KR20180091824A - 바이러스 비함유 세포주 및 이를 획득하기 위한 방법 - Google Patents

바이러스 비함유 세포주 및 이를 획득하기 위한 방법 Download PDF

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KR20180091824A
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아제이 마그호디아
크리스토프 가이슬러
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글리코백, 엘엘씨
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Abstract

본 발명의 교시내용은 유기체 또는 세포주와 같은 바이러스-오염된 시작 물질로부터 유래된 신규한 바이러스 비함유 세포주에 관한 것이다. 바이러스-오염된 시작 물질로부터 획득된 바이러스 비함유 세포주를 획득하기 위한 방법이 또한 제공된다. 예시적인 바이러스 비함유 세포주는 Sf-랍도바이러스로 오염된 스포돕테라 프루기페르다 세포주로부터 유래된 신규한 세포주(여기서, 신규한 세포주는 Sf-랍도바이러스가 결핍됨); 및 알파노다바이러스로 오염된 트리코플루시아 니 세포주로부터 유래된 신규한 세포주(여기서, 신규한 세포주는 알파노다바이러스가 결핍됨)를 포함한다.

Description

바이러스 비함유 세포주 및 이를 획득하기 위한 방법
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2015년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/249,288호의 이익을 주장한다.
미 연방 후원의 연구에 관한 진술
본 연구는 국립 보건원 보조금 NIH R43 GM102982 및 NIH R43 AI112118 하의 정부 지원으로 부분적으로 수행되었다. 미국 정부는 청구된 발명에 대해 특정 권리를 가질 수 있다.
분야
본 발명의 교시는 일반적으로 오염 바이러스 비함유 연속 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 기술은 또한 바이러스로 오염된 세포 또는 유기체로부터 유래된 바이러스 비함유 세포주를 획득하기 위한 방법에 관한 것이다.
시험관 내에서 증식된 세포는 일차 세포 또는 확립된 세포주로 또한 언급되는 연속 세포주로 광범위하게 분류될 수 있다. 일차 세포는 유기체로부터 기관 또는 조직을 분리시키고, 이를 분해하여 개별적 세포의 혼합물을 생성시킴으로써 획득될 수 있다. 일차 세포가 배양으로 증식되는 경우, 이들은 노화로 공지된 유전적으로 결정된 사건인 증식하는 능력 상실 전에 제한된 횟수로만 분열한다. 그러나, 일부 세포는 형질전환으로 언급되는 과정을 겪고, 무기한으로 분열하는 능력을 획득한다. 이들 세포는 형질전환 세포 또는 연속 세포로 언급된다. 자연 발생 세포가 유래되는 조직 또는 기관에서 발견되는 자연 발생 세포와 비교하여, 연속 세포주는 통상적으로 이수배수체 또는 이상배수성과 같은 유전적 이상을 가지며, 일차 세포에서 흔히 관찰되는 접촉 억제 및 부착 의존성을 결여한다.
수년에 걸쳐, 생물생산에 사용된 배양된 세포가 바이러스로 오염된 것이 반복적으로 발견되었다. 예를 들어, 1960년대 초, 일차 레서스(Rhesus) 원숭이 신장(RMK) 세포에서 생성된 아데노바이러스 백신 및 폴리오바이러스 백신이 원숭이 바이러스 40(SV40)으로 오염된 것이 발견되었다. 이후, SV40이 햄스터에서 종양을 발생시키고, SV40에 대한 항체가 일차 RMK 세포에서 생성된 비활성화된 폴리오바이러스 백신을 투여받은 사람에게서 검출된 것으로 나타났다. 1970년대에는, 여러 많은 홍역, 이하선염, 풍진, 및 폴리오 생 백신이 박테리오파지로 공지된 박테리아 바이러스로 오염된 것이 발견되었다. 조류 백혈구증 바이러스(ALV) 및 내인성 조류 바이러스(AEV)가 닭 배아 섬유모세포에서 생성된 황열병, 홍역, 및 이하선염에 대한 약독화 백신에서 발견되었다. 백신-관련 ALV 및 AEV에 대한 공급원은 닭 유전체에 통합된 내인성 레트로바이러스인 것으로 생각되었다. 더욱 최근에, 여러 많은 로타바이러스 백신이 감염성 돼지 써코바이러스-1(PCV-1)으로 오염된 것으로 밝혀졌다.
1980년대 초기에 동료 심사를 거친 문헌에 처음 기재된 이후로, 배큘로바이러스-곤충 세포 시스템(BICS)은 널리 인식되고, 많이 이용되는 재조합 단백질 생성 플랫폼이 되었다. BICS의 장점은 이의 유연성, 속도, 단순성, 진핵생물 단백질 처리 능력, 및 다중-서브유닛 단백질 복합체를 생성시키는 능력을 포함한다. 거의 30년 동안, BICS는 주로 학술 및 산업 실험실에서 기초 연구를 위한 재조합 단백질을 생성시키는데 사용되었다. 그러나, 더욱 최근에, BICS는 진정한 상업적 제조 플랫폼으로 부상하였으며, 이는 이제 인간 의학(CERVARIX®, PROVENGE®, GLYBERA® 및 FLUBLOK®) 또는 수의학(PORCILIS® PESTI, BAYOVAC CSF E2®, CIRCUMVENT® PCV, INGELVAC CIRCOFLEX® 및 PORCILIS® PCV)에서 사용하기 위해 허가된 여러 생물제제를 생성시키는데 사용된다. 또한, BICS는 인간 임상 시험의 다양한 단계에서 노로바이러스, 파보바이러스, 에볼라 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 및 E형 간염 바이러스 백신 후보를 포함하는 여러 다른 생물제제를 생성시키는데 사용된다.
BICS에서 숙주로 가장 일반적으로 사용되는 곤충 세포주는 양배추은무늬밤나방유충(cabbage looper)인 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(Tn), 또는 가을 거염벌레(fall armyworm)인 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf)로부터 유래되며, BICS로 제조되는 대부분의 생물제제는 후자를 이용하여 생성된다. Sf-21로도 공지된 IPLB-SF-21로 명명된 본래의 Sf 세포주는 1977년에 번데기 난소로부터 유래되었다. 다른 일반적으로 사용되는 Sf 세포주는 Sf9(IPLB-SF-21의 서브클론), 및 EXPRESSF+®로도 공지된 Sf900+ 및 Super 9을 포함하는 이의 딸(daughter) 서브클론을 포함한다. TN-368로 명명된 본래의 Tn 세포주는 1970년에 Hink에 의해 보고된 바와 같이 새로이 출현한 버진(virgin) 암컷 나방으로부터 분리된 난소 조직으로부터 유래되었다. 다른 일반적으로 사용되는 Tn 세포주는 BTI-Tn-5B1-4(HIGH FIVE™으로 상업화됨) 및 Tni PRO 세포를 포함한다.
2007년에 일본 및 뉴질랜드의 과학자 그룹은 BTI-Tn-5B1-4 세포가 "Tn-노다바이러스"로 본원에 명명된 새로운 노다바이러스로 오염된 것을 발견하였다(Li et al., J. Virol. 81:10890-96). 본 발명자는 본 발명자가 TN-368, BTI-Tn-5B1-4, 및 Tni PRO를 포함하는 모든 본 발명자의 실험실 Tn 세포주가 상기 바이러스로 오염된 것을 발견하였을 때 상기 발견을 확인하고 확장시켰다. 이후, 2014년에, 미국 FDA의 생물학 평가 연구 센터(Center for Biologics Research and Evaluation, CBER)의 과학자들은 2개의 평판이 좋은 상업적 공급처로부터 획득된 Sf-21 및 Sf9 세포를 포함하는 시험된 모든 Sf 세포주가 Sf-랍도바이러스로 현재 공지된 랍도바이러스로 오염된 것을 발견하였다(Ma et al., J. Virol. 88: 6576-85, 2014). Takeda Vaccines, Inc.의 연구 그룹은 노로바이러스 백신 후보를 생성시키는데 사용된 Sf9 세포에서 Sf-랍도바이러스의 존재를 독립적으로 확인하였다(Takeda Vaccines, Inc., U.S. Patent Application Publication No. US 2016/0244487; PCT/US14/59060). 또한, 본 발명자는 다양한 공급처에서 획득된 Sf-21, Sf9, 및 EXPRESSF+ ®을 포함하는 본 발명자의 실험실 Sf 세포주 모두가 상기 바이러스로 오염된 것을 발견하였다.
바이러스 오염이 없는 세포주 및 바이러스 감염된 세포주 또는 지속적으로 감염되거나 내인성 바이러스를 함유하는 유기체로부터 획득되는 바이러스 비함유 세포주를 생성시키기 위한 방법이 필요하다.
본 발명의 교시내용은 바이러스-오염된 세포 또는 유기체로부터 유래된 확립된 세포주에 관한 것으로, 세포주는 관련 세포 기능을 유지하면서 바이러스의 결핍을 특징으로 한다. 상기 확립된 세포주는 인간 및 수의 사용을 위한 백신, 재조합 단백질 및 생물제제의 생성에 사용되는 생물학적 플랫폼, 예를 들어, BICS의 성분으로 특히 유용하다. 본 발명의 교시내용은 또한 바이러스로 오염된 세포 또는, 비제한적인 예로, 지속적인 감염 또는 내인성 바이러스로 인해 바이러스로 오염된 유기체로부터 바이러스-비함유의 확립된 세포주를 획득하기 위한 방법에 관한 것이다.
일 예시적 구현예에 따르면, 확립된 곤충 세포주는 가을 거염벌레(fall armyworm), 스포돕테라 프루기페르다로부터 직접적 또는 간접적으로 획득된다. 이러한 세포주는 Sf9 세포주가 유래되는 가을 거염벌레 및 Sf9 세포와 달리 Sf-랍도바이러스의 결핍을 특징으로 한다. Sf9 세포주와 비교하는 경우, 이러한 예시적인 확립된 세포주의 세포는 배양시에 동일하거나 매우 유사한 세포 밀도로 성장하고, 동일하거나 매우 유사한 세포 직경(크기)를 갖고, 동일하거나 매우 유사한 배가 시간(성장 속도)을 갖고, 유사한 N-당화 패턴을 생성시킨다. 이러한 신규한 확립된 세포주의 세포는 이들이 AcP(-)p6.9hEPO 또는 AcP(-)p6.9hSEAP를 갖는 더욱 감염성의 재조합 배큘로바이러스 입자를 생성하고, Sf-랍도바이러스로 오염되지 않는다는 점에서 Sf9 세포와 기능적으로 상이하다. 이러한 신규한 확립된 세포주는 Sf9 세포가 유래되는 스포돕테라 프루기페르다 및 Sf-21 세포와 구조적(유전적)으로 상이함을 추가 특징으로 한다.
특정 세포주 구현예에 따르면, 바이러스의 결핍을 특징으로 하는 예시적인 확립된 세포주는 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 세포주는 바이러스-오염된 트리코플루시아 니 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 트리코플루시아 니 세포주는 TN-368 세포주이다. 특정 구현예에서, 바이러스는 알파노다바이러스이다. 특정 구현예에 따르면, 세포주는 세포주 및 TN-368 세포가 동일 조건하에서 증식되는 경우 TN-368 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포 밀도, 평균 세포 직경, 형태, 및 N-당화 패턴을 추가 특징으로 한다.
또 다른 예시적인 확립된 세포주 구현예에 따르면, 곤충 세포주는 양배추은무늬밤나방유충(트리코플루시아 니)으로부터 직접적 또는 간접적으로 획득된다. 이러한 세포주는 트리코플루시아 니로부터 유래된 TN-368 세포와 달리 노다바이러스의 결핍을 특징으로 한다. TN-368 세포주와 비교하는 경우, 이러한 예시적인 확립된 세포주의 세포는 배양시에 동일하거나 매우 유사한 세포 밀도로 성장하고, 동일하거나 매우 유사한 세포 직경(크기)을 갖고, 유사한 N-당화 패턴을 생성한다.
바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 유래된 바이러스 비함유 세포주를 획득하기 위한 예시적 방법에 따르면 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 세포를 분리시키는 단계; 분리된 세포와 항바이러스 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 조합하여 제1 배양 조성물을 형성시키는 단계; 세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제1 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 다수의 세포를 생성시키는 단계; 다수의 세포 또는 세포 배양 배지의 일부를 분리하고, 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험하는 단계; 다수의 세포의 적어도 일부와 항바이러스 화합물이 없는 세포 배양 배지를 조합하여, 제2 배양 조성물을 형성시키는 단계; 및 세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제2 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 바이러스 비함유 세포주를 획득하는 단계를 포함한다.
특정한 예시적 방법에 따르면, 확립된 세포주는 바이러스 감염된 일차 세포, 바이러스 오염된 세포주, 또는 오염된 유기체로부터의 단일 세포 또는 적은 수의 세포를 분리시킴으로써 획득된다. 분리된 세포(들)는 항바이러스 화합물을 함유하는 세포 배양 배지와 조합되어 제1 배양 조성물이 형성된다. 제1 배양 조성물은 세포가 성장하고 분열하도록 하는 조건하에서 인큐베이션됨으로써 다수의 세포가 생성된다. 배양 배지는 주기적으로 항바이러스 화합물을 함유하는 신선한 배양 배지로 대체된다. 제1 배양 조성물로부터 획득된 적은 수의 세포 또는 제1 배양 배지로부터 획득된 배양 배지의 부피가 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험된다. 바이러스 핵산이 검출되지 않는 경우, 제1 배양 조성물로부터의 세포의 적어도 일부가 항바이러스 화합물이 없는 배양 배지와 조합되어 제2 배양 조성물이 형성된다. 제2 배양 조성물은 세포가 성장하고 분열하도록 하는 조건하에서 인큐베이션되고, 배양 배지는 주기적으로 신선한 배양 배지로 대체된다. 특정 구현예에서, 세포가 계속 성장함에 따라, 세포의 수는 증가하고, 세포가 주기적으로 분할되는 경우(계대배양으로도 공지됨)를 포함하여 세포는 하나의 성장 용기로부터 다수의 용기로 확장된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 성장 용기로부터의 세포 또는 배양 배지의 샘플이 바이러스의 존재에 대한 지표인 바이러스 핵산의 존재 또는 부재에 대해 시험된다. 세포의 수가 충분한 양에 도달되면, 세포의 분취액은 동결될 수 있거나, 공지된 방법을 이용하여 저장될 수 있다.
