular(es) se contaminara(n) con el virus en el laboratorio.
En marcado contraste, una búsqueda BLAST del transcriptoma de Sf-RVN con la secuencia de Sf-rhabdovirus como consulta no produjo coincidencias, lo que confirma aún más el hallazgo de que las células Sf-RVN no están contaminadas con Sf-rhabdovirus. Los resultados de la búsqueda BLAST se resumen en la Tabla 4. Dado que todas las líneas celulares de Sf analizadas anteriormente por el laboratorio y otras demostraron ser positivas para la contaminación por Sf-rhabdovirus, la ausencia de secuencias de Sf-rhabdovirus en el transcriptoma de la línea celular Sf-RVN demuestra claramente que estas células son estructuralmente (genéticamente) diferentes de cualquier otra línea celular Sf y de Spodoptera frugiperda, el organismo natural del que derivan todas las líneas celulares Sf descritas anteriormente. Esta diferencia estructural se sustenta por el hecho de que las células Sf-RVN son susceptibles a la infección por Sf-rhabdovirus.
Tabla 4. Resultados de la búsqueda BLAST para Sf-rhabdovirus
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 13. La línea celular Sf-RVN es susceptible de infección por Sf-rhabdovirus. Las células Sf9 se sembraron a una densidad inicial de 1,0 x 106 células por ml en medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) en un cultivo en matraz agitado de 50 ml. Las células se incubaron a 28 °C en una incubadora con agitación durante 3 días. Después de la incubación, las células se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad y los sobrenadantes libres de células se filtraron a través de un filtro de 0,22 pM (CELLTREAT Scientific, Shirley, MA). Este filtrado se usó como inóculo de Sf-rhabdovirus para examinar la susceptibilidad de las células Sf-RVN a este virus.
Para el experimento de infectividad, se sembraron células Sf-RVN por duplicado a una densidad de 2,0 x 106 células en 5 mL de medio ESF921 (Expression Systems, Woodland, CA) en matraces de 25 cm2 y se incubaron durante 1 h a 28 °C para permitir que las células se adhirieran. A continuación, se eliminó el medio de cultivo y las células en matraces repetidos: (1) se infectaron de forma simulada con 2,5 ml de medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) o (2) se infectaron con 2,5 ml del inóculo de Sf-rhabdovirus descrito anteriormente. Las células se incubaron durante 2 h a 28 °C y luego se añadieron 2,5 ml de medio TNM-FH fresco suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) y las células se incubaron durante otras 24 h a 28 °C. A las 24 h después de la infección, se lavó tres veces un conjunto de células infectadas con inóculo de rhabdovirus simulado o Sf y se recogió. El segundo conjunto se incubó adicionalmente a 28 °C, se tomaron muestras y se realizaron pases en serie (P0 a P1) 72 h tras la infección, y luego se tomaron muestras y se hicieron pases en serie nuevamente después de dos períodos de incubación adicionales de 72 h hasta que se realizaron un total de tres pases. Las muestras obtenidas en cada nivel de pase se usaron para producir sedimentos celulares mediante centrifugación a baja velocidad, se extrajo el ARN total y las muestras se analizaron mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 4.
No se observó un amplicón específico de Sf-rhabdovirus con el ARN obtenido de células Sf-RVN infectadas de forma simulada en ningún momento o con el ARN obtenido de células Sf-RVN de P0 infectadas con inóculo de Sf-rhabdovirus a las 24 o 72 h después de la infección (Figuras 13A-13B). Sin embargo, se observó un tenue amplicón con el ARN obtenido de las células Sf-RVN infectadas con el inóculo de Sf-rhabdovirus a las 72 h después de P1 y su intensidad aumentó progresivamente con el ARN obtenido a las 72 h después de P2 y a las 72 h después de P3 (FIG. 13A-13B). Estos resultados demuestran claramente que las células Sf-RVN son susceptibles a la infección con el Sf-rhabdovirus producido por las células Sf contaminadas.
