JP2015519068A - 宿主細胞における組換えタンパク質の発現のためのバキュロウイルスdnaエレメント - Google Patents
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Abstract
Description
1.転写調節因子として機能するタンパク質IE−1、IE−0および/またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む組換えバキュロウイルスであって、核酸は、
(a)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸
(b)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
(c)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
(d)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される、組換えバキュロウイルス。
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する、核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項2または3に記載の組換えバキュロウイルス。
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項8または9に記載のトランスファーベクター。
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項17または18に記載のクローニングベクター。
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項24または25に記載の核酸配列。
(b)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
(c)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
(d)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される核酸である導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞系統。
(a)配列番号12、14または15に示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、および
(b)配列番号12、14または15に示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される、核酸配列。
配列の概要
プラスミドは、2011年10月4日に受託番号CECT8031で、Spanish Type Culture Collection(CECT)(www.cect.org);University of Valencia、Parc Cientific Universitat de Valencia; Catedratico Agustin Escardino、9; 46980 Paterna (Valencia)、Spainに供託された。
[実施例]
本発明者らは、顕微鏡によって、本発明のバキュロウイルス発現カセットを組み込む組換えバキュロウイルスは、ウイルス誘導性細胞変性効果の低減および培養における細胞密度の増大と関連する興味深い特性を有することを観察した。これらの現象を定量化し、このような興味深い特性に関与するDNAエレメント(単数または複数)を決定するために、本発明者らは、polhプロモーターの制御下でAc−ie−01 cDNAによってコードされる転写調節因子を発現する組換えバキュロウイルスを作製した。このバキュロウイルスを、実施例2において使用した本発明の発現カセットのエレメントを組み込むバキュロウイルス(polhAc−ie−01/hr1p6.9p10GFP)およびGFPタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスと共同で使用して、低い0.1のMOIで懸濁液のSf9細胞に感染させた。感染後24〜120時間の間で、細胞数および細胞生存率の増大を研究した。感染後24時間で、上記の転写調節因子を過剰発現するバキュロウイルスのいずれかによって感染した昆虫細胞は、対照組換えバキュロウイルスによって感染した培養物に対して10%より高い細胞数の増大を示した(図6A)。これらの因子が、細胞増殖における観察された相違を誘導するのに必要な時間のフローサイトメトリーによるより詳細な分析によって、感染後3時間でS相の昆虫細胞の増大が示され、次いで、感染後6時間で、G1の昆虫細胞数の増大が観察された。これらのデータは、タンパク質をコードするAc−ie−01 cDNAを過剰発現するバキュロウイルスに感染した培養物における有糸分裂の極めて早期の増大を意味する(示されていないデータ)。
ヨトウガSf21またはSf9細胞系統を、10%熱不活化ウシ胎児血清(Pan Biotech(商標)、Germany)を含有するTNM−FH昆虫培地(Pan Biotech(商標)、Germany)中、27℃で、6ウェルの組織培養プレートで培養した(1×106個細胞/ウェル)。AcMNPV組換えバキュロウイルスは、「Bac−to−Bac(登録商標)」バキュロウイルス発現系(invitrogen(商標)、USA)によって得た。本発明の組換えDNAエレメントを含有する種々のトランスファーベクターは、pFastBac(商標)−DUALプラスミド(invitrogen(商標))を使用して作製した。pFastBac(商標)−DUAL中に組み込まれたプロモーターおよび調節エレメントは、クローニングを容易にするための適切な隣接する制限酵素認識配列を用いて合成した(GenScript(商標)、USA)。これらのトランスファーベクターを使用し、Cellfectin(登録商標)(invitrogen(商標)、USA)を用いてSf21細胞をトランスフェクトした。次いで、Sf21細胞の感染から得られた組換えバキュロウイルスを、細胞において2回継代し、プラークアッセイ法によって力価測定した。得られた本発明のバキュロウイルス発現カセットの遺伝子構築物が、図8に模式的に示されており、Ac−ie−01 cDNAまたは外来遺伝子(例えば、GFP)の発現を駆動するプロモーターの種々の潜在的な組合せを示す。種々の発現カセットを使用して、図4〜7に示される実施例において使用した組換えバキュロウイルスを作製した。
クローニングベクターは、外来DNA断片が、媒介物および外来DNAを同一のオーバーハングを生成する制限酵素で処理すること、次いで断片を一緒にライゲーションすることによって挿入され得る本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するDNAの小片である。クローニングベクターの本質的な特徴は、選択された配向に向けられた外来遺伝子、正に形質転換された細胞の選択を可能にするための抗生物質耐性などの選択マーカー、および細菌における増殖のための機能的複製起点(ORI)の挿入を容易にするために合成多重クローニング部位(MCS)を含まなくてはならない。
ドナーベクターは、外来遺伝子が、適当な制限酵素を使用してクローニングされている、バキュロウイルス発現カセットを含有するクローニングベクター、例えば、pUC57プラスミドからなる。本発明のバキュロウイルス発現カセットは、以下のDNA配列:(i)polhまたはpB29プロモーターなどのプロモーター配列の下流およびHSV TKポリアデニル化シグナルの上流に、バキュロウイルス転写調節因子をコードする配列Ac−ie−01および(iii)プロモーター配列、例えば、pB29p10、p10、p6.9p10またはpolhの上流に、(ii)別の遺伝子座中に、エンハンサー配列、例えば、相同領域hr1とそれに続く、対象の遺伝子のクローニングのための多重クローニング部位(MCS)およびMCSの下流にSV40ポリアデニル化シグナル(図1)をライゲートすることによって合成した。バキュロウイルス発現カセットは、市販のバキュロウイルス作製系(転位をベースとする、例えば、「Bac−to−Bac(登録商標)」系(invitrogen(商標))または相同組換えをベースとする、例えば、「flashBAC(商標)」(Oxford Expression Technologies(商標))、「Baculogold(商標)」(BD Biosciences(商標))、「BacPAK6(商標)」(Clontech(商標))、「Bac−N−Blue DNA(商標)」(invitrogen(商標))(図2および3)のトランスファーベクターへのサブクローニングを容易にするよう、特定の制限酵素認識部位(例えば、5’末端のBglIIおよびBstZ17lならびに3’末端のBgl IIおよびSgf I)によってフランキングされる。
トランスファーベクターを、5’フランキング部位のBstZ17 lおよびXba Iを用いてドナーベクターを消化し、それを同様に同一酵素で消化したトランスファーベクターpFastBac(商標)1中にクローニングすることによって作製した。この場合には、サブクローニングの結果として、バキュロウイルス発現カセットのSV40ポリアデニル化シグナルは、トランスファーベクター由来のSV40ポリアデニル化シグナルによって交換される。これとは別に、発現カセットのすべてのエレメントは、元の市販のトランスファーベクターのpolhプロモーターおよびMCSと代わって、pFastBacトランスファーベクター中に含まれる(図2)。
改変されたトランスファーベクターpFastBac(商標)1および個々のバキュロウイルス発現カセットを使用し、「Bac−to−Bac(登録商標)」バキュロウイルス発現系を使用して組換えバキュロウイルスを作製した。より詳しくは、改変されたトランスファーベクターを使用して、バキュロウイルスシャトルベクター(バクミド)およびