CN106755093B - 果蝇细胞瞬时转染的工艺 - Google Patents
果蝇细胞瞬时转染的工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755093B CN106755093B CN201611082416.8A CN201611082416A CN106755093B CN 106755093 B CN106755093 B CN 106755093B CN 201611082416 A CN201611082416 A CN 201611082416A CN 106755093 B CN106755093 B CN 106755093B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drosophila
- cells
- transfection
- transient transfection
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title abstract description 26
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 129
- 239000004697 Polyetherimide Substances 0.000 description 17
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 16
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100035475 Blood vessel epicardial substance Human genes 0.000 description 1
- 101710174254 Blood vessel epicardial substance Proteins 0.000 description 1
- 102000010831 Cytoskeletal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037414 Cytoskeletal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
- C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种果蝇细胞瞬时转染的工艺，其包括如下步骤：向果蝇细胞悬液中加入转染试剂和含目的DNA的质粒进行瞬时转染，所述转染试剂为阳离子聚合物PEI，所述转染试剂的添加量为0.8～3.2μg/106个果蝇细胞，所述含目的DNA的质粒的添加量为0.2～1.4μg/106个果蝇细胞；培养得到转染有含目的DNA的质粒的果蝇细胞。该果蝇细胞瞬时转染的工艺操作简单，所用的转染试剂成本低，转染迅速。该果蝇细胞瞬时转染的工艺通过操作简单的瞬时转染技术在果蝇细胞中可以以较短的时间实现低成本、高产量的目的DNA表达，并且能将该工艺应用至较大规模的工业生产中，克服了昆虫细胞难以通过瞬时转染工艺进行重组蛋白产业化生产的技术难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种果蝇细胞瞬时转染的工艺。
背景技术
昆虫细胞表达系统已被广泛用于包括组织因子和抗体等在内的众多人类重组蛋白的表达(Kosr等，1997)。果蝇S2(Drosophila Schneider 2)细胞源自果蝇胚胎晚期阶段，在90年代开始用于商业用途，主要是通过转染特定质粒筛选出转染细胞池，并进一步获得细胞系来进行蛋白表达。该技术是杆状病毒表达载体系统(BEVS)的重要可替代技术，已经成功应用于具有活性的受体蛋白、离子通道、细胞骨架蛋白、转录调控因子、激素和凝血因子等的表达(Millar等人，1995；Millar等人，1994；Tota等人，1995；Towers和Sattelle，2002；Mennella等人，2005；Winslow等人，1989；Chang等人，2005；Zomra等人，2007；Vatandoost等人，2012)，且相对于BVES其受重组哺乳动物蛋白过表达的影响更小(Percival等人，1997；Prosise等人，2004)。然而该技术受到了饲养层细胞应用及高成本血清的限制，且整个过程历时数月而产量只能达到几mg/L(Drugmand等人，2012)。近年来基于非病毒质粒载体的瞬时转染技术(TGE)已建立并成功进行哺乳动物细胞核糖体蛋白的快速表达(Geisse，2009；Hopkins等人，2012)。基于昆虫细胞的TGE技术也已引入(Loomis等人，2005；Shen等人，2013)，但目前由于并没有经过工艺优化的高效的TGE操作规程，导致基于TGE技术的昆虫细胞蛋白表达产量不能达到预期效果，限制了TGE技术在昆虫细胞中的应用。
发明内容
基于此，有必要提供一种成本低且有利于提高重组蛋白的表达产率的果蝇细胞瞬时转染的工艺。
一种果蝇细胞瞬时转染的工艺，包括如下步骤：
向果蝇细胞悬液中加入转染试剂和含目的DNA的质粒进行瞬时转染，所述转染试剂为阳离子聚合物PEI(聚醚酰亚胺)，所述转染试剂的添加量为0.8～3.2μg/106个果蝇细胞，所述含目的DNA的质粒的添加量为0.2～1.4μg/106个果蝇细胞；
培养得到转染有含目的DNA的质粒的果蝇细胞。
在其中一个实施例中，所述果蝇细胞悬液为果蝇S2细胞悬液。
在其中一个实施例中，所述果蝇细胞悬液的密度为5×106～100×106个果蝇细胞/mL。
在其中一个实施例中，所述阳离子聚合物的分子量为20～50KD。
在其中一个实施例中，还包括在所述瞬时转染之前对果蝇细胞传代培养的步骤，传代培养时接种的密度为0.5×106～2×106个果蝇细胞/mL。
在其中一个实施例中，传代培养所用的培养基选自Sf900II SFM培养基、Sf900IIISFM培养基、ESF AF培养基、Schneider’s Drosophila培养基、ExpreS2无动物成分培养基、InsectXpress培养基或SF-4Baculo Express ICM培养基。
在其中一个实施例中，传代培养过程中，是于25～32℃、180～400rpm的转速进行摇晃培养。
在其中一个实施例中，在传代培养一段时间细胞达到对数生长期后，离心收集细胞，再使用所述培养基重悬至密度为5×106～100×106个果蝇细胞/mL用作瞬时转染。
在其中一个实施例中，还包括在瞬时转染后0.5～3小时，将转染后的细胞稀释至浓度为2×106～15×106个果蝇细胞/mL，并转移至培养装置中，在25～32℃、180～400rpm的转速条件下进行摇晃培养的步骤。
上述果蝇细胞瞬时转染的工艺操作简单，所用的转染试剂成本低，转染迅速。该果蝇细胞瞬时转染的工艺通过操作简单的瞬时转染技术在果蝇细胞中可以以较短的时间实现低成本、高产量的目的DNA表达，并且能将该工艺应用至较大规模的工业生产中，克服了昆虫细胞难以通过瞬时转染工艺进行重组蛋白产业化生产的技术难题。
附图说明
图1为实施例1中1-14天的活细胞密度变化；
图2为实施例1中1-14天的细胞存活率变化；
图3为实施例1中5天后TNFR-Fc单位产量情况；
图4为实施例1中不同转染密度的细胞5天后TNFR-Fc单位产量；
图5为实施例1中不同PEI分子量的TNFR-Fc单位产量；
图6为实施例1中不同PEI用量的TNFR-Fc单位产量；
图7为实施例1中不同pDNA用量的TNFR-Fc单位产量；
图8为实施例1中，转染1小时后稀释细胞，不同初始培养密度的细胞5天后TNFR-Fc单位产量；
图9为实施例1中10mL体系与300mL体系采用本工艺5天后TNFR-Fc单位产量；
图10为实施例2中5天后EGFP阳性细胞比例情况；
图11为实施例2中不同转染密度的细胞3天后EGFP阳性细胞比例；
图12为实施例2中不同PEI用量的EGFP阳性细胞比例；
图13为实施例2中不同pDNA用量的EGFP阳性细胞比例；
图14为实施例2中10mL体系与300mL体系采用本工艺3天EGFP阳性细胞比例。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的果蝇细胞瞬时转染的工艺，包括细胞转染前处理、瞬时转染及转染后处理等步骤，具体包括但不限于如下步骤。
步骤一：将果蝇细胞传代于Sf900II SFM培养基、Sf900III SFM培养基、ESF AF培养基、Schneider’s Drosophila培养基、ExpreS2无动物成分培养基、InsectXpress培养基或SF-4Baculo Express ICM培养基中，优选Sf900II SFM培养基。接种密度为0.5×106～2×106个果蝇细胞/mL，其中优选为1×106个果蝇细胞/mL。
步骤二：接种后的果蝇细胞转移到培养装置中，培养温度为25℃～32℃，其中优选为28℃，以180～400rpm的转速进行振荡培养，其中转速优选为280rpm。
步骤三：接种后的果蝇细胞在培养约1～3天后达到对数生长期，其中优选为2天，此时离心收集细胞，使用相同培养基重悬至密度为5～100×106个果蝇细胞/mL，其中优选为15×106个果蝇细胞/mL用作瞬时转染。
步骤四：选取阳离子聚合物PEI作为转染试剂，根据步骤三中瞬时转染体系中细胞的量计算所需加入的PEI和pDNA(含目的DNA的质粒)的量，其中PEI的量为0.8～3.2μg/106个果蝇细胞，优选为2.0μg/106个果蝇细胞，pDNA的量为0.2～1.4μg/106个果蝇细胞，优选为0.6μg/106个果蝇细胞。
步骤五：将合适的PEI和pDNA同时加入到步骤三所获取的瞬时转染体系中，0.5～3小时后，优选1小时后，将转染后的细胞稀释至密度为2～15×106个果蝇细胞/mL，优选稀释至密度为5×106个果蝇细胞/mL。转移至培养装置中，培养温度为25～32℃，以180～400rpm的转速进行振荡培养，其中培养温度优选为28℃，转速优选为280rpm。
步骤六：培养5天后可以获得较高的蛋白产量，此时可以进行蛋白的回收和后续的提纯。该体系规模提升到300mL后产量与10mL基本相同，该工艺可以扩展到更高的规模。
本实施方式的果蝇细胞优选但不限于果蝇S2细胞。作为转染试剂的阳离子聚合物PEI的分子量为20～50KD，优选为25KD。
上述果蝇细胞瞬时转染的工艺操作简单，所用的转染试剂成本低，转染迅速。该果蝇细胞瞬时转染的工艺通过操作简单的瞬时转染技术在果蝇细胞中可以以较短的时间实现低成本、高产量的目的DNA表达，并且能将该工艺应用至较大规模的工业生产中，克服了昆虫细胞难以通过瞬时转染工艺进行重组蛋白产业化生产的技术难题。
以下将结合附图及具体实施例对本发明的果蝇细胞瞬时转染的方法作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于具体的实施例。
实施例1
实施例1提供了一种使用本发明果蝇细胞瞬时转染的工艺进行分泌型蛋白TNFR-Fc的表达的方法，本实施例所用各项参数均经过优化，可理解，在其他实施例中，不限于此。
将果蝇S2细胞以1×106个果蝇细胞/mL的密度传代至Sf900II SFM培养基中，以28℃及280rpm进行震荡培养→培养2天后至对数生产期，离心并重悬至密度为15×106个果蝇细胞/mL→按照0.6μg/106个果蝇细胞的pDNA及2.0μg/106个果蝇细胞的PEI加入到转染体系，1小时后将细胞稀释至5×106个果蝇细胞/mL→培养5天后，通过ELISA检测蛋白表达量。
该工艺可从10mL的规模扩大至300mL乃至更高。通过该技术方案表达TNFR-Fc的具体工艺过程如下。