Ejemplo 14. Los métodos convencionales no logran producir una línea celular de T. ni establecida libre de virus. También se intentó aislar células libres de Tn-nodavirus mediante el cultivo de poblaciones de células TN-368 policlonales en medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) más varias concentraciones de un cóctel de fármacos antivirales que incluyen ribavirina, 6- azauridina y vidarabina. Las células se cultivaron con estos tres fármacos durante 15 días con pases en serie a medida, y las muestras se analizaron de forma rutinaria en busca de Tn-nodavirus mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 16. Como se muestra en las FIGS. 13A-13B, los amplicones correspondientes a los segmentos 1 y 2 de Tn-nodavirus estaban presentes en las células TN-368 que habían sido incubadas a todas las concentraciones del cóctel antiviral ensayado (FIGS. 13A y 13B, respectivamente). Por lo tanto, al igual que con las células Sf9, no se pudo obtener células de T ni libres de nodavirus utilizando poblaciones de células TN-368 tratadas con este cóctel antiviral.
Ejemplo 15. Método ejemplar para obtener una línea celular establecida de T. ni que carece de virus. Después de descubrir que los cultivos de células TN-368 policlonales tratados con cócteles de fármacos antivirales seguían siendo positivos para Tn-nodavirus, se empleó un método descrito para obtener una línea celular libre de virus. Esta realización de método ejemplar comprendía el aislar células TN-368 individuales limitando la dilución para aislar células individuales, sembrar las células aisladas en placas de 96 pocillos en medio TNM-FH suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) y 200 pg/ml de ribavirina para formar una primera composición de cultivo. La primera composición de cultivo se cultivó durante aproximadamente un mes con amplificación a medida para producir cultivos progresivamente más grandes y, después de alcanzar el nivel del matraz de 25 cm2, las muestras se analizaron para detectar Tn-nodavirus mediante RT-PCR, seguida de PCR anidada, como se describe en el Ejemplo 16. Se transfirió un clon que carecía de Tn-nodavirus (FIG. 14A, carril CL#3) a medios que carecían de fármacos antivirales para formar una segunda composición de cultivo. El clon, denominado pasaje cero (P0) de Tn-NVN, se adaptó a medio ESF 921 sin suero y se cultivó en suspensión. La línea celular Tn-NVN se mantuvo posteriormente en esta segunda composición de cultivo y formato de crecimiento.
Ejemplo 16. PCR de transcripción inversa específica de Tn-nodavirus (RT-PCR)/PCR anidada. Se recogieron muestras de cultivos de TN-368 y Tn-NVN que contenían 1 x 106 células, y las células se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad. Los sobrenadantes sin células se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm (CELLTREAT Scientific, Shirley, MA) y luego se ultracentrifugaron a 131.000 x g durante 22 h a 4 °C. El ARN total se extrajo tanto de los sedimentos de células de baja velocidad como de los sedimentos sin células de alta velocidad utilizando el reactivo ARNSo/y (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA), según el protocolo del fabricante. Luego, los ARN se cuantificaron y se usaron como moldes para la síntesis de ADNc con el kit de síntesis de ADNc ProtoScript II First Strand (New England Biolabs, Ipswich, MA) y un cebador específico de Tn-nodavirus denominado Noda-7 (SEQ ID N°: 24), según el protocolo del fabricante. Se usaron cantidades equivalentes de cada preparación de ADNc para las PCR anidadas con Taq ADN polimerasa, tampón de reacción ThermoPol (New England Biolabs) y pares de cebadores específicos del segmento 1 (Noda-1; SEQ ID N°: 19 y Noda-2; SEQ ID N°: 20) o segmento 2 (Noda-6; SEQ ID N°: 23 y Noda-7; SEQ ID N°: 24) de ARN de Tn-nodavirus . Las mezclas de reacción se incubaron a 94 °C durante 3 min, se ciclaron 35 veces a 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, y finalmente se incubaron a 72 °C durante 10 min. A continuación, se usó un pL de cada PCR primaria como molde para las PCR anidadas en las mismas condiciones con los pares de cebadores específicos del segmento 1 (Noda-1i; SEQ ID N°: 21 y Noda-2i; SEQ ID N°: 22) o segmento 2 (Noda-6i; SEQ ID N°: 25 y Noda-7i; SEQ ID N°: 26) de ARN de Tn-nodavirus. Los productos de la RT-PCR y la RT-PCR seguida de PCR anidada se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa con tinción con bromuro de etidio de acuerdo con la metodología estándar. La secuencia de cada cebador utilizado para estos ensayos se muestra en la Tabla 5.
