CN110423726B - 无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及昆虫细胞系，公开了一株无Sf‑RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。该细胞株是从商业来源Sf9细胞筛选得到，命名为Sf9‑ZY细胞株，其生物保藏号为CCTCC NO:C201952。杆状病毒在Sf9‑ZY细胞株增殖水平和蛋白表达量检测表明，Sf9‑ZY细胞株可替代Sf9细胞作为昆虫细胞‑杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，应用于表达重组蛋白制备生物制品。本发明提供的Sf9‑ZY细胞株解决了昆虫细胞‑杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞污染Sf‑RV病毒问题，保证了生物制品的安全性。

Description

无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及昆虫细胞系，具体涉及一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。
背景技术
在1969年Vaughn等建立了昆虫细胞系，分离于雌性草地夜蛾蛹的卵巢组织，当时的培养基中补加2.6％的热灭活的昆虫血，建立后，这个细胞系提供给了英国牛津大学的NERC无脊椎动物病毒学部，在那里这个细胞系被适应到了补加新生牛血清的培养基中，从而取代了补加昆虫血的培养基，此时的细胞株称为IPLB-Sf-21-AE，后来又提供给了美国德克萨斯A&M大学，在那里被克隆化，应用于蛋白表达体系。Sf9细胞株是由G.E.Smith和C.L.Cherry从IPLB-Sf-21-AE克隆而来，细胞形态更加均一，对多角病毒敏感，适用于分泌蛋白的表达，而且采用无血清培养基生长良好。
但2014年Ma和他的同事发现，每个Sf细胞系，包括两个商业来源Sf21和Sf9细胞，被污染了一种新的弹状病毒Sf-rhabdovirus(Sf-RV)，这对基因工程疫苗和抗体生产带来的安全性威胁。对Invitrogen公司来源的Sf9细胞进行Sf-RV检测，结果表明也污染了这种病毒。
昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)是基因工程四大表达系统之一，是一个以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的表达系统，它具有安全、高效、容量大、重组病毒易于筛选、表达产物能进行折叠和修饰具有生物活性，等特点，它是一种真核表达系统，具有重组蛋白表达量高，能够在一个载体上表达多种蛋白，容纳较大片段的外源DNA插入，细胞培养易于大规模获得蛋白等特点，在基因工程疫苗和抗体方面具有广阔的应用前景，广泛的应用于生物制品的生产。
然而，在Sf细胞系中发现的新弹状病毒(Sf-RV)引起了人们对昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产的生物制剂安全性的担忧。虽然截止目前，并没有证据表明Sf-RV病毒对人类或动物构成威胁，然而，在生物制品制备过程中一旦发现了任何外源病毒污染，都必须采取一切办法将它去除，保证生物制品的安全性。
本发明对无Sf-RV病毒的Sf9细胞株的研究属于首次。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。
本发明第一方面提供一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株，其生物保藏编号为CCTCCNO:C201952，命名为Sf9-ZY细胞株。
本发明第二方面提供一种上述无Sf-RV污染的Sf9细胞株的筛选方法，具体技术方案如下：
(1)制备单细胞悬液：将商业来源的Sf9细胞在无血清昆虫细胞培养基(Gibco Sf-900ⅢSFM)于27℃恒温培养箱中静止培养传代1代后，采用传代培养2-3天的Sf9细胞或细胞融合度大于95％时，加入无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，轻轻吹打瓶底细胞，制备细胞悬液，采用自动细胞计数仪，对细胞悬液进行计数，保证细胞活率在98％以上；
(2)细胞悬液稀释：取Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，补加2％小牛血清，将细胞悬液稀释至1×105个/ml后，经1:100～1:10000系列稀释，至每毫升10个细胞，分别选1×103个/ml、1×102个/ml、1×10个/ml细胞，接种96孔板，每孔种0.1ml，用封口膜将96孔板封口，扫描拍照后，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(3)细胞培养：每间隔2～3天将96孔板扫描拍照，观察集落形成情况，每7天更换补加2％小牛血清的Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，培养直至第28天；
(4)细胞传代：取上述步骤(3)中96孔板中有单个集落生长的孔，用微量移液器将集落细胞轻轻吹打，原孔培养，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(5)6孔板传代：取上述步骤(4)中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移至6孔板，每孔补加2ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(6)细胞培养、传代扩增及冻存：取上述6孔板中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，转至25cm2细胞培养瓶，每孔细胞悬液补加3ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；将培养3～4天的25cm2细胞培养瓶中细胞，轻轻吹打下来，转移至50ml转瓶中，接种密度为5×105个/ml，置27℃恒温培养箱中转动培养，转速为100～120rpm；取转瓶培养的细胞，用自动细胞计数仪计数，测定细胞活率，保证活率大于90％，将细胞800rpm室温离心5分钟，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞密度在1×107个/ml，分装至冻存管，梯度降温后，移至液氮罐长期保存；
(7)筛选出的细胞株命名为Sf9-ZY细胞株，建立三级细胞库。
对上述步骤筛选出Sf9-ZY细胞株的第15代、20代、25代细胞进行Sf-RV病毒检测，均无Sf-RV病毒污染；对Sf9细胞株的第15代、20代、25代细胞进行Sf-RV病毒检测，均有Sf-RV病毒污染。
Sf9-ZY细胞和Sf9细胞的增殖特性表明，培养前4天Sf9-ZY细胞和Sf9细胞均处于对数生长期，细胞倍增时间均在23～28小时之间，细胞直径均在14～16μm；且Sf9-ZY细胞的倍增时间(23～26h)短于Sf9细胞(26～28h)，细胞密度高于Sf9细胞，Sf9-ZY细胞活力优于Sf9细胞。
本发明第三方面提供上述Sf9-ZY细胞株在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)中的应用。
SF9-ZY细胞和Sf9细胞繁殖两种不同类型的重组杆状病毒(HPV16L1和HPV58L1)时，重组杆状病毒在SF9-ZY细胞生物的传染性比SF9细胞略高；在表达杆状病毒HPV16型和HPV58型L1蛋白上，Sf9-ZY细胞与Sf9细胞无明显差异，Sf9-ZY细胞完全可以替代Sf9细胞作为昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，用于表达重组蛋白制备生物制品。
与现有技术相比，本发明取得了以下有益的技术效果：
本发明针对商业来源的Sf9细胞株采用上述筛选方法，在其单细胞悬液阶段加入一定浓度小牛血清，诱导筛选出无病毒污染细胞株，其生物保藏编号为CCTCC NO:C201952，命名为Sf9-ZY细胞株，并对这株细胞的生长特性进行了研究，Sf9-ZY可替代Sf9细胞作为昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，为其在生物制品用于疫苗制备上奠定了基础，保证了生物制品的安全性。
生物材料保藏信息：
本发明提供的无Sf-RV污染细胞株，已于2019年4月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。该细胞株保藏编号为CCTCCNO:C201952，分类命名为Sf9-ZY细胞株。
附图说明
图1为本发明中细胞筛选方法及扩增流程图；
图中，A为低密度接种培养板，1×103个/ml、1×102个/ml、1×10个/ml细胞，接种96孔板，0.1ml/孔，用细胞筛选系统扫描并拍照；B为每间隔2～3天用细胞筛选系统扫描并拍照，检查是否有细胞集落生长；C为培养7～28天，选择有细胞集落生长的孔，原孔传代；D为96孔板细胞培养3～4天后，传至6孔板；F为6孔板细胞培养3～4天后，传至25cm2细胞培养瓶；E为25cm2细胞瓶细胞培养3～4天后，传至转瓶，接种密度5×105个/ml；
图2为本发明中筛选细胞Sf9-ZY扫描图片；
图3为本发明中Sf9-ZY细胞株与Sf9细胞株的15代/20代/25代的Sf-RV病毒检测图；
图4为本发明中Sf9-ZY细胞株与Sf9细胞株的细胞增殖特性图；
图5为本发明中杆状病毒在Sf9-ZY细胞株与Sf9细胞株的增殖水平图；