1)从瑞士洛桑大学Dr.Luescher实验室获取果蝇S2细胞，该细胞系已适应悬浮培养和无蛋白质培养液。果蝇S2细胞以1×106个果蝇细胞/mL的细胞密度传代到SF900II SFM培养基(Life Technologies公司，巴塞尔，瑞士)中，在TubeSpin生物反应器600(TS600)(TPP，Trasadingen，瑞士)中进行悬浮培养。培养物置于ISF1-X振荡培养器(KühnerAG，Birsfelden，瑞士)中培养，温度保持在28℃，摇晃速度为180rpm，摇动直径5cm。
1-14天的活细胞密度变化见图1。1-14天的细胞存活率变化见图2。
2)传代2天后，取适量果蝇S2细胞至TS50反应器，通过离心收集细胞，加入新的培养液将细胞重悬至15×106个果蝇细胞/mL。此时每管细胞培养液体积为3.3mL。
细胞传代后不同天数按照后续步骤进行转染，5天后TNFR-Fc单位产量情况见图3。不同转染密度的细胞5天后TNFR-Fc单位产量见图4。
3)重悬后的细胞马上进行转染，在上述果蝇S2细胞中直接加入0.6μg/106个果蝇细胞的pIEx-XTNFR-Fc质粒DNA及2μg/106个果蝇细胞的PEI(pH7.0，浓度1mg/mL的水溶液，经过过滤除菌)进行转染。其中pIEx-XTNFR-Fc质粒的构建过程参考申请号为201510708368.8的专利申请。
不同PEI分子量的TNFR-Fc单位产量见图5。不同PEI用量的TNFR-Fc单位产量见图6。不同pDNA用量的TNFR-Fc单位产量见图7。
4)将转染后的细胞转移到ISF1-X振荡培养器中培养，温度保持在28℃，摇晃速度为180rpm。
5)转染1小时后，加入新的SF900II SFM培养基，将细胞密度稀释至5×106个果蝇细胞/mL。此时每管细胞培养液体积为10mL。稀释后，将所有的细胞转移到ISF1-X振荡培养器中继续培养，培养条件不变。
转染1小时后稀释细胞，不同初始培养密度的细胞5天后TNFR-Fc单位产量见图8。
6)转染5天后，通过ELISA的方法鉴定不同组别的果蝇S2细胞TNFR-Fc的浓度。使用羊抗人Fcγ抗体进行包被，并通过碱性磷酸酶共聚羊抗人IgGγ链来检测TNFR-Fc的表达量。加入底物后，在405nm和490nm下用读板器检测吸收值。每组实验重复两次。
7)将果蝇S2细胞培养规模扩大至300mL，按照相同的生产工艺表达TNFR-Fc蛋白。转染5天后取少量样品检测，可获得基本一致的TNFR-Fc单位产量。
10mL体系与300mL体系采用本工艺5天TNFR-Fc单位产量见图9。
实施例2
实施例1提供了一种使用果蝇细胞瞬时转染的工艺进行细胞内蛋白EGFP的表达的方法，本实施例所用各项参数均经过优化，可理解，在其他实施例中，不限于此。
将果蝇S2细胞以1×106个果蝇细胞/mL的密度传代至Sf900II SFM培养基中，以28℃及280rpm进行震荡培养→培养3天后至对数生产期，离心并重悬至密度为15×106个果蝇细胞/mL→按照0.6μg/106个果蝇细胞的pDNA及2.0μg/106个果蝇细胞的PEI加入到转染体系，1小时后将细胞稀释至5×106个果蝇细胞/mL→培养3天后，通过GUAVAEasyCyte流式细胞仪检测EGFP阳性细胞的百分比，并可通过TECAN SaphirelI荧光光度计进行荧光定量。
该工艺可从10mL的规模扩大至300mL乃至更高。通过该技术方案表达EGFP的具体工艺过程如下。
1)从瑞士洛桑大学Dr.Luescher实验室获取果蝇S2细胞，该细胞系已适应悬浮培养和无蛋白质培养液。果蝇S2细胞以1×106个果蝇细胞/mL的细胞密度传代到SF900II SFM培养基(Life Technologies公司，巴塞尔，瑞士)中，在TubeSpin生物反应器600(TS600)(TPP，Trasadingen，瑞士)中进行悬浮培养。培养物置于ISF1-X振荡培养器(KühnerAG，Birsfelden，瑞士)中培养，温度保持在28℃，摇晃速度为180rpm，摇动直径5厘米。
1-14天的活细胞密度变化见图1。1-14天的细胞存活率变化见图2。
2)传代2天后，取适量果蝇S2细胞至TS50反应器，通过离心收集细胞，加入新的培养液将细胞重悬至15×106个果蝇细胞/mL。此时每管细胞培养液体积为3.3mL。
细胞传代后不同天数按照后续步骤进行转染，5天后EGFP阳性细胞比例情况见图10。不同转染密度的细胞3天后EGFP阳性细胞比例见图11。
3)重悬后的细胞马上进行转染，以上果蝇S2细胞中直接加入0.6μg/106个果蝇细胞的pIEx-XEGFP质粒DNA及2μg/106个果蝇细胞的PEI(pH7.0，浓度1mg/mL的水溶液，经过过滤除菌)进行转染。其中pIEx-XEGFP质粒的构建过程参考申请号为201510708368.8的专利申请。
不同PEI用量的EGFP阳性细胞比例见图12。不同pDNA用量的EGFP阳性细胞比例见图13。
4)将转染后的细胞转移到ISF1-X振荡培养器中培养，温度保持在28℃，摇晃速度为180rpm。
5)转染1小时后，加入新的SF900II SFM培养基，将细胞密度稀释至5x106个果蝇细胞/mL。此时每管细胞培养液体积为10mL。稀释后，将所有的细胞转移到ISF1-X振荡培养器中继续培养，培养条件不变。
6)转染3天后，EGFP阳性细胞的百分比通过GUAVAEasyCyte流式细胞仪(GUAVAtechnologies,Hayward，美国)测定。激发光和发射光分别为488nm和532nm。EGFP的荧光定量通过TECAN SaphireII荧光光度计(TECAN，Maennedorf,瑞士)测定，激发光和发射光分别为485nm和515nm。
7)将果蝇S2细胞培养规模扩大至300mL，按照相同的生产工艺表达EGFP蛋白。转染3天后取少量样品检测，可获得基本一致的EGFP阳性细胞百分比及单位产量。