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Ejemplo 17. Las células T n-NVN no tienen T n-nodavirus detectables. Se aisló el ARN total de T n-NVN a varios niveles de pase y se analizó la presencia de Tn-nodavirus mediante RT-PCR, seguido de PCR anidada con cebadores específicos para el segmento 1 (FIG. 15A) o 2 (FIG. 15B) de Tn-nodavirus, como se describe en el Ejemplo 16. Los resultados de la RT-PCR/PCR anidada específica de Tn-nodavirus demostraron que las células Tn-NVN no tuvieron Tn-nodavirus detectables durante al menos 55 pases en serie en ausencia de cualquier fármaco antiviral (FIGS. 15A-15C). También se aisló el ARN total de la fracción del sedimento obtenido por ultracentrifugación de los medios libres de células (CFM) de las células Tn-NVN en el pase 55 y se usó para analizar Tn-nodavirus usando la RT-PCR/PCR anidada específica de Tn-nodavirus, como se describe en el Ejemplo 16. Como se muestra en la FIG. 15C, se observó un amplicón de Tn-nodavirus en los carriles correspondientes al ARN aislado de células TN-368 y del sedimento de medio libre de células TN-368. Por el contrario, el amplicón de Tn-nodavirus no se detectó en el ARN aislado del sedimento de medio libre de células Tn-NVN. Todos los resultados mostrados en las FIGS. 15A-15C se obtuvieron usando ARN de células cultivadas en ausencia de fármacos antivirales. Juntos, estos resultados demostraron que no había ARN detectable de Tn-nodavirus en células Tn-NVN o medios sin células en el transcurso de 55 pases en ausencia de medicamentos antivirales, lo que indica que estas células están libres de Tn-nodavirus.
Ejemplo 18. Detección de micoplasmas. También se analizaron muestras que contenían alrededor de 105 células Tn-NVN o TN-368 en busca de micoplasmas utilizando el kit Universal Mycoplasma Detection de ATCC (Manassas, VA), según el protocolo del fabricante. Este ensayo basado en PCR utiliza cebadores complementarios a las secuencias conservadas en los genes 16S ARNr de más de 60 especies diferentes de micoplasmas, acoleplasmas, espiroplasmas y ureaplasmas, incluidas ocho especies que se encuentran con frecuencia como contaminantes de cultivos celulares. Los resultados mostrados en la FIG. 16 demostraron que ni las células TN-368 ni las Tn-NVN estaban contaminadas de forma detectable con micoplasmas. En ambos casos, la ausencia de un producto de PCR no se debió a la inhibición de la reacción de PCR por parte de los lisados de células de insecto, ya que se observaron amplicones de los tamaños esperados en las PCR realizadas usando lisados enriquecidos con los moldes de control (FIG. 16, carriles Tn -NVN (+) y TN-368 (+)).