본 발명의 교시내용의 이들 및 다른 특징 및 장점은 하기 설명, 첨부된 청구항, 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다. 당업자는 하기에 기재되는 도면이 단지 예시 목적을 위한 것으로, 개시된 교시내용의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다.
도 1a-1c: 항바이러스 약물로 처리된 폴리클로날 Sf9 세포에서의 Sf-랍도바이러스. 폴리클로날 Sf9 세포 집단은 다양한 농도의 리바비린(도 1a 및 1b) 또는 리바비린, 6-아자우리딘, 및 비다라빈(도 1c)로 약 1개월 동안 처리된 후, 실시예 4에 기재된 바와 같이 전체 RNA가 추출되고, RT-PCR에 의해 Sf-랍도바이러스에 대해 시험되었다. 도 1a 및 1c에 제시된 결과는 여전히 항바이러스 약물의 존재하에서 배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득된 반면, 도 1b에 제시된 결과는 리바비린으로 처리되었으나, 이후 실시예 2에 기재된 바와 같이 항바이러스 약물의 부재하에서 12회 계대배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득되었다. Sf9 세포 또는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) S2R+ 세포(도 1a-1c, 2a-2b, 3a-3c에서 "S2")로부터 추출된 전체 RNA가 양성 및 음성 대조군으로 각각 사용되었다. 주형이 없는 추가의 음성 대조군 반응(H2O)이 수행되었다. "M"으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내며, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 2a-2b: 분리된 항바이러스 약물-처리된 Sf9 세포 서브클론에서의 Sf-랍도바이러스. 단일 Sf9 세포 서브클론이 제한 희석에 의해 분리되고, 다양한 항바이러스 약물을 이용하여 약 1개월 동안 처리된 후, 실시예 4에 기재된 바와 같이 전체 RNA가 개별적 클론으로부터 추출되고, RT-PCR(도 2a) 또는 RT-PCR, 및 이후 네스티드 PCR(도 2b)에 의해 Sf-랍도바이러스 RNA에 대해 시험되었다. 도 2a-2b에 제시된 모든 결과는 여전히 항바이러스 약물의 존재하에서 배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득되었다. 양성 및 음성 대조군 및 100-bp 마커는 도 1a-1c의 간단한 설명에 기재된 바와 같다.
도 3a-3c: Sf-RVN 세포에서의 Sf-랍도바이러스의 부재. 전체 RNA가 다양한 계대배양 수준에서 "Sf-RVN"으로 언급되는 예시적 세포주로부터 분리되고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 Sf-랍도바이러스-특이적 RT-PCR, 및 이후 네스티드 PCR을 이용하여 Sf-랍도바이러스의 존재에 대해 검정되었다. 이러한 예시적 세포주는 도 2b에서 Sf-랍도바이러스 오염에 대해 음성인 것으로 밝혀진 6-아자우리딘-처리된 Sf9 서브클론을 확장시킴으로써 생성되었다. Sf-랍도바이러스-특이적 RT-PCR/네스티드 PCR 결과는 Sf-랍도바이러스가 Sf-RVN 세포의 60회 계대배양 및 120회 계대배양의 과정에 걸쳐 존재하지 않은 것을 입증하였다(각각 도 3a 및 3b). 본 발명자는 또한 계대배양 60회에서 Sf-RVN 세포로부터 세포 비함유 배지(CFM)를 초원심분리함으로써 획득된 펠렛 분획으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 이러한 CFM 펠렛으로부터의 전체 RNA가 Sf-랍도바이러스-특이적 RT-PCR/네스티드 PCR을 이용하여 Sf-랍도바이러스에 대해 검정되었다. 도 3c에 제시된 바와 같이, Sf-랍도바이러스 앰플리콘이 Sf9 세포로부터 분리된 RNA 및 Sf9 세포 비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에 해당하는 레인(각각 도 3c의 레인 Sf9 및 Sf9 CFM)에서 관찰되었다. 대조적으로, Sf-랍도바이러스 앰플리콘이 Sf-RVN 세포-비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에서 검출되지 않았다(도 3c, 레인 Sf-RVN CFM). 도 3a-3c에 제시된 모든 결과는 항바이러스 약물의 부재하에서 배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득되었다. Sf9 세포 및 Sf9 CFM을 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛으로부터 추출된 RNA가 양성 대조군으로 사용되었고; S2R+ 세포(S2)로부터 추출된 RNA가 음성 대조군으로 사용되었다. 주형이 없는 추가 음성 대조군 반응(H2O)이 수행되었고, M으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내고, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 4: 미코플라스마 검정. Sf-RVN 및 Sf9 세포 추출물(-)이 실시예 6에 기재된 바와 같이 PCR-기반 Universal Mycoplasma Detection Kit(American Type Culture Collection)를 이용하여 미코플라스마 오염에 대해 검정되었다. M. 아르기니니(M. arginini) rRNA 표적 서열을 인코딩하는 플라스미드가 양성 대조군으로 사용되었다(도 4, 레인 "M. 아르기니니"). 용해질이 검정을 방해하는지의 여부를 결정하기 위해 상기 플라스미드로 스파이킹(spiking)된 Sf-RVN 및 Sf9 세포 용해질(도 4, 각각 Sf-RVN (+) 및 Sf9 (+)로 표시된 레인)을 이용하여 추가 대조군이 수행되었다. 주형이 없는 음성 대조군 반응이 수행되었다(도 4, 레인 H2O). M으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내며, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 5a-5d: 스포돕테라 세포 성장 및 형태. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 ESF 921 배지 중 1.0 x 106 세포/mL의 밀도로 진탕 플라스크에 시딩되었다. 삼중 샘플이 시딩 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 7에 기재된 바와 같이 자동화 세포 계수기로 살아 있는 세포수 및 직경이 측정되었다. 도면은 3개의 독립적 실험에서 측정된 평균의 살아 있는 세포 밀도(도 5a), 직경(도 5b), 및 배가 시간(도 5c), 뿐만 아니라 10X 배율에서의 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 위상 대조 현미경사진(도 5d)을 제시한다. 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05).
도 6a-6b: 배큘로바이러스 감염 후의 세포 생활력. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 0.1 pfu/세포(도 6a) 또는 5 pfu/세포(도 6b)의 MOI로 AcP(-)p6.9hSEAP의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 삼중 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 생활력이 실시예 7에 기재된 바와 같이 자동화 세포 계수기를 이용하여 측정되었다. 플롯은 2개의 독립적 실험에서 측정된 평균 생활력 백분율을 제시한다. 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05).
도 7a-7c: 재조합 β-gal 생성. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 5 pfu/세포의 MOI로 BacPAK6-ΔChi/Cath의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 삼중 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 정화된 세포내 추출물이 β-gal 활성에 대해 검정되었다(도 7a). 이러한 플롯은 평균 결과를 제시하며, 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05). 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 스캐닝 레이저 밀도측정(도 7c)과 함께 면역블로팅 분석(도 7b)에 의해 전체 세포내 β-gal 생성 수준을 측정하기 위해 1세트의 추출물이 또한 사용되었다. 본 실험의 2개의 독립적인 생물학적 복제물에서 동일한 일반적인 경향이 관찰되었다.
도 8a-8f: 재조합 hSEAP 생성. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 0.1 pfu/세포(도 8a, 8b, 및 8c) 또는 5 pfu/세포(도 8d, 8e 및 8f)의 MOI로 AcP(-)p6.9hSEAP의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 삼중 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 세포-비함유 배지가 제조되고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 hSEAP 활성에 대해 검정되고, 평균 결과가 플로팅되었고, 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05; 도 8a 및 8d). 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 스캐닝 레이저 밀도측정(도 8c 및 8f)과 함께 면역블로팅 분석(도 8b 및 8e)에 의해 전체 세포외 hSEAP 생성 수준을 측정하기 위해 1세트의 세포-비함유 배지가 또한 사용되었다.
도 9a-9b: 재조합 hEPO 생성. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 5 pfu/세포의 MOI로 AcP(-)p6.9hEPO의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 세포-비함유 배지가 제조되고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 스캐닝 레이저 밀도측정(도 9b)과 함께 면역블로팅 분석(도 9a)에 의해 전체 세포외 hEPO 생성 수준에 대해 검정되었다.
도 10a-10b: N-당화 프로파일. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 3 pfu/세포의 MOI로 AcP(-)p6.9hEPO의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되고, hEPO-His가 실시예 10에 기재된 바와 같이 세포 비함유 배지로부터 친화성 정제되었다. N-글리칸은 효소적으로 방출되고, 회수되고, 과메틸화되고, 공지된 방법에 따라 MALDI-TOF MS(도 10a)에 의해 분석되고, [M + Na]+로 검출된 분자 이온이 구조 지정되고, 표준 만화 기호 표현을 이용하여 주석이 달리고, 단순성에 대해 넘버링되고, 전체 백분율로 제시되었다(도 10b).
도 11: 재조합 배큘로바이러스 생성. Sf-RVN 및 Sf9 세포가 AcP(-)p6.9hSEAP 또는 AcP(-)p6.9hEPO의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 생성된 프로제니가 수거되고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 플라크 검정에 의해 적정되었다. 생성된 역가가 3개의 독립적 실험에서 획득된 평균 바이러스 역가로 플로팅되었고, 오차 막대는 '*' (P<0.05) 또는 '**' (P<0.001)로 도시된 신뢰 구간을 나타낸다.
도 12: Sf-RVN 세포의 Sf-랍도바이러스 감염. Sf-RVN 세포는 실시예 13에 기재된 바와 같이 모의 감염되거나 Sf9 세포로부터 유래된 세포 비함유 배지로 감염된 후, 실시예 4에 기재된 바와 같이 전체 RNA가 추출되고, RT-PCR에 의해 Sf-랍도바이러스에 대해 검정되었다. 표시된 레인: M은 염기쌍 마커를 함유하고; Sf9은 Sf9 세포 RNA로부터 증폭된 물질을 함유하고; 모의(Mock)는 세포가 "모의 감염"된 후에 획득된 Sf-RVN 세포 RNA로부터 증폭된 물질을 함유하고; P0 (24) 및 (72)는 각각 24 및 72시간 동안 Sf-랍도바이러스로 세포가 감염된 후에 획득된 Sf-RVN 세포 RNA로부터 증폭된 물질을 함유하고; P1 (72), P2 (72) 및 P3 (72)는 각각 Sf-랍도바이러스로 감염된 후에 첫번째 횟수, 두번째 횟수, 또는 세번째 횟수로 세포가 계대배양된 후 72시간에 획득된 Sf-RVN 세포 RNA로부터 증폭된 물질을 함유하고; S2는 S2R+ 세포 RNA로부터 증목된 물질을 함유하고; H2O는 증류수를 함유한다.
도 13a-13b: 항바이러스 약물로 처리된 폴리클로날 TN-368 세포에서의 Tn-노다바이러스. 폴리클로날 TN-368 세포 집단이 다양한 농도의 3개의 항바이러스 약물인 리바비린, 6-아자우리딘, 및 비다라빈의 칵테일로 15일 동안 처리되었다. 전체 RNA가 이들 약물의 존재하에서 여전히 배양된 세포로부터 추출되었고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 Tn-노다바이러스 RNA 세그먼트 1(도 13a) 또는 2(도 13b)에 대해 검정되었다. TN-368 또는 Sf9 세포로부터 추출된 전체 RNA가 각각 양성 또는 음성 대조군으로 사용되었다. 주형이 없는 추가 음성 대조군 반응(H2O)이 수행되었다. "M"으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내고, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 14a-14b: 리바비린-처리된 TN-368 세포 서브클론에서의 Tn-노다바이러스의 부재. 전체 RNA가 200 μg/mL의 리바비린으로 1개월 동안 처리된 6개의 단일 세포 TN-368 서브클론으로부터 분리되었다. 이후, 실시예 16에 기재된 바와 같이 샘플이 RT-PCR(도 14a) 또는 RT-PCR, 및 이후 네스티드 PCR(도 14b)에 의해 Tn-노다바이러스 RNA 세그먼트 1에 대해 검정되었다. TN-368 또는 Sf9 세포로부터 추출된 전체 RNA가 각각 양성 또는 음성 대조군으로 사용되었다. "M"으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내며, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 15a-15c: Tn-NVN 세포에서의 Tn-노다바이러스의 부재. 전체 RNA가 항바이러스 약물의 부재하에서 다양한 계대배양으로 배양된 "Tn-NVN"으로 언급되는 예시적 세포주로부터 분리되고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 RT-PCR, 및 이후 Tn-노다바이러스 세그먼트 1(도 15a) 또는 세그먼트 2(도 15b)에 특이적인 프라이머를 이용한 네스티드 PCR에 의해 Tn-노다바이러스의 존재에 대해 검정되었다. Tn-NVN으로 언급되는 이러한 예시적 세포주는 Tn-노다바이러스 오염에 대해 음성인 것으로 밝혀진 리바비린-처리된 TN-368 클론(Cl#3)을 확장시킴으로서 생성되었다(도 15a-15c). Tn-노다바이러스-특이적 RT-PCR, 및 이후 네스티드 PCR 결과는 Tn-NVN 세포의 55회의 계대배양 후에 Tn-노다바이러스가 존재하지 않는 것을 입증하였다(도 15a 및 15b). 본 발명자는 또한 계대배양 55회에서 Tn-NVN 세포로부터 CFM을 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛 분획으로부터 전체 RNA를 분리하였고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 Tn-노다바이러스-특이적 RT-PCR, 및 이후 네스티드 PCR을 이용하여 Tn-노다바이러스에 대해 검정하기 위해 이를 사용하였다. 도 15c에 제시된 바와 같이, TN-368 세포로부터 분리된 RNA 및 TN-368 세포-비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에 해당하는 레인에서 Tn-노다바이러스 앰플리콘이 관찰되었다(도 15c, 각각 레인 TN-368 및 TN-368 CFM). 대조적으로, Tn-NVN 세포-비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에서 Tn-노다바이러스 앰플리콘이 검출되지 않았다. 또한, 도 15a-15c에 제시된 모든 결과는 항바이러스 약물의 부재하에서 배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득되었다. TN-368 세포 및 TN-368 세포-비함유 배지(CFM)를 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛으로부터 추출된 RNA가 양성 대조군으로 사용되었고, Sf9 세포로부터 추출된 RNA가 음성 대조군으로 사용되었다. 주형이 없는 추가 음성 대조군 반응(H2O)이 수행되었고, M으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내고, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 16: 미코플라스마 검정. Tn-NVN 및 TN-368 세포 추출물(-)이 실시예 6 및 18에 기재된 바와 같이 PCR-기반 Universal Mycoplasma Detection Kit(American Type Culture Collection)를 이용하여 미코플라스마 오염에 대해 검정되었다. M. 아르기니니 rRNA 표적 서열을 인코딩하는 플라스미드가 양성 대조군으로 사용되었다(도 16, 레인 "M. 아르기니니"). 용해질이 검정을 방해하는지의 여부를 결정하기 위해 상기 플라스미드로 스파이킹된 Tn-NVN 및 TN-368 세포 용해질(도 16, 각각 레인 Tn-NVN (+) 및 TN-368 (+))을 이용하여 추가 대조군이 수행되었다. 주형이 없는 음성 대조군 반응(H2O)이 수행되었다. M으로 표시된 레인은 100-bp 마커를 나타내며, 좌측에 선택된 크기가 표시된다.