10mL体系与300mL体系采用本工艺3天EGFP阳性细胞比例见图14。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
对果蝇细胞传代培养，传代培养时接种的密度为0.5×106～2×106个果蝇细胞/mL；
向果蝇细胞悬液中加入转染试剂和含目的DNA的质粒进行瞬时转染，所述果蝇细胞悬液为果蝇S2细胞悬液，所述果蝇细胞悬液的密度为5×106～100×106个果蝇细胞/mL，所述转染试剂为阳离子聚合物PEI，所述转染试剂的添加量为0.8～3.2μg/106个果蝇细胞，所述含目的DNA的质粒的添加量为0.2～1.4μg/106个果蝇细胞，所述含目的DNA的质粒为非病毒质粒；
培养得到转染有含目的DNA的质粒的果蝇细胞；
其中，所述阳离子聚合物PEI的分子量为20～50KD。
2.如权利要求1所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，所述阳离子聚合物PEI的分子量为25KD。
3.如权利要求1～2中任一项所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，传代培养时接种的密度为1×106个果蝇细胞/mL。
4.如权利要求3所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，传代培养所用的培养基选自Sf900 II SFM培养基、Sf900 III SFM培养基、ESF AF培养基、Schneider’sDrosophila培养基、ExpreS2无动物成分培养基、InsectXpress培养基或SF-4BaculoExpress ICM培养基。
5.如权利要求4所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，传代培养过程中，是于25～32℃、180～400rpm的转速进行摇晃培养。
6.如权利要求5所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，在传代培养一段时间细胞达到对数生长期后，离心收集细胞，再使用所述培养基重悬至密度为5×106～100×106个果蝇细胞/mL用作瞬时转染。
7.如权利要求1～2及4～6中任一项所述的果蝇细胞瞬时转染的工艺，其特征在于，还包括在瞬时转染后0.5～3小时，将转染后的细胞稀释至浓度为2×106～15×106个果蝇细胞/mL，并转移至培养装置中，在25～32℃、180～400rpm的转速条件下进行摇晃培养的步骤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611082416.8A CN106755093B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 果蝇细胞瞬时转染的工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611082416.8A CN106755093B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 果蝇细胞瞬时转染的工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106755093A CN106755093A (zh) | 2017-05-31 |
| CN106755093B true CN106755093B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=58898379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611082416.8A Active CN106755093B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 果蝇细胞瞬时转染的工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106755093B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107236761B (zh) * | 2017-06-13 | 2020-04-07 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | 提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法 |
| CN113430227A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | 制备稳定细胞池的方法、蛋白表达方法及试剂盒 |
| CN113930449B (zh) * | 2021-09-23 | 2024-02-02 | 温州医科大学 | 一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119285A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种提高昆虫细胞转染效率的阳离子聚合物pei法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140004146A1 (en) * | 2011-03-17 | 2014-01-02 | Institut Pasteur Of Shanghai, Chinese Academy Of Sciences | Method for producing virus-like particle by using drosophila cell and applications thereof |