Ejemplo 19. Propiedades de crecimiento celular, morfología y diámetro de las células Tn-NVN y TN-368. Se compararon las propiedades generales de las células Tn-NVN con las de TN-368, incluidas sus densidades de cultivo, diámetros y morfologías utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 7. Los resultados mostraron que las células Tn-NVN y TN-368 lograron densidades promedio prácticamente idénticas en el transcurso de cinco días después de haber sido sembradas en cultivos de matraces de agitación paralelos en medio ESF-921 (FIG. 17A). Los resultados tampoco revelaron diferencias significativas en los diámetros promedio (FIG. 17B) o las morfologías (FIG. 17C) de las células Tn-NVN y TN-368 durante el curso de estos experimentos de cultivo celular. En general, estos resultados demostraron que las propiedades generales de las células Tn-NVN y TN-368 examinadas en este estudio son las mismas o sustancialmente las mismas.
Ejemplo 20. Las células Tn-NVN y TN-368 producen proteínas recombinantes a niveles casi idénticos. También comparamos los niveles de producción de proteína recombinante mediada por baculovirus mantenida por células Tn-NVN y TN-368, usando p-gal, hSEAP y hEPO, como se describe en el Ejemplo 9. Es importante enfatizar que se prepararon reservas de trabajo libres de Tn-nodavirus de cada uno de los baculovirus recombinantes y se usaron para estos estudios, como se describe en el Ejemplo 8.
Los experimentos de expresión de p-gal en E. coli no revelaron diferencias significativas en los niveles de actividad de la enzima intracelular (FIG. 18A) o la proteína p-gal intracelular total (FIGS. 18B y 18C) producida por las células Tn-NVN y TN-368 durante el transcurso de 4 días de infección. Nuevamente, notamos que los niveles de actividad enzimática y de p-gal intracelular inmunorreactiva disminuyeron a los 3-4 días posteriores a la infección, en comparación con los puntos de tiempo anteriores, lo que quizás refleja la citotoxicidad inducida por baculovirus en estos tiempos posteriores de infección.
El análisis de la producción y secreción de hSEAP durante el transcurso de 4 días de infección arrojó esencialmente los mismos resultados, y no reveló diferencias estadísticamente significativas en los niveles de actividad de hSEAP o proteína hSEAP inmunorreactiva secretada producida por las células Tn-NVN y TN-368 (FIGS. 19A-19C).
Finalmente, obtuvimos los mismos resultados generales cuando comparamos los niveles de producción y secreción de hEPO por las células Tn-NVN y TN-368 durante una infección de 4 días (Figuras 20A-20B). Estos resultados demostraron que las células Tn-NVN y TN-368 producen y secretan tres proteínas recombinantes diferentes al mismo o sustancialmente al mismo nivel.
Ejemplo 21. Análisis de W-glicano de células T n-NVN y TN-368. Se analizaron los perfiles de W-glicosilación de células Tn-NVN y TN-368, como se describe en el ejemplo 10. El análisis MALDI-TOF-MS de los W-glicanos aislados de hEPO producidos por células Tn-NVN y TN-368 demostró que proporcionaban patrones de glicosilación esencialmente idénticos. La gran mayoría de los W-glicanos en hEPO de ambas líneas celulares fueron estructuras con un núcleo de bimanosilo FIG. 21A, estructura 1), pero también se observaron pequeñas proporciones de estructuras con núcleos de trimanosilo fucosilado con y sin residuos de W-acetilglucosamina terminal (Figura 21A, estructuras 3 y 6).
Ejemplo 22. La línea celular BmN, derivada de Bombyx mori, está infectada con Sf-rhabdovirus. Para investigar si las células del insecto lepidóptero Bombyx Mori están contaminadas, analizamos la línea celular BmN para detectar la presencia de Sf-rhabdovirus. Se descongeló un vial de células BmN (ATCC-CRL 8910) del banco de células del laboratorio, se sedimentaron las células mediante centrifugación a baja velocidad y se extrajeron, cuantificaron y analizaron los ARN totales mediante RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 4. Las RT-PCR se realizaron esencialmente como se describe, excepto que en este caso se realizaron RT-PCR independientes con cebadores específicos para los seis genes de Sf-rhabdovirus (Tabla 6).