도 17a-17c: 세포 성장 및 형태. Tn-NVN 및 TN-368 세포가 ESF 921 배지 중 1.0 x 106 세포/mL의 밀도로 진탕 플라스크에 시딩되었다. 삼중 샘플이 시딩 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 7 및 19에 기재된 바와 같이 자동화 세포 계수기로 살아 있는 세포수 및 직경이 측정되었다. 도면은 3개의 독립적 실험에서 측정된 평균의 살아 있는 세포 밀도(도 17a) 및 직경(도 17b), 뿐만 아니라 10X 배율에서의 Tn-NVN 및 TN-368 세포의 위상 대조 현미경사진(도 17c)을 제시한다. 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05).
도 18a-18c: 재조합 β-gal 생성. Tn-NVN 및 TN-368 세포가 5 pfu/세포의 MOI로 BacPAK6-ΔChi/Cath의 Tn-노다바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 삼중 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 9 및 20에 기재된 바와 같이 정화된 세포내 추출물이 β-gal 활성에 대해 검정되었다(도 18a). 이러한 플롯은 평균 결과를 제시하며, 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05). 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 스캐닝 레이저 밀도측정(도 18c)과 함께 면역블로팅 분석(도 18b)에 의해 전체 세포내 β-gal 생성 수준을 측정하기 위해 1세트의 추출물이 또한 사용되었다. 본 실험의 2개의 독립적 생물학적 복제물에서 동일한 일반적인 경향이 관찰되었다.
도 19a-19c: 재조합 hSEAP 생성. Tn-NVN 및 TN-368 세포가 5 pfu/세포의 MOI로 AcP(-)p6.9hSEAP의 Tn-노다바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 삼중 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 9 및 20에 기재된 바와 같이 세포-비함유 배지가 제조되고, hSEAP 활성에 대해 검정되고, 평균 결과가 플로팅되었고, 오차 막대는 신뢰 구간을 나타낸다(P<0.05; 도 19a). 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 스캐닝 레이저 밀도측정(도 19c)과 함께 면역블로팅 분석(도 19b)에 의해 전체 세포외 hSEAP 생성 수준을 측정하기 위해 1세트의 세포-비함유 배지가 또한 사용되었다.
도 20a-20b: 재조합 hEPO 생성. Tn-NVN 및 TN-368 세포가 5 pfu/세포의 MOI로 AcP(-)p6.9hEPO의 Tn-노다바이러스-비함유 스톡으로 감염되었다. 샘플이 감염 후 다양한 시간에서 수거되고, 실시예 9 및 20에 기재된 바와 같이 세포-비함유 배지가 제조되고, 상대 면역반응 밴드 밀도를 평가하기 위해 사용된 스캐닝 레이저 밀도측정(도 20b)과 함께 면역블로팅 분석(도 20a)에 의해 전체 세포외 hEPO 생성 수준에 대해 검정되었다.
도 21a-21b: N-당화 프로파일. Tn-NVN 및 TN-368 세포가 3 pfu/세포의 MOI로 AcP(-)p6.9hEPO의 Tn-노다바이러스-비함유 스톡으로 감염되고, hEPO-His가 실시예 10 및 21에 기재된 바와 같이 세포 비함유 배지로부터 친화성 정제되었다. N-글리칸은 효소적으로 방출되고, 회수되고, 과메틸화되고, 공지된 방법에 따라 MALDI-TOF MS(도 21a)에 의해 분석되고, [M + Na]+로 검출된 분자 이온이 구조 지정되고, 표준 만화 기호 표현을 이용하여 주석이 달리고, 단순성에 대해 넘버링되고, 전체 백분율로 제시되었다(도 21b).
도 22: BmN 세포에서의 Sf-랍도바이러스. 전체 RNA가 실시예 4에 기재된 바와 같이 인시목 곤충 봄빅스 모리로부터 유래된 BmN 세포주로부터 추출되었다. 이후, 샘플은 실시예 22에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 다양한 Sf-랍도바이러스 RNA(N, P, M, G, X, 및 L)에 대해 검정되었다.
상기 일반적 기재 및 하기 상세한 설명 둘 모두는 예시적이고 단지 예이며, 개시되 교시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 개시된 교시내용의 주제를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
상기 개요, 상세한 설명, 첨부 도면, 및 하기 청구범위에서, 본 발명의 교시내용의 특정한 특징(방법 단계를 포함함)이 참조된다. 본 명세서의 개시는 상기 특정 특징의 가능한 조합을 포함하는 것이 이해되어야 한다. 비제한적인 예로, 특정한 특징이 본 발명의 교시내용의 특정 구현예, 또는 특정 청구범위의 상황에서 개시되는 경우, 상기 특징은 또한 다른 특정 구현예와 조합하고/하거나 다른 특정 구현예의 상황, 및 본 발명의 일반적인 교시내용의 상황에서 가능한 범위로 이용될 수 있다.
2개 이상의 조합된 단계를 포함하는 방법이 언급되는 경우, 정의된 단계는 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있고(문맥이 그 가능성을 배제하는 경우 제외), 방법은 임의의 정의된 단계 전, 2개의 정의된 단계 사이, 또는 모든 정의된 단계 후에 수행되는 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다(문맥이 그 가능성을 배제하는 경우 제외).
정의
본 발명의 교시내용과 관련하여 사용되는 용어 "세포주"는 하나 또는 소수의 공통 조상 세포로부터 확장된 세포의 집단, 비제한적인 예로, 단일한 분리된 세포로부터 확장된 세포의 클론 집단을 의미한다. "확립된 세포주"는 신선한 배양 배지, 성장 공간이 제공되고, 적합한 조건하에서 인큐베이션되는 경우 무기한 증식할 잠재성을 갖는 세포주이다. 상기 세포주는 유기체 내에서 발견되는 자연-발생 대응 세포와 비교하여 시험관 내에서 변화(비제한적인 예로, 형질전환, 염색체 변화, 또는 둘 모두)를 겪는다. 제1 세포주로부터 단일 세포를 분리시킨 후, 분리된 세포를 확장시켜 다수의 세포를 획득하여 제2 세포주를 획득함으로써 획득되는 세포주는 때때로 이러한 세포주가 유래되는 제1 세포주의 "서브클론"으로 언급된다.
"포함하는(including)" 또는 "특징으로 하는", 및 각각의 동족어(예를 들어, 포함하다 및 함유하다)와 동의어인 본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)"은 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 성분, 요소, 또는 방법 단계를 배제하지 않고, 즉, 다른 성분, 단계 등이 임의로 존재한다. 비제한적인 예로, 구성요소 A, B, 및 C를 "포함하는" 항목은 구성요소 A, B, 및 C로 구성(즉, 단독으로 함유함)될 수 있거나; 항목은 구성요소 A, B, 및 C뿐만 아니라 하나 이상의 추가 구성요소를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유래된"은 직접 또는 간접적으로 공급원으로부터 획득되는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포는 유기체로부터 조직 또는 기관을 획득한 후, 조직 또는 기관을 분해하여 일차 세포를 획득함으로써 유기체로부터 직접 유래될 수 있다. 세포는, 비제한적인 예로, 유기체로부터 획득된 세포주로부터 분리물, 통상적으로 단일 세포 분리물을 획득한 후, 분리물을 확장시켜 때때로 서브클론으로 언급되는 복수의 세포를 포함하는 세포주를 획득함으로써 유기체로부터 간접적으로 획득될 수 있다.
용어 "인시목 곤충"은 성체가 되면 미세한 중첩되고 종종 밝은 색의 비늘로 일반적으로 덮인 4개의 넓은 날개 또는 창끝 모양의 날개를 갖고, 유충으로서 모충으로 존재하는 나비, 나방, 및 팔랑나비(skipper)를 포함하는 곤충의 큰 목(인시목)의 임의의 구성원을 나타낸다. 예시적인 인시목 곤충은 스포돕테라 프루기페르다, 봄빅스 모리, 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa), 및 트리코플루시아 니를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 언급된 항목 또는 항목들에 비해 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트 이하의 변화를 나타낸다. 비제한적인 예로, 세포주 및 Sf9 세포가 동일 조건하에서 증식되고, 평균 세포 직경이 본원에 기재된 바와 같이 결정되는 경우 통계적으로 유의한 샘플 크기를 기초로 하여 세포주는 Sf9 세포의 평균 직경의 90% 내지 110%의 평균 세포 직경을 갖거나; 세포주 및 Sf9 세포가 동일 조건하에서 증식되고, 세포 밀도가 본원에 기재된 바와 같이 결정되는 경우 통계적으로 유의한 샘플 크기를 기초로 하여 세포주는 Sf9 세포의 세포 밀도의 90% 내지 110%의 세포 밀도를 갖는다.
용어 "바이러스의 존재에 대해 시험", "Sf-랍도바이러스의 존재에 대해 시험", "Tn-노다바이러스의 존재에 대해 시험", "바이러스의 존재 또는 부재 검출" 및 관련 용어는 본원에서 광범위한 의미로 사용된다. 당업자는 본 발명의 교시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 당 분야에 공지된 다수의 시험 기술이 존재함을 이해한다. 바이러스의 존재에 대해 시험하기에 적합한 예시적 기술은 역전사(RT), RT-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 네스티드 PCR(nested PCR)과 커플링된 RT-PCR(비제한적인 예로, 실시예 4, 16, 및 22에 개시된 예시적 기술), 정량적 PCR(때때로 실시간 PCR로 언급됨), 다양한 프로브 하이브리드화 기술, 전자현미경검사, 및 당 분야에 공지된 다양한 항체-기반 검출 기술, 비제한적인 예로, 적어도 하나의 항-바이러스 항체를 포함하는 ELISA 검정을 포함한다. 용균성이거나 세포에서 관찰 가능한 세포변성 효과(CPE)를 야기시키는 바이러스의 경우, 예시적 시험 기술은, 비제한적인 예로, 현미경검사의 이용을 포함할 수 있는 플라크 검정 및 CPE의 관찰을 포함한다. 생물정보학 기술, 비제한적인 예로, 관심 세포주 또는 유기체에 함유된 RNA 또는 DNA 서열의 전자 데이터베이스를 검색하는 BLAST가 또한 본 발명의 교시내용의 범위 내이다.
특정 구현예에 따르면, 바이러스의 결핍을 특징으로 하는 확립된 세포주, 비제한적인 예로, 바이러스-오염된 유기체로부터 유래된 바이러스-비함유의 확립된 세포주는 바이러스에 감염된 유기체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 세포주는 바이러스에 오염된 곤충으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 곤충은 인시목 곤충, 비제한적인 예로, 스포돕테라 프루기페르다(Sf), 봄빅스 모리, 헬리오티스 서브플렉사, 또는 트리코플루시아 니를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포주는 Sf 세포주, 비제한적인 예로, Sf9 또는 Sf-21 세포주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 세포주는 바이러스로 오염된 트리코플루시아 니 또는 바이러스-오염된 트리코플루시아 니 세포주, 비제한적인 예로, 알파노다바이러스로 오염된 TN-368 세포주로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 확립된 세포주는 (1) 바이러스-비함유 및 바이러스 감염 세포주가 동일 조건하에서 증식되고, (2) 비교가 본원에 기재된 바와 같이 수행되고, (3) 비교가 통계적으로 유의한 샘플 크기를 기초로 하는 경우 세포주가 유래되는 바이러스-오염된 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포 밀도, 배가 시간, 평균 세포 직경, 형태, 및 N-당화 패턴을 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 세포주는 각각이 동일 조건하에서 AcP(-)p6.9hEPO 또는 AcP(-)p6.9hSEAP로 감염되고, 비교가 실시예 11에 따라 수행되는 경우 세포주가 유래되는 바이러스-감염된 세포보다 더욱 감염성인 재조합 배큘로바이러스의 생성을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 교시내용의 세포주는 Sf-랍도바이러스 감염에 민감하다.
바이러스가 결핍된 세포주를 획득하기 위한 특정한 예시적인 방법에 따르면, 바이러스로 감염된 세포 집단, 예를 들어, 바이러스로 오염된 세포주 또는 분해된 조직 또는 기관 또는 바이러스로 감염된 유기체로부터의 바이러스 또는 세포로 오염된 세포주로부터 하나 또는 몇개의 세포가 분리된다. 분리된 세포 또는 세포들은 하나 이상의 항바이러스 화합물을 함유하는 적절한 세포 배양 배지와 조합되어 제1 배양 조성물을 형성한다. 이러한 제1 배양 조성물은 세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 하나 이상의 항바이러스 화합물이 바이러스 복제에 영향을 미치기에 충분한 기간 동안 인큐베이션된다. 특정한 방법의 구현예에서, 세포 또는 배양 배지의 분취액이 배양물로부터 분리되고, 바이러스의 존재에 대해 시험된다. 바이러스가 결핍된 세포가 항바이러스 화합물을 함유하지 않는 배양 배지와 조합되어 제2의 배양 조성물을 형성한다. 이러한 제2의 배양 조성물은 세포가 성장하고 분열하도록 하는 조건하에서 인큐베이션된다. 세포는 확장되어 세포주가 획득된 유기체 또는 세포를 오염시킨 바이러스가 결핍된 세포주가 획득된다.