图6为本发明中Sf9-ZY细胞株与Sf9细胞株表达HPV16L1和HPV58L1蛋白表达量对比图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等。
所用Sf9细胞购自Invitrogen公司，对该细胞进行筛选和传代，筛选诱导出无Sf-RV病毒污染的细胞株，该细胞株被命名为Sf9-ZY细胞株，生物保藏号为CCTCC NO:C201952。
【实施例1】Sf9-ZY细胞株的筛选方法及Sf-RV病毒检测
1.Sf9-ZY细胞株的筛选方法
1)复苏Sf9细胞
从液氮罐中取出冻存细胞，在37℃水浴中快速晃动，直至冻存管中冰块接近融化，在T25培养瓶中加入2ml，用弯头滴管将冻存管中的细胞转移至培养瓶中，轻轻晃动混匀，室温条件下，在水平的桌面静止贴壁5分钟，将未贴壁的细胞吸出，并补加3～5ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，将T25培养瓶置27℃恒温培养箱中静止培养；
2)Sf9细胞传代1代
采用上述方法复苏的Sf9细胞培养至2-3天时，或细胞融合度大于95％时，对细胞进行传代：移除培养瓶中多余的培养基，加入新Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，用弯头滴管轻轻吹打瓶底细胞，控制吹打力度，刚好能将细胞吹下来为宜，将细胞悬液转移至新的培养瓶中，可按1:3左右的比例进行传代，27℃恒温培养箱中静止培养；
3)单细胞分散
取上述传代培养2-3天的Sf9细胞，或细胞融合度大于95％时，移除培养瓶中多余的培养基，加入新Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，用弯头滴管轻轻吹打瓶底细胞，控制吹打力度，刚好能将细胞吹下来为宜；
4)细胞计数
应用自动细胞计数仪，对细胞悬液进行计数，并测算细胞活率，保证细胞活率在98％以上；
5)细胞悬液稀释
取Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，补加2％小牛血清，将细胞悬液稀释至1×105个/ml，进行系列稀释，至每毫升10个细胞，具体步骤如下：
(a)将消化后细胞稀释至1×105个/ml；
(b)取1×105个/ml细胞悬液100μl，加至10ml(1:100)，成为1×103个/ml；
(c)取1×103个/ml细胞悬液1000μl，加至10ml(1:10)，成为1×102个/ml；
(d)将1×102个/ml细胞悬液1000μl，加至10ml(1:10)，成为1×10个/ml；96孔培养板培养：分别选1×103个/ml、1×102个/ml、1×10个/ml细胞，接种96孔板，每孔种0.1ml，用封口膜将96孔板封口，避免培养液挥发；
6)扫描拍照：将96孔板置细胞筛选系统扫描拍照后，置27℃恒温培养箱中静止培养，每间隔2～3天将96孔板扫描拍照，直至第7天，观察集落形成情况；
7)96孔板换液和培养
用排枪将96孔板中原有液体移除，弃掉，补加新的培养基，0.1ml/孔，置27℃恒温培养箱中静止培养，每间隔2～3天将96孔板扫描拍照，直至第14天，期间间隔2～3天扫描拍照，若仍没有集落形成，继续更换补加2％小牛血清的Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，培养直至第28天，96孔板扫描拍照，观察集落形成情况，如图2所示细胞扫描图片，第25天细胞平铺培养孔形成集落；
8)细胞传代
选取96孔板中有单个集落生长的孔，用微量移液器将集落细胞轻轻吹打，原孔培养，置27℃恒温培养箱中静止培养；
9)6孔板传代
取上述96孔板中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打，成细胞悬液，将细胞悬液转移至6孔板，每孔补加2ml培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；
10)25cm2细胞培养瓶传代
取上述6孔板中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打，成细胞悬液，将细胞悬液转移至25cm2细胞培养瓶，每孔细胞悬液补加3ml培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；
11)转瓶传代扩增
将培养3～4天的25cm2细胞培养瓶中细胞，用弯头滴管将细胞轻轻吹打下来，转移至50ml转瓶中，使接种密度达到5×105个/ml，置27℃恒温培养箱中，转速为100～120rpm；
12)细胞冻存
取转瓶培养的细胞，用自动细胞计数仪计数，测定细胞活率，保证活率大于90％，将细胞800rpm室温离心5分钟，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞密度在1×107个/ml，分装至冻存管，梯度降温后，移至液氮罐长期保存。