| CN105238816B (zh) * | 2015-10-26 | 2018-08-24 | 广州汉腾生物科技有限公司 | 一种表达载体 |
-
2016
- 2016-11-30 CN CN201611082416.8A patent/CN106755093B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119285A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种提高昆虫细胞转染效率的阳离子聚合物pei法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Transient expression of rabies virus glycoprotein (RVGP) in Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2) cells;Sandra Fernana等;《Journal of Biotechnology》;20140707;第255-262页 * |
| 探讨细胞不同初始接种密度对转染效率的影响;洪玮等;《中国当代医药》;20160630;第18卷(第18期);第11-13页 * |
| 绿僵菌素对四种昆虫细胞的毒性;何广为等;《应用昆虫学报》;20150630;第52卷(第6期);第1466-1473页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106755093A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108504657B (zh) | 利用crispr-cas9技术敲除hek293t细胞kdm2a基因的方法 | |
| WO2019052274A1 (zh) | 一种筛选cho细胞系高表达位点的方法 | |
| CN106755093B (zh) | 果蝇细胞瞬时转染的工艺 | |
| Cervera et al. | Intracellular characterization of Gag VLP production by transient transfection of HEK 293 cells | |
| CN110423726B (zh) | 无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用 | |
| Fuenmayor et al. | Extended gene expression for Gag VLP production achieved at bioreactor scale | |
| Cervera et al. | Extended gene expression by medium exchange and repeated transient transfection for recombinant protein production enhancement | |
| CN114058625B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN114085841B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614092.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| US20230323352A1 (en) | Exosome secreted from gene-modified cells with long non-coding ribonucleic acids and application thereof | |
| CN111073856A (zh) | 一种滋养细胞及其制备方法和在nk细胞扩增中的应用 | |
| US20210238634A1 (en) | Use of genomic nw_006882077.1 in cho cell for stably expressing a protein | |
| CN106987559A (zh) | 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用 | |
| CN107604005A (zh) | VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法 | |
| CN113969283B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003613756.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN113969284B (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614889.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN107236761B (zh) | 提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法 | |
| CN103981218A (zh) | 一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法 | |
| CN111484993A (zh) | 长链非编码rna il21-as1及其用途 | |
| CN107653266A (zh) | 含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用 | |