특정 구현예에서, 바이러스-비함유 세포주를 획득하기 위한 방법은 인시목 곤충 세포, 비제한적인 예로, 스포돕테라 프루기페르다 또는 트리코플루시아 니 세포의 집단으로부터 단일 세포를 분리시키는 단계; 분리된 세포와 적어도 하나의 항바이러스 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 조합하여 제1 배양 조성물을 형성시키는 단계; 세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제1 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 다수의 세포를 생성시키는 단계; 임의로, 세포 또는 세포 배양 배지의 일부를 분리하여 Sf-랍도바이러스 또는 노다바이러스의 존재에 대해 시험하는 단계; 제1 배양 조성물로부터의 다수의 세포의 적어도 일부와 항바이러스 화합물이 없는 세포 배양 배지를 조합하여 제2 배양 조성물을 형성시키는 단계; 및 세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제2 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 바이러스의 결핍을 특징으로 하는 세포주를 획득하는 단계를 포함한다.
특정한 방법의 구현예에 따르면, 바이러스, 비제한적인 예로, Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스가 결핍된 확립된 세포주가 획득된다. 특정한 방법의 구현예에서, 개별적 세포 또는 세포의 작은 그룹, 비제한적인 예로, 2개 세포, 3개 세포, 4개 세포, 5개 세포, 10개 이하의 세포, 또는 20개 이하의 세포(1과 20 사이의 모든 전체 숫자를 포함함)의 그룹이 바이러스로 감염된 세포 집단으로부터 분리된다. 단일 세포 또는 세포의 작은 수를 분리시키기 위한 기술의 비제한적인 예는 제한 희석 클로닝(때때로 연속 희석에 의한 클로닝으로 언급됨), 연성 아가에서의 세포 클로닝 및 이후 세포 콜로니 피킹, 단일 또는 적은 수의 세포를 분리시키기 위한 세포 분류, 레이저 포획 미세절제(LCM), 개별적 또는 적은 수의 세포를 수작업으로 포획하기 위한 마이크로피펫(비제한적인 예로, 초박 모세관(ultra-thin capillaries)) 이용, 미세유체공학, 또는 단일 또는 적은 수의 세포의 선택을 현미경적으로 보조하기 위한 미세조작장치 이용을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일 세포를 분리시키는 것은 제한 희석 클로닝을 포함한다.
특정한 방법의 구현예에서, 분리된 단일 세포 또는 작은 그룹의 세포는 적어도 하나의 항바이러스 화합물을 포함하는 세포 배양 배지와 조합되어 제1 배양 조성물을 형성한다. 예시적 항바이러스 화합물은 약물, 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체, 인터페론, 및 바이러스-특이적 항체, 비제한적인 예로, 중화 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오시드 유사체의 비제한적인 예는 리바비린, 6-아자우리딘, 비다라빈, 아시클로버, 9-/3-D-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A), 시토신 아라비노스, 아데닌 아리비노시드, 및 구아닌 7-N-옥사이드(G-7-Ox)를 포함한다. 특정한 방법의 구현예에서, 적어도 하나의 항바이러스 화합물은 6-아자우리딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 항바이러스 화합물은 리바비린, 6-아자우리딘, 비다라빈, 아시클로버, 9-/3-D-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A), 시토신 아라비노스, 아데닌 아라비노시드, 및 구아닌 7-N-옥사이드(G-7-Ox)로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 항바이러스 화합물은 6-아자우리딘이다. 특정 구현예에서, 항바이러스 화합물은 리바비린을 포함한다.
특정한 방법의 구현예에 따르면, 제1 배양 조성물은 세포 성장에 적합한 조건하에서 인큐베이션된다. 특정한 개시된 방법에 따르면, 제1 배양 조성물로부터 획득된 세포 또는 세포 배양 상층액은, 비제한적인 예로 RT-PCR, 네스티드 PCR, 또는 RT-PCR 및 네스티드 PCR, 및 이후 바이러스 특이적 증폭 생성물의 존재 또는 부재에 대한 생성된 앰플리콘의 분석에 의해 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험된다. 특정한 방법의 구현예에서, 감염성 바이러스의 존재 또는 부재는 (1) (a) 잠재적으로 감염된 세포 또는 잠재적으로 감염된 세포가 인큐베이션된 세포 배양 상층액과 (b) 잠재적 바이러스에 의한 감염에 민감한 세포를 (c) 적합한 세포 배양 배지에서 조합하고; (2) 바이러스가 세포를 감염시키는데 적합한 조건하에서 상기 배양물을 인큐베이션하고; (3) 바이러스 핵산의 존재에 대해 배양된 세포 또는 이들이 배양된 배지를 모니터링함으로써 결정된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 배양 배지는, 비제한적인 예로, 바이러스-특이적 RT-PCR 및 이후 네스티드 PCR을 이용한 후, 특정 앰플리콘의 존재 또는 부재를 결정함으로써 바이러스의 존재에 대해 주기적으로 시험된다.
특정 구현예에 따르면, 분리된 세포가 바이러스 복제를 억제하기에 적합한 기간 동안 제1 배양 조성물에서 인큐베이션되고, 상응하는 세포 또는 배양 배지의 샘플이 시험되고, 바이러스를 함유하지 않는 것으로 밝혀진 후, 세포는 항바이러스 화합물을 함유하지 않는 세포 배양 배지와 조합되어 제2 배양 조성물이 형성된다. 제2 배양 조성물은 세포 성장에 적합한 조건하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 제2 배양 조성물로부터의 세포 또는 배양 배지는 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험된다.
당업자는 특정 세포 유형을 성장시키는데 적합한 조건이 다양한 공급처, 비제한적인 예로, 세포 배양 메뉴얼, 상업적 세포 은행, 또는 배양 배지 및/또는 플라스틱 제품의 공급업체로부터 용이하게 확인 가능한 것을 인지할 것이다. 적절한 세포 배양 조건은 또한 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포주는 바이러스, 비제한적인 예로, Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스로 오염된 일차 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 세포주는 Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 바이러스로 감염된 세포주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 감염된 세포의 집단은 감염된 세포주의 일부이다. 특정 구현예에서, 감염된 세포주는 감염된 유기체, 비제한적인 예로, 나방, 모충, 또는 바이러스로 지속적으로 감염된 다른 곤충으로부터 획득되었다. 특정 구현예에서, 세포주는 바이러스로 감염된 곤충으로부터 유래된 오염된 세포주, 비제한적인 예로, Sf-랍도바이러스로 감염된 Sf 세포주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 세포주는 Tn-노다바이러스로 오염된 트리코플루시아 니 세포주, 비제한적인 예로, TN-368, BTI-Tn-5B1-4(HIGH FIVE™으로도 공지됨), 또는 Tni PRO 세포이다.
특정한 개시된 방법에 따르면, 세포 또는 세포가 성장된 세포 배양 배지는 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험된다. 특정 방법에서, 시험은 RT-PCR 및 네스티드 PCR; 정량적 PCR; 프로브 하이브리드화 기술; BLAST 검색을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 생물정보학 방법; 플라크 검정, CPE 관찰, 또는 항체-기반 검출 방법을 포함한다.
특정한 예시적 구현예
실시예 1. 곤충 세포 배양. Sf-랍도바이러스로 오염된 것으로 공지된 Sf9 세포를 ESF 921 배지(Expression Systems, Woodland, CA)에서 28℃에서 진탕-플라스크 배양으로서 일상적으로 유지시켰다. Tn-노다바이러스로 오염된 것으로 공지된 TN-368 세포를 10% 소 태아 혈청(Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) 및 1% pluronic F-68(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 보충된 TN-MFH 배지에서 28℃에서 부착 배양으로서 일상적으로 유지시켰다.
실시예 2. 바이러스가 결핍된 확립된 S. 프루기페르다 세포주를 생성시키는데 실패한 통상적인 방법. Sf-랍도바이러스-비함유 유도체를 분리시키기 위한 본 발명의 초기의 노력은 10%(v/v) 소 태아 혈청(Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) 및 다양한 농도의 리바비린(Oxchem Corporation, Irwindale, CA)이 보충된 TNM-FH 배지에서 폴리클로날 Sf9 세포 집단을 배양하는 것을 포함하였다. 이후, 본 발명자는 폴리클로날 Sf9 세포 집단을 다양한 농도의 3개의 항바이러스 약물인 리바비린, 6-아자우리딘(Alfa Aesar, Ward Hill, MA) 및 비다라빈(TCI America, Portland, OR)으로 처리하였다. Sf9 세포를 ad hoc 연속 계대배양으로 약 1개월 동안 상기 3개의 약물과 함께 배양하고, 샘플을 실시예 4에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 Sf-랍도바이러스 오염에 대해 일상적으로 시험하였다. 100 μg/mL의 리바비린을 이용한 처리 1개월 후, 본 발명자는 RT-PCR-검출 가능한 Sf-랍도바이러스를 함유하지 않는 Sf9 서브클론을 획득하였다(도 1a). 이러한 Sf-랍도바이러스-비함유 서브클론을 10%(v/v) 소 태아 혈청으로 보충되었으나 항바이러스 약물로 보충되지 않은 TNM-FH 배지로 옮기고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 RT-PCR/네스티드 PCR로 재시험하였다. 놀랍게도, 이들 세포를 항바이러스 약물이 결핍된 배양 배지로 옮긴 경우, 이들은 Sf-랍도바이러스-양성 표현형으로 복귀하였다(도 1b). 본 발명자는 이후 폴리클로날 Sf9 세포 집단을 다양한 농도의 3개의 항바이러스 약물인 리바비린, 6-아자우리딘, 및 비다라빈의 조합물로 처리하였다. 다시, 본 발명자는 약 1개월 동안 상기 3개의 약물로 처리된 세포가 여전히 Sf-랍도바이러스에 대해 양성인 것을 놀랍게도 발견하였다(도 1c). 따라서, 척추동물 세포가 상기 동일한 항바이러스 약물을 이용한 처리에 의해 랍도바이러스 오염을 치료한 이전 작업과 뚜렷하게 대조적으로, 이러한 접근법은 Sf9 세포로부터 Sf-랍도바이러스를 제거하는데 실패하였다.
실시예 3. 바이러스의 결핍을 특징으로 하는 확립된 Sf 세포주를 획득하기 위한 예시적 방법. 항바이러스 약물로 처리된 폴리클로날 Sf9 세포 배양물이 약물-비함유 배지에서 성장하는 경우 Sf-랍도바이러스-양성 표현형으로 복귀한 것을 발견한 후, 본 발명자는 바이러스-오염된 시작 물질로부터 유래된 확립된 바이러스-비함유 세포주를 획득하기 위한 새로운 방법을 개발하였다. 이러한 예시적 구현예는 제한 희석에 의해 단일한 Sf9 세포를 분리시킨 후, 분리된 세포 서브클론을 항바이러스 약물로 처리하는 것을 포함하였다. 세포를 10%(v/v) 우 태아 혈청(Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA) 및 10 μg/mL의 리바바린(Oxchem Corporation, Irwindale, CA), 6-아자우리딘(Alfa Aesar, Ward Hill, MA), 또는 비다라빈(TCI America, Portland, OR)이 보충된 TNM-FH 배지 내로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 ad hoc 증폭으로 약 1개월 동안 배양하여 점진적으로 더 큰 배양물을 생성시키고, 25 cm2 플라스크 수준을 달성한 후, 샘플을 실시예 4에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 Sf-랍도바이러스 오염에 대해 시험하였다. Sf-랍도바이러스 오염이 결핍된 클론(도 2b)을 Sf-RVN 계대배양 0(P0)으로 명명된 항바이러스 약물이 결핍된 배지로 옮기고, P2에서 혈청-비함유 ESF 921 배지 중의 진탕-플라스크 배양물로 옮기고, 이후 상기 배양 배지 및 형식으로 유지시켰다.