13)筛选出的细胞株命名为Sf9-ZY细胞株，建立三级细胞库。
2.Sf9-ZY细胞株Sf-RV病毒检测
对Sf9细胞和上述筛选出的Sf9-ZY细胞株进行Sf-RV病毒检测，分别收集第15代，第20代，第25代培养48小时左右的Sf9细胞和Sf9-ZY细胞上清液1ml，采用RNA提取试剂盒提取全基因组RNA，以RNA为模板合成cDNA，cDNA加入聚合酶、dNTP、Sf-RV引物(Mono1/2；Mono1i/2i；G1/G2)经PCR扩增，PCR产物经琼脂糖电泳EB染色鉴定是否存在Sf-RV病毒污染。
本实验中用到的引物如下：
引物Mono1：GGCAAGGCTGTTTGGATTACTGACC；
引物Mono2：ACAGGTTTGCAGCTAAGGAGGACA；
引物Mono1i：ATATGAGAGCCCCAGACACACAGCC；
引物Mono2i：ACGATGTGGTGAGAGAAACACTCCT；
引物G1：CAAGACACAAGAGACATGATCAAGA；
引物G2：GAGGGGATCAAAAGTGCTACTAATA。
具体步骤如下：
1)Sf-RV病毒基因组提取：收集第15代，第20代，第25代培养48小时左右的细胞培养上清液1ml，采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，具体操作步骤按试剂盒说明操作；
2)反转录：准备RNA-Primer预混液，TotalRNA 5μl，250uM Random Primer1μl，补加ddH2O至13μl，轻柔混匀RNA-Primer预混液，短暂离心，置于65℃孵育10min，之后立即置于冰上保存，准备逆转录反应液，将不同试剂组分加入冰上保存的RNA-Primer预混液中，至终体积25μl，轻柔混匀准备好的逆转录反应液，短暂离心，置于37℃温育60分钟，置于85℃孵育5min；
3)PCR：取反转录产物5μl加入Ex Taq酶12.5μl，上下游引物各1μl，加灭菌注射用水5.5μl补足至25μl体系，混匀；将上述PCR反应体系放入基因扩增仪，按下列条件进行扩增，预变性94℃3分钟，然后94℃30秒，55℃60秒，72℃60秒，进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以1000bp DNA Ladder为Marker,电压120V，电泳30分钟；
4)巢式PCR：以引物对Mono1i/2i为引物，以引物对Mono1/2的PCR产物为模板，按照上述的体系和程序进行PCR；
5)判定标准：引物对Mono1/2的产物大小为792bp，引物对G1/G2的产物大小为724bp，巢式PCR引物对Mono1i/2i的产物大小为500bp，引物Mono1/2和Mono1i/2i针对Sf-RVL蛋白，在琼脂糖凝胶上根据1000bp的DNA Ladder所指示的条带大小判断，如果PCR产物大小分布符合以上结果，则判定新弹状病毒检出。
结论：如图3(a)所示，电泳显示应用引物对Mono1/2，Sf9第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均检测出目的条带，Sf9-ZY第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均未检测出目的条带；如图3(b)所示，电泳显示应用引物对G1/G2，Sf9第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均检测出目的条带，Sf9-ZY第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均未检测出目的条带；如图3(c)所示，电泳显示应用引物对Mono1i/2i，Sf9第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均检测出目的条带，Sf9-ZY第15代、20代、25代细胞上清液应用三种引物均未检测出目的条带；由此可知，筛选出的Sf9-ZY细胞株无Sf-RV病毒污染。
【实施例2】Sf9-ZY细胞增殖特性
分别培养Sf9-ZY细胞和Sf9细胞，以6.0×105/ml细胞密度，20ml细胞悬液接种于125ml三角振荡培养瓶中，放置于恒温振荡培养器上，调节转速至120转/分钟，培养温度27±1℃，每间隔24小时取样，直至细胞衰亡，应用自动细胞计数仪测定所述取样活细胞数和细胞直径，细胞倍增时间计算公式如下：Td＝T×Log2/Log(Q2/Q1)，Td＝倍增时间，T＝距末次传代时间，Q1＝细胞接种密度，Q2＝活细胞数。
结果：从图4可以看出，两株细胞Sf9-ZY和Sf9的培养前4天均处于对数生长期，细胞倍增时间均在23～28小时之间，细胞直径均在14～16μm；且Sf9-ZY细胞的倍增时间(23～26h)短于Sf9细胞(26～28h)，细胞密度高于Sf9细胞；培养至第6天两株细胞的细胞密度均达到最高，不再增长并开始凋亡。