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Como se observa en la FIG. 22, se observaron amplicones correspondientes a los seis genes de Sf-rhabdovirus (N, P, M, G, X y L). Estos resultados demostraron que la línea celular BmN, que deriva del insecto lepidóptero Bombyx mori, un pariente cercano de S. Frugiperda, también está infectada con Sf-rhabdovirus.
En conjunto, los resultados sugieren que muchas líneas celulares establecidas pueden estar infectadas con un virus. Esto puede deberse a una infección viral persistente de los organismos de los que derivan estas líneas celulares. Nuestros resultados también demuestran que los métodos divulgados para obtener líneas establecidas son ampliamente aplicables.
La reciente oleada de aprobaciones de agencias reguladoras para el uso de productos biológicos derivados de BICS en pacientes humanos y veterinarios es un hito de importancia crítica en el surgimiento de BICS como una auténtica plataforma de fabricación de productos biológicos comerciales. Sin embargo, el descubrimiento de contaminantes virales infecciosos en las líneas celulares de insectos que se utilizan con mayor frecuencia como hospedadores de vectores de baculovirus, incluidas las células S fy Tn, plantea dudas sobre la seguridad de los productos biológicos producidos por BICS. En este contexto, es importante enfatizar que no hay evidencia de que Sf-rhabdovirus o Tnnodavirus representen una amenaza clara para los pacientes humanos o veterinarios. No obstante, la respuesta clara a la identificación de cualquier agente adventicio en cualquier plataforma de fabricación biológica es eliminar el agente para crear un sistema inherentemente más seguro. Por lo tanto, se ha inventado Sf-RVN y Tn-NVN, que no están contaminados con Sf-rhabdovirus o Tn-nodavirus, respectivamente. De hecho, ambas líneas celulares carecen de cualquier rastro detectable de cualquiera de estos contaminantes virales recientemente identificados.
Esta conclusión se basa en los resultados de ensayos altamente sensibles de RT-PCR/PCR anidada, que se usaron para demostrar que las células Sf-RVN y los medios libres de células no tenían ARN de Sf-rhabdovirus detectable y las células Tn-NVN y los medios libres de células no tenían ARN de Tn-nodavirus detectable en el transcurso de al menos 55 pases en el laboratorio. Está fuertemente respaldado por la duración de los regímenes de prueba de RT-PCR/PCR anidada específicos de Sf-rhabdovirus y T n-nodavirus, que aún están en curso y, en este momento, no han revelado rastros de Sf-rhabdovirus en Sf-RVN o Tn-nodavirus en células Tn-NVN en el transcurso de 170 y 100 pases en serie, respectivamente. Si estas células tuvieran un bajo nivel de contaminación Sf-rhabdoviral o Tn-nodaviral, sería esperable que estos virus se replicasen bastante rápido a niveles detectables, particularmente considerando el alto nivel de contaminación informado (2 X 109 partículas/mL de medio de crecimiento extracelular) en cultivos de células Sf. Además, se han confirmado y ampliado los resultados de Sf-RVN mediante análisis bioinformáticos de datos genómicas y transcriptómicas disponibles públicamente en células Sf-21 (Geisler y Jarvis, 2016), así como bases de datos genómicas y transcriptómicas originales obtenidas mediante secuenciación paralela masiva de las células Sf-RVN (Tabla 2).
Otra conclusión de las enseñanzas actuales es que las propiedades esenciales de las células Sf-RVN y Tn-NVN, en el contexto de su potencial como huéspedes alternativos para BICS, son muy similares a las de las células Sf9 y TN-368, respectivamente, que se usaron como huéspedes "de referencia" para BICS debido a su uso generalizado en este campo. Se descubrió que ni las células Sf-RVN ni las células Tn-NVN están contaminadas de manera detectable con micoplasmas. También se descubrió que las propiedades básicas de crecimiento de las células Sf-RVN y Sf9 y Tn-NVN y TN-368, respectivamente, examinadas dentro de los parámetros de los protocolos estándar de mantenimiento de cultivos celulares, fueron indistinguibles.