실시예 4. Sf - 랍도바이러스 -특이적 역전사 - PCR (RT- PCR )/ 네스티드 PCR . 1 x 106개의 세포를 함유하는 Sf9 및 Sf-RVN 배양물의 샘플을 수거하고, 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 세포-비함유 상층액을 0.22 μm 필터(CELLTREAT Scientific, Shirley, MA)를 통해 여과시킨 후, 4℃에서 22시간 동안 131,000 x g에서 초원심분리시켰다. 전체 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNASolv 시약(Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA)을 이용하여 저속 세포 및 고속 세포-비함유 펠렛 둘 모두로부터 추출하였다. 이후, RNA를 정량하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 ProtoScript II First Strand cDNA 합성 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA) 및 320-SP1로 명명된 Sf-랍도바이러스-특이적 프라이머(SEQ ID NO:9)를 이용한 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 동등한 양의 각각의 cDNA 제조물을 Taq DNA 중합효소, ThermoPol 반응 완충액(New England Biolabs), 및 Sf-랍도바이러스-특이적 프라이머 Mono-1(SEQ ID NO:1) 및 Mono-2(SEQ ID NO:2)를 이용한 PCR에 사용하였다. 반응 혼합물을 3분 동안 94℃에서 인큐베이션하고, 30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 및 1분 동안 72℃에서 35회 반복하고, 최종적으로 10분 동안 72℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 1 μL의 각각의 일차 PCR(RT-PCR)을 프라이머가 네스티드 Sf-랍도바이러스-특이적 프라이머 Mono-1i(SEQ ID NO:7) 및 Mono-2i(SEQ ID NO:8)인 것을 제외하고는 동일 조건하에서의 이차 PCR(RT-PCR/네스티드 PCR)을 위한 주형으로 사용하였다. RT-PCR 및 RT-PCR 및 이후 네스티드 PCR 생성물을 표준 방법에 따라 에티디움 브로마이드 염색과 함께 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 이들 검정에 사용된 각각의 프라이머의 서열이 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
실시예 5. Sf - 랍도바이러스가 결핍된 예시적 Sf 서브클론 " Sf - RVN ". 실시예 4에 기재된 바와 같이 전체 RNA를 다양한 계대배양 수준에서 Sf-RVN 세포 추출물로부터 분리시키고, RT-PCR/네스티드 PCR을 이용하여 Sf-랍도바이러스의 존재에 대해 시험하였다. 예상된 바와 같이 Sf9 세포로부터의 전체 RNA를 상기 검정을 위한 양성 대조군으로 사용한 경우에 예상 크기의 강한 증폭 생성물을 관찰하였다(도 3a, 3b, 및 3c). 대조적으로, 본 발명자가 본 발명자의 실험실에서 임의의 항바이러스 약물의 부재하에서 60회(도 3a) 또는 120회(도 3b)의 연속적 계대배양의 과정 동안 5회의 계대배양마다 Sf-RVN 세포로부터 분리된 전체 RNA를 사용한 경우에 생성물이 관찰되지 않았다. 본 발명자는 또한 Sf-랍도바이러스 복제를 지원하지 않는 D. 멜라노가스터(D. melanogaster) S2R+ 세포로부터 분리된 전체 RNA를 갖는 음성 대조군에서 증폭 생성물이 없음을 관찰하였다. 본 발명자는 본 발명자가 Sf-RVN 세포로부터 분리되지 않고 Sf9 세포로부터 분리된 전체 RNA를 이용한 RT-PCR을 위해 Sf-랍도바이러스의 L-단백질 코딩 서열의 다른 영역으로부터 유래된 2개의 다른 Sf-랍도바이러스-특이적 프라이머 쌍(Mono-3(SEQ ID NO:3)/Mono-4(SEQ ID NO:4) 및 Mono-5(SEQ ID NO:5)/Mono-6(SEQ ID NO:6); 표 1 참조)을 사용한 경우에 예상 크기의 강한 증폭 생성물을 관찰하였다(데이터는 제시하지 않음). 최종적으로, 본 발명자는 60회의 계대배양 후에 시험한 경우에 Sf9 세포-비함유 배지를 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛으로부터 분리된 전체 RNA를 이용한 RT-PCR/네스티드 PCR 검정에서 예상 크기의 강한 증폭 생성물을 관찰하였으나, Sf-RVN 세포-비함유 배지에서는 그렇지 않았다(도 3c). 종합적으로, 이들 결과는 임의의 항바이러스 약물의 부재하에서 120회의 계대배양의 과정에 걸쳐 Sf-RVN 세포 또는 세포-비함유 배지에서 검출 가능한 Sf-랍도바이러스 RNA가 존재하지 않은 것을 입증하였고, 이는 이들 세포가 Sf-랍도바이러스-비함유인 것을 나타낸다.
실시예 6. 미코플라스마 검출. 본 발명자는 또한 제조업체의 프로토콜에 따라 미국 생물자원센터(Manassas, VA)로부터의 Universal Mycoplasma Detection 키트를 이용하여 미코플라스마에 대해 약 105개의 Sf-RVN 또는 Sf9 세포를 함유하는 샘플을 시험하였다. 이러한 PCR-기반 검정은 세포 배양의 오염물질로 흔히 발견되는 8개의 종을 포함하는 60개가 넘는 상이한 미코플라스마, 아콜레플라스마, 스피로플라스마 및 우레아플라스마 종의 16S rRNA 유전자에서 보존된 서열에 상보적인 프라이머를 사용한다. 도 4에 제시된 결과는 Sf9 또는 Sf-RVN 세포가 미코플라스마로 검출 가능하게 오염되지 않은 것을 입증하였다. PCR 생성물의 부재는 대조군 주형으로 스파이킹된 용해질을 이용하여 수행된 PCR에서 예상 크기의 앰플리콘이 관찰됨에 따라 곤충 세포 용해질에 의한 PCR 반응의 억제로 인한 것이 아니었다(도 4).
실시예 7. 세포 성장 특성, 형태, 및 직경 . Sf-RVN 또는 Sf9 세포를 50 mL 진탕 플라스크 배양으로 1.0 x 106 세포/mL의 시작 밀도로 시딩하고, 삼중 샘플을 4일 동안 24시간마다 분리하고, 살아 있는 세포 밀도 및 크기를 COUNTESS® 자동화 세포 계수기(ThermoFisher Scientific, Inc.)를 이용하여 측정하였다. 배가 시간을 식 Td = T x Log2/Log(Q2/Q1)를 이용하여 계산하였고, 상기 식에서 Td는 배가 시간이고, T는 마지막 계대배양 이후에 경과된 시간(h)이고, Q1은 세포 시딩 밀도이고, Q2는 살아 있는 세포수이다. 세포 형태는 Olympus FSX-100 현미경 및 FSX-BSW 영상화 소프트웨어(Olympus Life Sciences Solutions, Center Valley, Pennsylvania)를 를 이용하여 10X의 배율로 위상 대조 이미지를 수집함으로써 기록하였다.
Sf9의 여러 일반적 특성에 대한 Sf-RVN 세포의 여러 일반적 특성을 비교하기 위해, 본 발명자는 배큐로바이러스 감염에 대한 이들의 배양 밀도, 직경, 배가 시간, 형태, 및 생활력을 평가하였다. 결과는 Sf-RVN 및 Sf9 세포가 ESF-921 배지에서 병행 진탕 플라스크 배양으로 시딩된 후 4일의 과정에 걸쳐 사실상 동일한 평균 밀도를 달성한 것을 나타내었다(도 5a). 이러한 기간은 일상적인 곤충 세포주 유지 동안 연속 계대배양 사이에 통상적으로 허용되는 2-3일의 성장을 포함하였다. 결과는 또한 이들 세포 배양 실험의 과정 동안 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 평균 직경(도 5b), 배가 시간(도 5c), 또는 형태(도 5d)에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 최종적으로, 본 발명자는 배큘로바이러스 감염에 대한 반응으로 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 생활력에서 유의한 차이가 없는 것을 발견하였으며, 이는 0.1(도 6a) 또는 5(도 6b) pfu/세포의 다중도로 감염 후 4일에 걸쳐 구별할 수 없었다. 본 실험에서 이용된 기간 및 2개의 상이한 MOI는 낮은 또는 높은 MOI로 배큘로바이러스 작업 스톡 또는 재조합 단백질 각각을 생성시키기 위해 통상적으로 사용되는 조건을 포함하였다. 전반적으로, 이들 실험의 결과는 본 연구에서 시험된 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 일반적 특성이 구별할 수 없는 것을 입증하였다.
실시예 8. 배큘로바이러스 발현 벡터. 전장의 태깅되지 않은 E. 콜리 β-갈락토시다제(β-gal)를 인코딩하는 BacPAK6-ΔChi/Cath로 명명된 배큘로바이러스 발현 벡터를 2개의 연속적 단계로 생성시켰다. 첫번째 단계에서, BacPAK6 바이러스 DNA를 배큘로바이러스 p6.9 프로모터의 제어하에서 E. 콜리 β-글루쿠로니다제를 인코딩하는 플라스미드와 재조합시켰다. 이러한 플라스미드에서, p6.9-β-글루쿠로니다제 유전자를 AcMNPV chiA 및 v- cath 유전자 대신에 삽입하고, 야생형 AcMNPV 측접 서열 내에 엠베딩시켰다. 원하는 재조합체를 X-GlcA(RPI Corp., Mount Prospect, IL)의 존재하에서 이의 청색 플라크 표현형에 의해 시험적으로 확인하였다. 재조합 부위를 전달 플라스미드의 내부 및 외부에 각각 존재하는 β-글루쿠로니다제 유전자 및 AcMNPV gp64 유전자의 5' UTR에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR로 확인하였다. 이러한 바이러스를 증폭시키고, 바이러스 DNA를 분리하고, I-SceI로 절단하여 전체 β-글루쿠로니다제 발현 카세트를 결실시켰다. 두번째 단계에서, Sf9 세포를 I-SceI-절단된 바이러스 DNA로 형질감염시켰다. 생성된 프로제니를 X-GlcA의 존재하에서 플라크 검정에 의해 분석하였고, 최종 재조합 배큘로바이러스 BacPAK6-ΔChi/Cath를 이의 백색 플라크 표현형에 의해 확인하였다.
AcMNPV p6.9 프로모터 및 허니비 프레프로멜리틴(honeybee prepromellitin) 신호 펩티드의 제어 하의 인간 분비 알칼리성 포스파타제(hSEAP) 및 인간 에리트로포이어틴(hEPO) 각각의 AcP(-)p6.9hSEAP 및 AcP(-)p6.9hEPO 인코딩 8X HIS-태깅된 형태로 명명된 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터. N-말단 TEV 프로테아제 절단 부위(ENLYFQG)를 갖는 성숙 SEAP 및 EPO(Genbank NP_001623.3 아미노산 23-511 및 Genbank NP_000790.2 아미노산 28-193 각각)를 인코딩하는 합성 유전자를 OPTIMIZER(Puigbo et al., 2007)를 이용하여 설계하여 AcMNPV 코돈 사용을 일치시켰다(http://www.kazusa.or.jp). 이들 서열을 합성하고, 클로닝하고, Genscript(Piscataway, N.J.)로 시퀀싱하고, 이전에 기재된 바와 같이 오류가 없는 클론을 사용하여 Ac6.9GT와의 시험관내 재조합에 의해 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터를 생성시켰다(Toth et al., 2011).
표준 방법을 사용하여 Sf9 세포에서 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터를 플라크-정제하고, 증폭시키고, 적정하였다. 또한, Sf-랍도바이러스 및 Tn-노다바이러스-비함유 스톡을 본 연구를 위해 생성시켰다. 첫째로, Sf9 세포를 각각의 배큘로바이러스 벡터의 작업 스톡으로 감염시킨 후, 배큘로바이러스 DNA를 표준 방법을 이용하여 분리시켰다. 이러한 방법은 Sf-랍도바이러스 및 Tn-노다바이러스를 제거하는 것으로 예상되는 프로테이나제 K, SDS, 및 RNaseA 처리, 및 이후 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출 및 이소프로판올을 이용한 DNA 침전을 포함한다. 이후, Sf9 세포 대신에 Sf-RVN을 플라크-정제 및 증폭을 위한 숙주로 사용한 것을 제외하고는, 생성된 배큘로바이러스 DNA 제조물을 사용하여 Sf-RVN 세포를 형질감염시키고, 프로제니를 플라크-정제하고, 증폭시키고, 적정하였다. 이러한 공정 동안, 본 발명자는 실시예 4에 기재된 RT-PCR/네스티드 PCR 검정을 이용하여 Sf-랍도바이러스 및 Tn-노다바이러스의 존재 또는 부재에 대해 배큘로바이러스 DNA-형질감염 및 배큘로바이러스-감염 Sf-RVN 세포 추출물, 뿐만 아니라 최종 작업 바이러스 스톡의 샘플을 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛을 시험하였다. Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스 서열이 검출되지 않았다.
실시예 9. 재조합 단백질 발현. ESF 921 배양 배지에서의 Sf-RVN 또는 Sf9 세포를 1 x 106 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후, 세포를 ESF 921 배지로 모의 감염시키거나, 0.1 또는 5 플라크-형성 단위(pfu)/세포의 감염 다중도(MOI)로 BacPAK6-ΔChi/Cath, AcP(-)p6.9hSEAP, 또는 AcP(-)p6.9hEPO의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염시켰다. 감염 후 다양한 시간에서, 감염된 세포를 수거하고, 세포 밀도를 측정하고, 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 이후, 세포 및 세포-비함유 배지를 하기 기재되는 바와 같이 발현되는 모델 단백질의 특성 및 실험 목적에 따라 다양한 방식으로 처리하였다. 그러나, 각각의 경우에, 세포 추출물 및/또는 세포-비함유 배지에서의 재조합 단백질의 수준을 하기에 특정되는 바와 같은 단백질-특이적 또는 태그-특이적 일차 항체 및 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 이차 항체를 이용한 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE; (Laemmli, 1970)) 및 면역블로팅(Towbin et al., 1979)에 의해 측정하였다. 면역반응성 단백질을 표준 알칼리성 포스파타제-기반 색 반응을 이용하여 시각화시키고, 상대 강도를 Image J 소프트웨어 버전 1.48(U.S. National Institutes of Health)을 이용하여 밴드를 스캐닝하고 정량함으로써 평가하였다.
β-gal에 대해, 공지된 방법을 이용하여 감염된 세포 펠렛을 사용하여 효소 활성 검정을 위한 세포질 추출물을 제조하였다. 일차 및 이차 프로브로서 각각 토끼 항-β-gal(EMD Millipore Corporation, Germany) 및 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 이용하여 면역블로팅을 수행하였다.
hSEAP에 대해, 효소 활성 검정을 위해 감염된 세포-비함유 배지를 제조하고, 일차 및 이차 프로브로서 각각 마우스 항-펜타-His(ThermoFisher) 및 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이션된 토끼 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich)를 이용하여 면역블로팅을 수행하였다.
hEPO에 대해, 일차 및 이차 프로브로서 각각 토끼 항-hEPO(U-CyTech, Utrecht, The Netherlands) 및 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(Sigma-Aldrich)를 이용한 면역블로팅을 위해 감염된 세포-비함유 배지를 제조하였다.
본 발명자는 E. 콜리 β-gal, 모델 박테리아, 세포내 단백질; hSEAP, 모델 인간, 분비 당단백질; 및 hEPO, 모델 인간, 생물공학적으로 중요한 분비 당단백질을 이용하여 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의해 지원되는 배큘로바이러스-매개 재조합 단백질 생성의 수준을 비교하였다. 상기 기재된 바와 같이 각각의 재조합 배큘로바이러스의 Sf-랍도바이러스-비함유 작업 스톡이 제조되고, 이들 연구에 사용된 것을 강조하는 것이 중요하다.