结论：由上述结果可知，Sf9-ZY细胞具有作为昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)替代宿主的潜力，与Sf9细胞的生长特性非常相似，并且Sf9-ZY细胞活力优于Sf9细胞，培养至第6天两种细胞的细胞密度均达到最高(＞8×106/ml)，不再增长并开始凋亡。
【实施例3】杆状病毒在Sf9-ZY细胞株增殖水平检测
分别取Sf9细胞和Sf9-ZY细胞，接种6孔板，各培养18组，细胞接种密度8.0×105个/ml，每孔2ml，静止放置10分钟至细胞贴壁，按MOI0.1接种重组杆状病毒(HPV16L1和HPV58L1)，将6孔板置于27±1℃静止培养3～4天，收集细胞，采用免疫荧光法进行毒力检测，步骤如下：
1)吸取SF-900ⅢSFM培养基于96孔细胞培养板中，每孔200μl，加入供试品50μl，混匀后吸取50μl到第2孔中，以此类推5倍稀释，第11孔吸出50μl弃掉，每次试验设空白；
2)每孔中加入50μl浓度为8×105个/ml的Sf9细胞，27℃(±1℃)培养24±2小时；
3)弃去细胞培养基，加200μl/孔磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗1次，弃去液体，拍干，加入预冷的80％丙酮溶液，每孔100μl，2～8℃固定30分钟；
4)弃去板中液体，加入杆状病毒Gp64单抗(14-6995-85，1:200，Invitrogen)，每孔50μl，于2～8℃孵育过夜；
5)弃去板中液体，甩干，用0.05％磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤细胞培养板，重复洗板3次，每次5分钟，拍干；
6)加入二抗孵育液，兔抗鼠FITC荧光标记二抗(A27023，1:200，Invitrogen)，每孔50μl，于37℃孵育1小时；
7)弃去板中液体，甩干，用0.05％PBST洗涤细胞培养板，重复洗板3次，每次5分钟，拍干；
8)用荧光显微镜直接计数荧光灶个数，根据结果计数的结果按照如下计算公式计算：滴度(PFU/ml)＝斑点数(荧光灶数)×稀释度×20。
结果：如图5所示，重组杆状病毒在Sf9-ZY和Sf9两种细胞中的增殖情况，Sf9-ZY细胞培养的杆状病毒滴度均值为8.2lg FFU/ml(σ＝0.48)，较Sf9细胞培养的杆状病毒滴度均值为8.0lg FFU/ml(σ＝0.57)略高。
结论：由上述结果可知，使用SF9-ZY细胞和Sf9细胞繁殖两种不同的重组杆状病毒时，重组杆状病毒在SF9-ZY细胞中的传染性比SF9细胞略高。
【实施例4】杆状病毒在Sf9-ZY细胞株中L1蛋白表达量检测
分别取Sf9-ZY细胞和Sf9细胞，接种6孔板，细胞接种密度2.5×106个/ml，每孔1ml，静止放置10分钟至细胞贴壁，按MOI0.05接种重组杆状病毒(HPV16L1和HPV58L1)第三代(P3)病毒，将6孔板置于27±1℃静止培养3～4天，取样用琼脂糖凝胶电泳法进行L1蛋白表达量检测，步骤如下：
1)细胞培养物：将取样细胞培养物加入苯甲酰磺酰氟，使其终浓度为1mM/L，超声破碎处理10～20次，每次5秒，间隔7秒，制备成细胞匀浆，12000r/min，4℃离心20～30min，吸取上清；
2)吸取上述上清样品和5X上样缓冲液以4:1的比例混合，沸水水浴10分钟；
3)上样：样品上样10μg以上，蛋白Marker作为分子量对照；
4)电泳：加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，电泳时先用80V电压，待样品进入分离胶界面后改用150V电压，电泳过程保持电流稳定；当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿0.1～1厘米处停止电泳；
5)考马斯亮蓝法染色：将胶放置于大平皿中，加入100m l0.5％考马斯亮蓝R-250染色液，37℃染色1小时，之后将胶片放在水中用微波炉煮3次(或直至获得清晰条带)，10分钟/次；
6)分子量：以标准蛋白质的分子量为基准，判定目的蛋白的分子量大小；
7)纯度：取凝胶置薄层扫描仪，以峰面积按归一化法计算。
结果：如图6所示，4Sf9-ZY细胞与Sf9细胞的L1蛋白表达量对比，目的条带在50KD处，在表达杆状病毒HPV16型和HPV58型L1蛋白上，Sf9-ZY细胞与Sf9细胞无明显差异。
结论：Sf9-ZY细胞可替代Sf9细胞作为昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，用于表达重组蛋白。