Otra conclusión de las enseñanzas actuales es que las células Sf-RVN y Tn-NVN pueden funcionar al menos tan bien como sus homólogos contaminados con virus como componentes huésped del BICS. Esta conclusión fue respaldada por el hallazgo de que las células Sf-RVN y Sf9 y Tn-NVN y TN-368, respectivamente, respaldaron niveles aproximadamente iguales de producción, secreción y actividad enzimática de proteínas y glicoproteínas recombinantes. Formalmente, esta conclusión solo puede aplicarse a los tres productos diferentes utilizados como modelos en la presente memoria. Aunque se usó una proteína bacteriana intracelular y dos W-glucoproteínas humanas secretadas en un esfuerzo por ampliar el análisis, es posible que las células Sf-RVN y/o Tn-NVN produzcan niveles más altos o más bajos de otras proteínas recombinantes en el futuro. También se descubrió que las células Sf-RVN y Sf9 y T n-NVN y TN-368, respectivamente, proporcionaron patrones de W-glicosilación casi idénticos. La conclusión de que las células Sf-RVN y Sf9 y Tn-NVN y TN-368 proporcionaron patrones de W-glicosilación casi idénticos se aplican formalmente solo a hEPO, que fue el modelo utilizado para el análisis. Sin embargo, en comparación con la variación potencial en los niveles de producción de proteínas recombinantes, es mucho menos probable que Sf-RVN y Sf9 y Tn-NVN y TN-368 W-glicosilen diferencialmente otros productos, porque los resultados analíticos obtenidos con un producto dado reflejan capacidades de procesamiento de W-glicanos endógenas. Si existieran, las diferencias en el grado de procesamiento de W-glicanos se habrían detectado en el análisis de glicosilación de hEPO por las diferentes líneas celulares.
Otra capacidad funcional importante de las células Sf-RVN y Sf9 examinadas en la presente memoria fue su capacidad de producir una progenie de baculovirus recombinantes infecciosos. Sorprendentemente, se descubrió que las células Sf-RVN produjeron niveles más altos de progenie infecciosa (en algunos casos de cinco a diez veces más) cuando se usaron para propagar dos baculovirus recombinantes diferentes, en comparación con las células Sf9 (FIG. 11). Esta diferencia fue estadísticamente significativa y demuestra una clara ventaja de las células Sf-RVN sobre las células Sf9.
Aunque las enseñanzas descritas se han descrito con referencia a varias aplicaciones, métodos y composiciones, se apreciará que se pueden realizar varios cambios y modificaciones sin apartarse de las enseñanzas de la presente memoria. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar mejor las presentes enseñanzas y no pretenden limitar el alcance de las enseñanzas de la presente memoria. Además, los expertos en la técnica pueden realizar

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método para obtener una línea celular de Spodoptera frugiperda libre de Sf-rhabdovirus, que comprende:
aislar una célula de un organismo Spodoptera frugiperda contaminado con Sf-rhabdovirus o de una línea celular de Spodoptera frugiperda contaminada con Sf-rhabdovirus;
combinar la célula aislada con un medio de cultivo celular que comprende un compuesto antiviral para formar una primera composición de cultivo;
incubar la primera composición de cultivo en condiciones adecuadas para que la célula crezca y se divida, generando así una multiplicidad de células;
retirar una porción de la multiplicidad de células o del medio de cultivo celular y analizar la presencia o ausencia de un virus;
combinar al menos parte de la multiplicidad de células con medios de cultivo celular sin un compuesto antiviral para formar una segunda composición de cultivo; y