E. 콜리 β-gal 발현 실험은 재조합 배큘로바이러스를 이용한 감염 4일 동안 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의해 생성된 세포내 효소 활성 수준에서 유의한 차이가 없음을 나타내었다(도 7a). 도 7b에 제시된 대표적 면역블로팅 결과는 Sf-RVN이 약간 더 많은 전체 세포내 β-gal 단백질을 생성시킨 것을 나타내었다. 본 발명자가 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant blue)로 염색한 독립적인 생물학적 복제물이 동일한 결과를 생성시켰으나, 도 7a-7c에 제시된 결과에서와 같이, Sf-RVN 세포에 의해 생성된 세포내 β-gal 수준에서의 증가는 경미하였다(데이터는 제시되지 않음). 최종적으로, 본 발명자는 효소 활성의 수준 및 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의해 생성된 면역반응성 세포내 β-gal 둘 모두가 이전 시점에 비해 감염 4일 후에 낮은 것을 인지하였고, 이는 이러한 감염의 매우 늦은 시간에서의 배큘로바이러스-유도된 세포독성을 반영할 수 있다.
감염 4일 동안의 hSEAP 생성 및 분비의 본 발명자의 분석은 본질적으로 동일한 결과를 발생시켰다. 이러한 경우, 본 발명자는 낮은(0.1 pfu/세포; 도 8a, 8b, 및 8c) 및 높은(5 pfu/세포; 도 8d, 8e, 및 8f) MOI 감염 둘 모두를 포함하도록 실험을 확장시켰는데, 이는 일부 연구자가 BICS에서 통상적인 높은 MOI 감염보다 오히려 낮은 MOI 감염으로 더 높은 생산성을 보고하였기 때문이다. 이들 실험의 결과는 낮은(도 8a) 또는 높은(도 8d) MOI로 감염된 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의해 생성된 hSEAP 활성의 수준에서 통계적으로 유의한 차이가 없음을 나타내었다. 대표적 면역블로팅 결과는 Sf9이 낮은(도 8b 및 8c) MOI로 감염된 경우 약간 더 많은 hSEAP를 생성시켰고, Sf-RVN이 높은(도 8e 및 8f) MOI로 감염된 경우 약간 더 많은 hSEAP를 생성시킨 것을 나타내었다. 그러나, 이들은 단지 약간의 차이였으며, 본 실험의 독립적인 생물학적 복제물에서 완전히 재현할 수 없었다(데이터는 제시되지 않음). Sf-RVN 및 Sf9 세포 둘 모두는 높은 MOI로 감염된 경우 1일에서 더 많은 hSEAP 활성 및 면역반응성 세포외 단백질 및 감염 후 4일까지 약 3배 더 많은 hSEAP 활성을 발생시켰다. 본 발명자는 또한 본원에 기재된 hSEAP 발현 및 분비 실험의 일부로서 획득된 데이터로부터 유래된 도 6a-6b에 제시된 바와 같이 어느 MOI에서도 감염 4일 동안 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 생활력에서 차이가 없음을 인지하였다.
최종적으로, 본 발명자는 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의한 hEPO 생성 및 분비의 수준을 비교한 경우 동일한 일반적인 결과를 획득하였다. 상기 생성물에 대한 간단한 기능적 검정이 없으므로, 본 발명자의 분석은 4일의 감염 동안 2개의 상이한 세포 유형에 의해 세포외 배지로 분비된 면역반응성 hEPO의 수준을 비교하는 것으로 제한되었다. 본 실험의 2개의 독립적인 생물학적 복제물의 결과는 Sf-RVN 및 Sf9 세포에 의해 생성된 분비된 hEPO의 수준에서 주요한 재현 가능한 차이를 나타내지 않았다(도 9a 및 9b).
종합하면, 이들 결과는 Sf-RVN 및 Sf9 세포가 거의 동일한 수준으로 3개의 상이한 재조합 단백질을 생성하고 분비하는 것을 입증하였다.
실시예 10. N - 글리칸 분석 . Sf-RVN 및 Sf9 세포의 50 mL의 진탕 플라스크 배양물을 AcP(-)p6.9hEPO의 Sf-랍도바이러스-비함유 스톡으로 감염시키고, hEPO를 Ni-NTA 수지(ThermoFisher)를 이용하여 세포-비함유 및 바이러스-비함유 상층액으로부터 친화성 정제하였다. N-글리칸을 PNGase-F(New England Biolabs)을 이용한 절단에 의해 정제된 hEPO 제조물로부터 효소적으로 방출시키고, 방출된 N-글리칸을 정제하고, 유도체화시키고, 공지된 방법에 따라 MALDI-TOF-MS에 의해 분석하였다. 구조를 Sf 세포에서 생성된 N-글리칸의 예측된 질량 및 지식을 기초로 하여 피크로 할당하였고, 표준 만화 기호 표현을 이용하여 주석을 달고, 단순성에 대해 넘버링하였다. 상이한 구조의 상대적 정량화는 개별적 과메틸화된 N-글리칸 구조의 동위원소 클러스터로부터 조합된 피크 강도를 모든 주석이 달린 N-글리칸 피크의 전체 강도로 나눔으로써 달성되었다.
Sf-RVN 및 Sf9 세포를 비교하는 경우에 평가해야 할 또 다른 중요한 요인은 이들의 단백질 N-당화 패턴이며, 이는 상이한 세포주에 의해 제공된 패턴이 크게 상이할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명자는 Sf9 및 Sf-RVN 세포를 AcP(-)p6.9hEPO로 감염시키고, 세포-비함유 배지로부터 분비된 hEPO를 정제하고, 전체 N-글리칸을 효소적으로 방출시키고, MALDI-TOF MS에 의해 과메틸화된 생성물을 분석하였다. 결과는 둘 모두의 세포주에 의해 생성된 hEPO에 연결된 N-글리칸의 대다수가 예상된 바와 같이 트리만노실 코어 구조(도 10a의 구조 2 및 3)를 갖는 것을 나타내었다. 본 발명자는 또한 예상된 바와 같이 말단 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 하이브리드-유형 구조의 작은 부분을 관찰하였다(도 10a의 구조 4 및 5). 이들 상이한 구조를 정량함으로써 본 발명자는 Sf-RVN에 의해 제공된 hEPO N-당화 프로파일을 결정하였고, Sf-RVN 세포 생성물이 약간 더 많은 푸코실화된 N-글리칸을 가졌으나 Sf9 세포는 거의 동일하였다(도 10b).
실시예 11. 더 많은 감염성의 배큘로바이러스 프로제니를 생성시킨 Sf - RVN 세포. 재조합 단백질 생성을 위한 숙주로서의 유용성 외에도, Sf9 세포는 배큘로바이러스 스톡의 생성을 위한 최적의 숙주 중 하나인 것으로 널리 간주된다. 따라서, Sf9 및 Sf-RVN 세포에 의해 생성된 감염성 재조합 배큘로바이러스 벡터 프로제니의 양을 비교하는 것이 중요하였다. 이러한 실험은 둘 모두의 세포 유형을 2개의 상이한 Sf-랍도바이러스-비함유 배큘로바이러스 스톡인 AcP(-)p6.9hEPO 및 AcP(-)p6.9hSEAP로 감염시키고, 4개 모두의 감염으로부터 발아된 바이러스 프로제니, 즉, 감염성 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 세포 배양 배지를 수거하고, 실시예 8에 기재된 바와 같이 플라크 검정에서 감염성 바이러스 역가를 비교하는 것을 포함하였다. 3개의 독립적 생물학적 복제물의 결과는 둘 모두의 배큘로바이러스 AcP(-)p6.9hEPO 및 AcP(-)p6.9hSEAP의 작업 스톡이 Sf9 세포에 의해 생성된 것에 비해 Sf-RVN에 의해 생성되는 경우에 약 5-10배 더 높은 역가를 갖는 것을 나타내었다(도 11).
실시예 12. BLAST 검색. Sf 세포 유전체 및 전사체의 생물정보학 검색을 공개적으로 접근 가능한 NCBI BLASTN 언터페이스(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 이용하여 수행하였다. Sf-21 세포주 전사된 서열 어셈블리(Genbank 등록 번호 GCTM00000000.1, BioProjectID 271593 (Kakumani et al., Biol. Direct 10, 1-7, 2015)) 및 스포돕테라 프루기페르다 모충 머리 전사된 서열 어셈블리(Genbank 등록 번호 GESP00000000.1, BioProjectID 318819 (Cinel et al.))를 디폴트 설정으로 megablast를 이용하여 공개된 Sf-랍도바이러스 유전체(Genbank 등록 번호 NC_025382.1)로 질의하였다.
IPLB-SF-21 세포주 전사된 서열 어셈블리(Genbank 등록 번호 GCTM00000000.1, BioProjectID 271593 (Kakumani et al., Biol. Direct 10, 1-7, 2015))에 대한 질의로서 공개된 Sf-랍도바이러스 유전체(Genbank 등록 번호 NC_025382.1)를 이용한 megaBLAST 검색으로부터 획득된 결과가 표 2에 제시된다.
표 2
Figure pct00002
이들 결과는 Sf-21 세포주 전사체가 온전한 어셈블리된 Sf-랍도바이러스 유전체를 포함하는 것을 나타낸다. Sf-21 세포주는 Sf-랍도바이러스로 지속적으로 감염된 것으로 이전에 밝혀졌으므로, 이러한 결과는 예상된 것이다.
미국 국립생물공학 정보센터 BioProject PRJNA318819(Cinel et al.)로부터 획득된 수컷 발아후 스포돕테라 프루기페르다 성체(가을 거염벌레)의 어셈블리된 전체 뇌 유전자 발현 프로파일에 대한 질의로서 공개된 Sf-랍도바이러스 유전체(Genbank 등록 번호 NC_025382.1)를 이용한 megaBLAST 검색으로부터 획득된 결과가 표 3에 제시된다.
표 3
Figure pct00003
놀랍게도, 이들 유기체의 전사체에서 여러 어셈블리된 서열이 검출되었고, 이는 온전한 Sf-랍도바이러스 유전체를 집합적으로 포함한다. 이들 데이터는 모든 Sf 세포주가 유래되는 모충(스포돕테라 프루기페르다) 자체가 Sf-랍도바이러스로 감염된 것을 나타낸다. 따라서, 스포돕테라 프루기페르다로부터 유래된 모든 세포주가 Sf-랍도바이러스로 오염된 이유는 유기체가 첫번째 Sf 세포주가 분리되기 전의 환경에서 상기 바이러스로 자연적으로 감염되었기 때문이며, 세포주(들)가 실험실에서 바이러스로 오염된 것 때문이 아니다.
뚜렷하게 대조적으로, 질의로서 Sf-랍도바이러스 서열을 이용한 Sf-RVN 전사체의 BLAST 검색은 히트(hit)를 발생시키지 않았고, 이는 Sf-RVN 세포가 Sf-랍도바이러스로 오염되지 않는다는 본 발명자의 발견을 추가로 구체화한다. BLAST 검색 결과는 표 4에 요약되어 있다. 이전에 본 발명자의 실험실 및 다른 사람들이 이전에 시험한 모든 Sf 세포주는 Sf-랍도바이러스 오염에 대해 양성인 것으로 밝혀졌으므로, Sf-RVN 세포주의 전사체에서의 Sf-랍도바이러스 서열의 부재는 이들 세포가 모든 이전에 기재된 Sf 세포주가 유래되는 자연 발생 유기체인 스포돕테라 프루기페르다 및 임의의 다른 Sf 세포주와 구조적으로(유전적으로) 상이한 것을 명백히 입증한다. 이러한 구조적 차이는 Sf-RVN 세포가 Sf-랍도바이러스 감염에 민감하다는 사실에 의해 구체화된다.
표 4. Sf - 랍도바이러스에 대한 BLAST 검색 결과
Figure pct00004
실시예 13. Sf - 랍도바이러스에 의한 감염에 민감한 Sf - RVN 세포주. Sf9 세포를 50mL 진탕-플라스크 배양으로 10%(v/v) 우 태아 혈청(Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA)이 보충된 TNM-FH 배지 중 mL 당 1.0 x 106 세포의 시작 밀도로 시딩하였다. 세포를 3일 동안 진탕기 배양기에서 28℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 세포-비함유 상층액을 0.22 uM 필터(CELLTREAT Scientific, Shirley, MA)를 통해 여과시켰다. 이러한 여과액을 상기 바이러스에 대한 Sf-RVN 세포의 민감성을 시험하기 위한 Sf-랍도바이러스 접종물로 사용하였다.
감염성 실험을 위해, Sf-RVN 세포를 25 cm2 플라스크에서 5 mL의 ESF921 배지(Expression Systems, Woodland, CA) 중 2.0 x 106 세포의 밀도로 이중으로 시딩하고, 28℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 세포를 부착시켰다. 이후, 성장 배지를 제거하고, 복제 플라스크 내의 세포를 (1) 10%(v/v) 우 태아 혈청이 보충된 2.5 mL의 TNM-FH 배지로 모의 감염시키거나, (2) 상기 기재된 2.5 mL의 Sf-랍도바이러스 접종물로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 10%(v/v) 우 태아 혈청이 보충된 2.5 mL의 새로운 TNM-FH 배지를 첨가하고, 세포를 28℃에서 또 다른 24시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 후 24시간에서, 1세트의 모의-감염된 세포 또는 Sf-랍도바이러스 접종물-감염된 세포를 3회 세척하고, 수거하였다. 두번째 세트를 28℃에서 추가로 인큐베이션하고, 샘플링하고, 감염 후 72시간에서 연속적으로 계대배양(PO에서 P1)한 후, 샘플링하고, 전체 3회의 계대배양이 수행될 때까지 2회의 추가의 72시간의 인큐베이션 기간 후에 연속적으로 계대배양하였다. 각각의 계대배양 수준에서 획득된 샘플을 사용하여 저속 원심분리에 의해 세포 펠렛을 생성시키고, 전체 RNA를 추출하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 샘플을 RT-PCR에 의해 검정하였다.