综上所述，Sf9-ZY和Sf9细胞的生长特性显著相似，并且Sf9-ZY细胞活力优于Sf9细胞，为规避以前使用Sf9和/或其他Sf系细胞因带有外源Sf-RV病毒，而使制造重组蛋白具有潜在安全危险，因此，可用Sf9-ZY替代Sf9细胞作为昆虫细胞Sf9-杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，保证生物制品的安全性。
序列表
<110> 长春卓谊生物股份有限公司
<120> 无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcaaggctg tttggattac tgacc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaggtttgc agctaaggag gaca 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatgagagc cccagacaca cagcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgatgtggt gagagaaaca ctcct 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagacacaa gagacatgat caaga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaggggatca aaagtgctac taata 25

Claims (3)

1.一种无Sf-RV污染的Sf9细胞株的筛选方法，其特征在于：通过以下方法筛选得到：
(1)制备单细胞悬液：将Sf9细胞在无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基于27℃培养箱培养中传代1代后，采用传代培养2-3天的Sf9细胞或细胞融合度大于95％时，加入无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，轻吹打瓶底细胞，制备细胞悬液，采用自动细胞计数仪，对细胞悬液进行计数，保证细胞活率在98％以上；
(2)细胞悬液稀释：取Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，补加2％小牛血清，将细胞悬液稀释至1×105个/ml后，经1:100(v/v)、1:1000(v/v)、1:10000(v/v)系列稀释，至每毫升10个细胞，分别选1×103个/ml、1×102个/ml、1×10个/ml细胞，接种96孔板，每孔种0.1ml，用封口膜将96孔板封口，扫描拍照后，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(3)细胞培养：每间隔2～3天将96孔板扫描拍照，观察集落形成情况，每7天更换补加2％小牛血清的Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，培养直至第28天；
(4)细胞传代：取上述步骤(3)中96孔板中有单个集落生长的孔，用微量移液器将集落细胞轻轻吹打，原孔培养，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(5)6孔板传代：取上述步骤(4)中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移至6孔板，每孔补加2ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；
(6)细胞培养、传代扩增及冻存：取上述6孔板中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，转至25cm2细胞培养瓶，每孔细胞悬液补加3ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；将培养3～4天的25cm2细胞培养瓶中细胞，轻轻吹打下来，转移至50ml转瓶中，接种密度为5×105个/ml，置27℃恒温培养箱中转动培养，转速为100～120rpm；取转瓶培养的细胞，用自动细胞计数仪计数，测定细胞活率，保证活率大于90％，将细胞800rpm室温离心5分钟，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞密度在1×107个/ml，分装至冻存管，梯度降温后，移至液氮罐长期保存；
(7)建立三级细胞库。
2.无Sf-RV污染的Sf9细胞株，其特征在于：其生物保藏号为CCTCCNO:C201952，命名为Sf9-ZY细胞株。
3.权利要求2所述的无Sf-RV污染的Sf9细胞株在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统中的应用。
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