incubar la segunda composición de cultivo en condiciones adecuadas para que las células crezcan y se dividan, obteniendo así una línea celular libre de virus.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la línea celular contaminada con virus comprende células Sf-21 o células Sf9.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el análisis comprende (a) RT-PCR, (b) RT-PCR y PCR anidada; (c) RT-PCR cuantitativa; o (d) una técnica de detección basada en anticuerpos.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto antiviral es un análogo de nucleósido, opcionalmente en el que el análogo de nucleósido comprende al menos una de: ribavirina, 6-azauridina, vidarabina, aciclovir, 9-/3-D-arabinofuranosiladenina (Ara-A), citosina arabinosa, arabinósido de adenina y 7-N-óxido de guanina (G-7-Ox), opcionalmente
donde el análogo de nucleósido es 6-azauridina.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el aislamiento comprende dilución limitante; donde el compuesto antiviral es 6-azauridina; y en el que el análisis comprende: (a) RT-PCR o (b) RT-PCR y PCR anidada.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2926225A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Takeda Vaccines, Inc. Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines
IL296189A (en) 2015-11-01 2022-11-01 Glycobac Llc Virus-free cell lines and methods for obtaining them
CN108531442B (zh) * 2018-04-28 2021-10-01 青岛农业大学 一种无血清悬浮培养的昆虫细胞系及其应用
CN110423726B (zh) * 2019-04-19 2024-04-19 长春卓谊生物股份有限公司 无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用
CN110241089A (zh) * 2019-05-07 2019-09-17 江苏南农高科技股份有限公司 一种全悬浮细胞培养生产猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的方法
CN112063754A (zh) * 2020-08-31 2020-12-11 广东华南疫苗股份有限公司 一种Sf弹状病毒的荧光定量PCR检测引物及试剂盒
CN112980767B (zh) * 2021-02-08 2023-09-26 东莞博盛生物科技有限公司 一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系及其应用
WO2022207899A1 (en) * 2021-04-02 2022-10-06 Uniqure Biopharma B.V. Methods for producing single insect cell clones
CN115466710A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种获得无病毒细胞系的方法及其所获得的无病毒细胞系
CN115466711A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种获得无病毒细胞系的方法及其所获得的无病毒细胞系
CN116731953A (zh) * 2022-03-01 2023-09-12 成都威斯克生物医药有限公司 弹状病毒阴性草地贪夜蛾昆虫细胞株及其筛选、鉴定和应用
CN114807009A (zh) * 2022-03-28 2022-07-29 成都纳微金生物技术有限公司 一种不依赖血清的无弹状病毒污染的sf9细胞株、筛选方法及应用
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
CN117568493B (zh) * 2024-01-16 2024-04-12 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6114108A (en) 1995-08-29 2000-09-05 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for the selective modification of viral nucleic acids
US6635679B2 (en) 2001-05-14 2003-10-21 Akzo Nobel N.V. Methods and compositions for inactivating viruses
CN100410383C (zh) * 2004-05-11 2008-08-13 中国农业科学院生物技术研究所 一种昆虫杆状病毒生物反应器的制备方法
CN100404667C (zh) * 2005-09-27 2008-07-23 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 一种高产杆状病毒的甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞系
EP2166843A4 (en) 2007-06-01 2010-08-11 Univ Princeton TREATMENT OF VIRUS INFECTIONS BY MODULATION OF HOST CELL METABOLISMS
GB201011502D0 (en) 2010-07-08 2010-08-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CA2926225A1 (en) * 2013-10-03 2015-04-09 Takeda Vaccines, Inc. Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines
WO2016154338A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Cell lines that are free of viral infection and methods for their production
CN114617959A (zh) 2015-09-03 2022-06-14 诺瓦瓦克斯股份有限公司 具有改进的稳定性和免疫原性的疫苗组合物
IL296189A (en) 2015-11-01 2022-11-01 Glycobac Llc Virus-free cell lines and methods for obtaining them
US20170354729A1 (en) 2016-03-16 2017-12-14 Novavax, Inc. Vaccine compositions containing modified zika virus antigens

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