임의의 시점에서 모의-감염된 Sf-RVN 세포로부터 획득된 RNA 또는 감염 후 24시간 또는 72시간에서 Sf-랍도바이러스 접종물-감염된 P0 Sf-RVN 세포로부터 획득된 RNA로 Sf-랍도바이러스 특이적 앰플리콘이 관찰되지 않았다(도 13a-13b). 그러나, P1 후 72시간에서 Sf-랍도바이러스 접종물-감염된 Sf-RVN 세포로부터 획득된 RNA로 희미한 앰플리콘이 관찰되었고, 이의 강도는 P2 후 72시간 및 P3 후 72시간에서 획득된 RNA로 점진적으로 증가하였다(도 13a-13b). 이들 결과는 Sf-RVN 세포가 오염된 Sf 세포에 의해 생성된 Sf-랍도바이러스에 의한 감염에 민감한 것을 명백히 입증한다.
실시예 14. 바이러스 비함유의 확립된 T. 니 세포주를 생성시키는데 실패한 통상적인 방법. 본 발명자는 또한 10%(v/v) 우 태아 혈청 및 다양한 농도의 리바비린, 6-아자우리딘, 및 비다라빈을 포함하는 항바이러스 약물의 칵테일로 보충된 TNM-FH 배지에서 폴리클로날 TN-368 세포 집단을 배양함으로써 Tn-노다바이러스-비함유 세포를 분리시키려고 시도하였다. 세포를 ad hoc 연속 계대배양으로 15일 동안 이들 3개의 약물과 함께 배양하고, 샘플을 실시예 16에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 Tn-노다바이러스에 대해 일상적으로 시험하였다. 도 13a-13b에 제시된 바와 같이, Tn-노다바이러스 세그먼트 1 및 2에 해당하는 앰플리콘이 시험된 항바이러스 칵테일의 모든 농도로 배양된 TN-368 세포에 존재하였다(도 13a 및 13b 각각). 따라서, Sf9 세포와 마찬가지로, 본 발명자는 상기 항바이러스 칵테일로 처리된 TN-368 세포의 집단을 이용하여 노다바이러스-비함유 T. 니 세포를 획득할 수 없었다.
실시예 15. 바이러스가 결핍된 확립된 T. 니 세포주를 획득하기 위한 예시적 방법. 항바이러스 약물 칵테일로 처리된 폴리클로날 TN-368 세포 배양물이 Tn-노다바이러스-양성으로 남아 있음을 발견한 후, 본 발명자는 바이러스-비함유 세포주를 획득하기 위한 개시된 방법을 이용하였다. 이러한 예시적 방법의 구현예는 제한 희석에 의해 단일한 TN-368 세포를 분리시켜 단일한 세포를 분리시키고, 분리된 세포를 10%(v/v) 우 태아 혈청 및 200 μg/mL의 리바비린이 보충된 TNM-FH 배지 중에 96-웰 플레이트에 시딩하여 제1 배양 조성물을 형성시키는 것을 포함하였다. 제1 배양 조성물을 ad hoc 증폭으로 약 1개월 동안 배양하여 점진적으로 큰 배양물을 생성시키고, 25 cm2 플라스크 수준을 달성한 후, 샘플을 실시예 16에 기재된 바와 같이 RT-PCR 및 이후 네스티드 PCR에 의해 Tn-노다바이러스에 대해 시험하였다. Tn-노다바이러스가 결핍된 클론(도 14a, 레인 CL#3)을 항바이러스 약물이 결핍된 배지로 옮겨 제2 배양 조성물을 형성시켰다. Tn-NVN 계대배양 0(P0)으로 명명된 클론을 혈청-비함유 ESF 921 배지에 적합화시키고, 현탁액으로 성장시켰다. Tn-NVN 세포주를 이후 상기 제2 배양 조성물 및 성장 양식으로 유지시켰다.
실시예 16. Tn - 노다바이러스 -특이적 역전사 - PCR (RT- PCR )/ 네스티드 PCR . 1 x 106개의 세포를 함유하는 TN-368 및 Tn-NVN 배양물의 샘플을 수거하고, 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 세포-비함유 상층액을 0.22 μm 필터(CELLTREAT Scientific, Shirley, MA)를 통해 여과시킨 후, 4℃에서 22시간 동안 131,000 x g에서 초원심분리시켰다. 전체 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNASolv 시약(Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA)을 이용하여 저속 세포 및 고속 세포-비함유 펠렛 둘 모두로부터 추출하였다. 이후, RNA를 정량하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 ProtoScript II First Strand cDNA 합성 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA) 및 Noda-7로 명명된 Tn-노다바이러스-특이적 프라이머(SEQ ID NO:24)를 이용한 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 동등한 양의 각각의 cDNA 제조물을 Taq DNA 중합효소, ThermoPol 반응 완충액(New England Biolabs), 및 Tn-노다바이러스 RNA 세그먼트 1-(Noda-1; SEQ ID NO:19 및 Noda-2; SEQ ID NO:20) 또는 세그먼트 2-(Noda-6; SEQ ID NO:23 및 Noda-7; SEQ ID NO:24) 특이적 프라이머 쌍을 이용한 네스티드 PCR에 사용하였다. 반응 혼합물을 3분 동안 94℃에서 인큐베이션하고, 30초 동안 94℃, 1분 동안 60℃, 및 1분 동안 72℃에서 35회 반복하고, 최종적으로 10분 동안 72℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 1 μL의 각각의 일차 PCR을 Tn-노다바이러스 RNA 세그먼트 1-(Noda-1i; SEQ ID NO:21 및 Noda-2i; SEQ ID NO:22) 또는 세그먼트 2-(Noda-6i; SEQ ID NO:25 및 Noda-7i; SEQ ID NO:26) 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 동일 조건하에서 네스티드 PCR에 대한 주형으로 사용하였다. RT-PCR 및 RT-PCR 및 이후 네스티드 PCR 생성물을 표준 방법에 따라 에티디움 브로마이드 염색과 함께 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 이들 검정에 사용된 각각의 프라이머의 서열이 표 5에 제시된다.
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실시예 17. 검출 가능한 Tn - 노다바이러스를 갖지 않는 Tn - NVN 세포 . 전체 RNA를 다양한 계대배양 수준에서 Tn-NVN으로부터 분리시키고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 RT-PCR, 및 이후 Tn-노다바이러스 세그먼트 1(도 15a) 또는 2(도 15b)에 특이적인 프라이머를 이용한 네스티드 PCR에 의해 Tn-노다바이러스의 존재에 대해 검정하였다. Tn-노다바이러스-특이적 RT-PCR/네스티드 PCR 결과는 Tn-NVN 세포가 임의의 항바이러스 약물의 부재하에서 적어도 55회의 연속적 계대배양 동안 검출 가능한 Tn-노다바이러스를 갖지 않은 것을 입증하였다(도 15a-15c). 본 발명자는 또한 계대배양 55에서 Tn-NVN 세포로부터 세포-비함유 배지(CFM)를 초원심분리시킴으로써 획득된 펠렛 분획으로부터 전체 RNA를 분리시키고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 Tn-노다바이러스-특이적 RT-PCR/네스티드 PCR을 이용하여 Tn-노다바이러스를 검정하는데 이를 사용하였다. 도 15c에 제시된 바와 같이, TN-368 세포 및 TN-368 세포-비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에 해당하는 레인에서 Tn-노다바이러스 앰플리콘이 관찰되었다. 대조적으로, Tn-NVN 세포-비함유 배지 펠렛으로부터 분리된 RNA에서 Tn-노다바이러스 앰플리콘이 검출되지 않았다. 도 15a-15c에 제시된 모든 결과는 항바이러스 약물의 부재하에서 배양된 세포로부터의 RNA를 이용하여 획득하였다. 종합적으로, 이들 결과는 임의의 항바이러스 약물의 부재하에서 55회의 계대배양의 과정에 걸쳐 Tn-NVN 세포 또는 세포-비함유 배지에서 검출 가능한 Tn-노다바이러스 RNA가 존재하지 않은 것을 입증하였고, 이는 이들 세포가 Tn-노다바이러스-비함유인 것을 나타낸다.
실시예 18. 미코플라스마 검출. 본 발명자는 또한 제조업체의 프로토콜에 따라 ATCC(Manassas, VA)로부터의 Universal Mycoplasma Detection 키트를 이용하여 미코플라스마에 대해 약 105개의 Tn-NVN, 또는 TN-368 세포를 함유하는 샘플을 시험하였다. 이러한 PCR-기반 검정은 세포 배양의 오염물질로 흔히 발견되는 8개의 종을 포함하는 60개가 넘는 상이한 미코플라스마, 아콜레플라스마, 스피로플라스마 및 우레아플라스마 종의 16S rRNA 유전자에서 보존된 서열에 상보적인 프라이머를 사용한다. 도 16에 제시된 결과는 TN-368 또는 Tn-NVN 세포가 미코플라스마로 검출 가능하게 오염되지 않은 것을 입증하였다. 둘 모두의 경우에서, PCR 생성물의 부재는 대조군 주형으로 스파이킹(spiking)된 용해질을 이용하여 수행된 PCR에서 예상 크기의 앰플리콘이 관찰됨에 따라 곤충 세포 용해질에 의한 PCR 반응의 억제로 인한 것이 아니었다(도 16, 레인 Tn-NVN (+) 및 TN-368 (+)).
실시예 19. Tn - NVN 및 TN-368 세포의 세포 성장 특성, 형태, 및 직경 . 본 발명자는 실시예 7에 기재된 기술을 이용하여 배양 밀도, 직경, 및 형태를 포함하는 TN-368의 일반적 특성에 대해 Tn-NVN 세포의 일반적 특성을 비교하였다. 결과는 Tn-NVN 및 TN-368 세포가 ESF-921 배지에서 병행 진탕 플라스크 배양물로 시딩된 후 5일의 과정에 걸쳐 사실상 동일한 평균 밀도를 달성한 것을 나타내었다(도 17a). 결과는 또한 이들 세포 배양 실험의 과정 동안 Tn-NVN 및 TN-368 세포의 평균 직경(도 17b) 또는 형태(도 17c)에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 전반적으로, 이들 결과는 본 연구에서 시험된 Tn-NVN 및 TN-368 세포의 일반적 특성이 동일하거나 실질적으로 동일한 것을 입증하였다.
실시예 20. 거의 동일한 수준의 재조합 단백질을 생성시키는 Tn - NVN 및 TN-368 세포. 본 발명자는 또한 실시예 9에 기재된 바와 같이 β-gal, hSEAP, 및 hEPO를 이용하여 Tn-NVN 및 TN-368 세포에 의해 지지된 배큘로바이러스-매개 재조합 단백질 생성의 수준을 비교하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이 각각의 재조합 배큘로바이러스의 Tn 노다바이러스-비함유 작업 스톡이 제조되고, 이들 연구에 사용된 것을 강조하는 것이 중요하다.
E. 콜리 β-gal 발현 실험은 4일의 감염 과정에 걸쳐 Tn-NVN 및 TN-368 세포에 의해 생성된 세포내 효소 활성 수준(도 18a) 또는 전체 세포내 β-gal 단백질(도 18b 및 18c)에서 유의한 차이가 없음을 나타내었다. 또한, 본 발명자는 효소 활성의 수준 및 면역반응성 세포내 β-gal 둘 모두가 이전 시점에 비해 감염 후 3-4일에 감소한 것을 인지하였으며, 이는 아마 이들 감염 이후의 시기에서의 배큘로바이러스-유도된 세포독성을 반영한다.
감염 4일의 과정에 걸친 hSEAP 생성 및 분비의 본 발명자의 분석은 본질적으로 동일한 결과를 발생시켰으며, 이는 Tn-NVN 및 TN-368 세포에 의해 생성된 hSEAP 활성 또는 면역반응성의 분비된 hSEAP 단백질의 수준에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않는다(도 19a-19c).
최종적으로, 본 발명자는 본 발명자가 4일의 감염 동안 Tn-NVN 및 TN-368 세포에 의한 hEPO 생성 및 분비의 수준을 비교한 경우에 동일한 일반적인 결과를 획득하였다(도 20a-20b). 이들 결과는 Tn-NVN 및 TN-368 세포가 동일하거나 실질적으로 동일한 수준으로 3개의 상이한 재조합 단백질을 생성하고 분비하는 것을 입증하였다.
실시예 21. Tn - NVN 및 TN-368 세포의 N - 글리칸 분석 . 본 발명자는 실시예 10에 기재된 바와 같이 Tn-NVN 및 TN-368 세포의 N-당화 프로파일을 분석하였다. Tn-NVN 및 TN-368 세포에 의해 생성된 hEPO로부터 분리된 N-글리칸의 MALDI-TOF-MS 분석은 이들이 본질적으로 동일한 당화 패턴을 제공한 것을 나타내었다. 둘 모두의 세포주로부터의 hEPO에 대한 N-글리칸의 대다수는 바이만노실 코어 구조였으나(도 21a, 구조 1), 본 발명자는 또한 말단 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖거나 갖지 않는 푸코실화된 트리만노실 코어 구조의 작은 비율을 관찰하였다(도 21a, 구조 3 및 6).
실시예 22. Sf - 랍도바이러스로 감염된 봄빅스 모리로부터 유래된 BmN 세포주. 인시목 곤충 봄빅스 모리로부터의 세포가 오염되었는지의 여부를 연구하기 위해, 본 발명자는 Sf-랍도바이러스의 존재에 대해 BmN 세포주를 분석하였다. 본 발명자의 실험실 세포 은행으로부터의 BmN 세포(ATCC-CRL 8910)의 바이알을 해동시키고, 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 전체 RNA를 추출하고, 정량하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 검정하였다. RT-PCR을 이러한 경우 독립적 RT-PCR이 6개 모두의 Sf-랍도바이러스 유전자에 특이적인 프라이머(표 6)로 수행한 것을 제외하고는 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다.
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도 22에서 관찰되는 바와 같이, 6개 모두의 Sf-랍도바이러스 유전자(N, P, M, G, X, 및 L)에 해당하는 앰플리콘이 관찰되었다. 이들 결과는 S. 프루기페르다의 가까운 친척인 인시목 곤충 봄빅스 모리로부터 유래되는 BmN 세포주가 또한 Sf-랍도바이러스로 감염된 것을 입증하였다.
집합적으로, 본 발명자의 결과는 많은 확립된 세포주가 바이러스로 감염될 수 있음을 암시한다. 이는 이들 세포주가 유래되는 유기체의 지속적인 바이러스 감염으로 인한 것일 수 있다. 본 발명자의 결과는 또한 확립된 세포주를 획득하기 위한 개시된 방법이 광범위하게 적용 가능함을 입증한다.