| CN114250193A (zh) | 一种人胚胎肾细胞系及其应用 | |
| CN114214338A (zh) | 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用 | |
| CN113304254A (zh) | 一种微小隐孢子虫Cp15重组侵入型乳酸菌活载体疫苗 | |
| CN107779472B (zh) | 果蝇s2细胞瞬时转染的方法 | |
| CN111471656A (zh) | 用于检测NMO-IgG的稳转细胞株及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20191206 Address after: Room 511, floor 5, building a, Central Europe center, No. 2, South Lingnan Avenue, Lecong Town, Shunde District, Foshan City, Guangdong Province Applicant after: Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: CANTONBIO Co.,Ltd. Address before: Two, building 2, 528400 Qin Kang Road, Torch Development Zone, Guangdong, Zhongshan 201, China Applicant before: ZHONGSHAN CANTONBIO BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210510 Address after: 528315 room 511, 5 / F, building a, Central Europe center, 2 Lingnan Avenue South, Lecong Town, Shunde District, Foshan City, Guangdong Province Patentee after: Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd. Patentee after: CANTONBIO Co.,Ltd. Patentee after: Foshan Pu Jin Bioisystech Co.,Ltd. Address before: 528000 room 511, 5 / F, building a, Central Europe center, 2 Lingnan Avenue South, Lecong Town, Shunde District, Foshan City, Guangdong Province Patentee before: Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd. Patentee before: CANTONBIO Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Technology of transient transfection of Drosophila cells Effective date of registration: 20211209 Granted publication date: 20210323 Pledgee: Qianjin sub branch of Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Pledgor: Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd.|Foshan Pu Jin Bioisystech Co.,Ltd.|CANTONBIO Co.,Ltd. Registration number: Y2021980014642 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230320 Granted publication date: 20210323 Pledgee: Qianjin sub branch of Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Pledgor: CANTONBIO Co.,Ltd.|Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd.|Foshan Pu Jin Bioisystech Co.,Ltd. Registration number: Y2021980014642 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: The Technology of Instantaneous Transfection of Drosophila Cells Effective date of registration: 20230413 Granted publication date: 20210323 Pledgee: Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Guangzhou Kecun sub branch Pledgor: CANTONBIO Co.,Ltd.|Foshan hanteng Biotechnology Co.,Ltd.|Foshan Pu Jin Bioisystech Co.,Ltd. Registration number: Y2023980038024 |