인간 및 수의 환자에서의 BICS-유래 생물제제의 사용에 대한 규제 기관 승인의 최근의 급증은 진정한 상업적 생물제제 제조 플랫폼으로서의 BICS의 출현에서 결정적으로 중요한 이정표이다. 그러나, Sf 및 Tn 세포를 포함하는 배큘로바이러스 벡터에 대한 숙주로서 가장 빈번히 사용되는 곤충 세포주에서 감염성 바이러스 오염물질의 발견은 BICS-생성 생물제제의 안전성에 관한 의문을 제기하였다. 이러한 상황에서, Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스가 인간 또는 수의 환자에게 명백한 위협을 가한다는 증거가 없다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고, 임의의 생물학적 제조 플랫폼에서 임의의 우발적인 제제의 확인에 대한 명백한 대응은 본질적으로 더 안전한 시스템을 만들기 위해 상기 제제를 제거하는 것이다. 따라서, 본 발명자는 Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스 각각으로 오염되지 않은 Sf-RVN 및 Tn-NVN을 발명하였다. 사실, 이들 세포주 둘 모두는 이들 최근에 확인된 바이러스 오염물질 중 어느 하나의 임의의 검출 가능한 흔적이 결여되어 있다.
이러한 결론은 본 발명자의 실험실에서 적어도 55회의 계대배양의 과정에 걸쳐 Sf-RVN 세포 및 세포-비함유 배지가 검출 가능한 Sf-랍도바이러스를 갖지 않았고, Tn-NVN 세포 및 세포-비함유 배지가 검출 가능한 Tn-노다바이러스 RNA를 갖지 않은 것을 입증하기 위해 본 발명자가 사용한 고도로 민감한 RT-PCR/네스티드 PCR 검정의 결과를 기초로 한다. 이는 여전히 진행중이고, 이 시점에서 각각 170회 및 100회의 연속적 계대배양의 과정에 걸쳐 Sf-RVN에서 Sf-랍도바이러스 또는 Tn-NVN 세포에서 Tn-노다바이러스의 흔적을 나타내지 않은 본 발명자의 Sf-랍도바이러스-특이적 및 Tn-노다바이러스-특이적 RT-PCR/네스티드 PCR 시험 요법의 기간에 의해 강하게 뒷받침된다. 이들 세포가 낮은 수준의 Sf-랍도바이러스 또는 Tn-노다바이러스 오염을 갖는 경우, 본 발명자는 이들 바이러스가 특히 Sf 세포 배양에서 보고된 높은 수준의 오염(2 X 109 입자/세포외 성장 배지 mL)을 고려할 때 상당히 신속히 검출 가능한 수준으로 복제할 것으로 예상한다. 또한, 본 발명자는 Sf-21 세포에 대한 공개적으로 이용 가능한 유전체 및 전사체 데이터(Geisler and Jarvis, 2016) 뿐만 아니라 본 발명자의 Sf-RVN 세포의 대량의 병행 시퀀싱에 의해 획득된 본래의 유전체 및 전사체 데이터베이스(표 2)의 생물정보학적 분석에 의해 본 발명자의 Sf-RVN 결과를 확인하고 확장시켰다.
본 발명의 교시내용으로부터의 또 다른 결론은 BICS에 대한 대안적 숙주로서의 잠재성의 맥락에서 Sf-RVN 및 Tn-NVN 세포의 본질적 특성이 현장에서 널리 사용됨에 따라 BICS에 대한 "최적 표준" 숙주로 본 발명자가 사용한 Sf9 및 TN-368 세포의 본질적 특성과 각각 매우 유사하다는 것이다. 본 발명자는 본 발명자의 Sf-RVN 또는 Tn-NVN 세포가 미코플라스마로 검출 가능하게 오염되지 않은 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 표준 세포 배양 유지 프로토콜의 파라미터 내에서 시험된 Sf-RVN 및 Sf9 및 Tn-NVN 및 TN-368 세포 각각의 기본 성장 특성이 구별할 수 없었던 것을 발견하였다.
본 발명의 교시내용으로부터의 또 다른 결론은 Sf-RVN 및 Tn-NVN 세포가 적어도 BICS의 숙주 성분으로서뿐만 아니라 이들의 바이러스-오염된 대응물로서 기능할 수 있다는 것이다. 이러한 결론은 Sf-RVN 및 Sf9 및 Tn-NVN 및 TN-368 세포가 각각 대략 동일한 수준의 재조합 단백질 및 당단백질 생성, 분비, 및 효소 활성을 지지한다는 발견에 의해 뒷받침되었다. 형식적으로, 이러한 결론은 본원에서 모델로 사용된 3개의 상이한 생성물에만 적용될 수 있다. 본 발명자는 본 발명의 분석을 확대하기 위해 세포내 박테리아 단백질 및 2개의 분비된 인간 N-당단백질을 사용하였으나, Sf-RVN 및/또는 Tn-NVN 세포가 향후에 더 높거나 더 낮은 수준의 다른 재조합 단백질을 생성하는 것으로 밝혀질 가능성이 있다. 본 발명자는 또한 Sf-RVN 및 Sf9 및 Tn-NVN 및 TN-368 세포가 각각 거의 동일한 N-당화 패턴을 제공한 것을 발견하였다. Sf-RVN 및 Sf9 및 Tn-NVN 및 TN-368 세포가 거의 동일한 N-당화 패턴을 제공하였다는 결론은 분석에 사용된 모델인 hEPO에만 공식적으로 적용된다. 그러나, 재조합 단백질 생성 수준에서의 잠재적 변화에 비해, Sf-RVN 및 Sf9 및 Tn-NVN 및 TN-368은 다른 생성물을 차별적으로 N-당화시킬 가능성이 훨씬 덜한데, 이는 제공된 생성물로 획득된 분석 결과가 내인성 N-글리칸 처리 능력을 반영하기 때문이다. 이들이 존재하는 경우, 상이한 세포주에 의한 hEPO 당화의 본 발명의 분석에서 N-글리칸 처리의 정도에서의 차이가 검출되었을 것이다.
본원에서 시험된 Sf-RVN 및 Sf9 세포의 또 다른 중요한 기능적 능력은 감염성 재조합 배큘로바이러스 프로제니를 생성하는 이들의 능력이었다. 놀랍게도, 본 발명자는 Sf-RVN 세포가 Sf9 세포와 비교하여 2개의 상이한 재조합 배큘로바이러스를 증식시키는데 사용되는 경우에 더 높은 수준의 감염성 프로제니(일부 경우에, 5 내지 10배 만큼)를 생성시키는 것을 발견하였다(도 11). 이러한 차이는 통계적으로 유의하였고, Sf9 세포에 비해 Sf-RVN 세포의 명백한 장점을 입증한다.
개시된 교시내용은 다양한 적용, 방법, 및 구성을 참조로 하여 기재되었으나, 본원의 교시내용을 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 상기 예는 본 발명의 교시내용을 더 잘 예시하기 위해 제공되며, 본원의 교시내용의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 또한, 다양한 현재 뜻하지 않거나 예기치 못한 대안, 변형, 변화 또는 개선이 이후에 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 또한 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 교시내용의 특정 양태는 하기 청구범위에 비추어 추가로 이해될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GLYCOBAC, LLC MAGHODIA, Ajay GEISLER, Christoph JARVIS, Donald <120> VIRUS-FREE CELL LINES AND METHODS FOR OBTAINING SAME <130> GCB001PCT <150> 62/249,288 <151> 2015-11-01 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 1 ggcaaggctg tttggattac tgacc 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 2 acaggtttgc agctaaggag gaca 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 3 tggcgaggga ctgcttacag aagg 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 4 cacagccggg ggtgcaatca 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 5 acaggagatg cggaagaccc ctc 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 6 atctcgcagg tgggacaacc cc 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 7 atatgagagc cccagacaca cagcc 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 8 acgatgtggt gagagaaaca cctcct 26 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 9 cacatctaga gcttgaagac c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 10 accatcacag ccagtgctg 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 11 gagtgttgat acatgtcg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 12 gtgaccaacc tcttccag 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 13 gctctagtgt gcgactgtg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 14 gctcagacag gttcttattg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 15 gttgaaccct aggagaactc 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 16 gtatgcaggt ggttgagg 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 17 gctccaatcc tctctcctat 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Sf-rhabdovirus <400> 18 gactgagagg gaactcaa 18 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 19 gggaaccgag ttacacgcgc attgc 25 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 20 ccgccctaag ttgtagttgt tgggacgg 28 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 21 gatgctgact caccattcac c 21 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 22 ccgataagcc tagcgttgac agattg 26 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 23 gccttcgcac cacctgactt c 21 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 24 gccaggaatg ttgcttgcaa cagc 24 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 25 catccagatc cgatcaagtg tc 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Alphanodavirus <400> 26 cacggatgac aatggtgtcc 20

Claims (30)

  1. 바이러스의 결핍을 특징으로 하는, 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 유래된 세포주로서, 세포주가 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포와 구조적 및 기능적으로 상이한, 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 세포주가 바이러스에 감염된 곤충으로부터 유래되는 세포주.
  3. 제2항에 있어서, 세포주가 인시목(lepidopteran) 곤충으로부터 유래되는 세포주.
  4. 제3항에 있어서, 인시목 곤충이 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori)를 포함하는 세포주.
  5. 제4항에 있어서, 세포주가 스포돕테라 프루기페르다 세포주로부터 유래되는 세포주.
  6. 제5항에 있어서, Sf-랍도바이러스의 결핍을 추가 특징으로 하는 세포주.
  7. 제6항에 있어서, 세포주 및 Sf9 세포가 동일 조건하에서 증식되는 경우 Sf9 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포 밀도, 배가 시간, 평균 세포 직경, 형태, 및 N-당화 패턴을 추가 특징으로 하는 세포주.
  8. 제6항에 있어서, 세포주 및 Sf9 세포가 동일 조건하에서 AcP(-)p6.9hEPO 또는 AcP(-)p6.9hSEAP로 감염되는 경우 Sf9 세포에 비해 감염성 재조합 배큘로바이러스 입자의 증가된 생성을 추가 특징으로 하는 세포주.
  9. 제6항에 있어서, 세포주가 Sf-랍도바이러스(Sf-rhabdovirus) 감염에 민감한 세포주.
  10. 제10항에 있어서, 세포주 및 Sf9 세포가 동일 조건하에서 증식되는 경우 Sf9 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포 밀도, 배가 시간, 평균 세포 직경, 형태, 및 N-당화 패턴을 추가 특징으로 하는 세포주.
  11. 바이러스의 결핍을 특징으로 하는, 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 유래된 세포주.
  12. 제12항에 있어서, 세포주가 바이러스-오염된 트리코플루시아 니 세포로부터 유래되는 세포주.
  13. 제13항에 있어서, 알파노다바이러스(alphanodavirus)의 결핍을 추가 특징으로 하는 세포주.
  14. 제13항에 있어서, 트리코플루시아 니 세포주가 TN-368 세포주를 포함하는 세포주.
  15. 제14항에 있어서, 세포주 및 TN-368 세포가 동일 조건하에서 증식되는 경우 TN-368 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 세포 밀도, 배가 시간, 평균 세포 직경, 형태, 및 N-당화 패턴을 추가 특징으로 하는 세포주.
  16. 바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 세포를 분리시키는 단계;
    분리된 세포와 항바이러스 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 조합하여 제1 배양 조성물을 형성시키는 단계;
    세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제1 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 다수의 세포를 생성시키는 단계;
    다수의 세포 또는 세포 배양 배지의 일부를 분리하고, 바이러스의 존재 또는 부재에 대해 시험하는 단계;
    다수의 세포의 적어도 일부와 항바이러스 화합물이 없는 세포 배양 배지를 조합하여 제2 배양 조성물을 형성시키는 단계; 및
    세포가 성장하고 분열하기에 적합한 조건하에서 제2 배양 조성물을 인큐베이션함으로써 바이러스 비함유 세포주를 획득하는 단계를 포함하는,
    바이러스-오염된 유기체 또는 바이러스-오염된 세포로부터 유래된 바이러스 비함유 세포주를 획득하기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 바이러스가 Sf-랍도바이러스 또는 알파노다바이러스를 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 세포주가 곤충으로부터 유래되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 곤충이 인시목 곤충을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 인시목 곤충이 스포돕테라 프루기페르다, 트리코플루시아 니, 또는 봄빅스 모리를 포함하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 세포주가 바이러스-오염된 일차 세포로부터 유래되는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 세포주가 바이러스로 오염된 세포주로부터 유래되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스-오염된 세포주가 Sf-21 세포 또는 Sf9 세포를 포함하고, 바이러스가 Sf-랍도바이러스를 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 세포주가 알파노다바이러스로 오염된 트리코플루시아 니 세포주를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포주가 TN-368, BTI-Tn-5B1-4, 또는 Tni PRO 세포를 포함하는 방법.
  26. 제16항에 있어서, 시험이 (a) RT-PCR, (b) RT-PCR 및 네스티드 PCR(nested PCR); (c) 정량 RT-PCR; 또는 (d) 항체-기반 검출 기술을 포함하는 방법.
  27. 제16항에 있어서, 항바이러스 화합물이 뉴클레오시드 유사체인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 리바비린(ribavirin), 6-아자우리딘(6-azauridine), 비다라빈(vidarabine), 아시클로버(acyclovir), 9-/3-D-아라비노푸라노실아데닌(Ara-A), 시토신 아라비노스, 아데닌 아라비노시드, 및 구아닌 7-N-옥사이드(G-7-Ox) 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 6-아자우리딘인 방법.
  30. 제16항에 있어서, 바이러스가 Sf-랍도바이러스 또는 알파노다바이러스를 포함하고, 분리 단계가 제한 희석을 포함하고; 확립된 세포주가 스포돕테라 프루기페르다 또는 트리코플루시아 니로부터 유래되고; 항바이러스 화합물이 6-아자우리딘이고; 시험 단계가 (a) RT-PCR 또는 (b) RT-PCR 및 네스티드 PCR을 포함하는 방법.
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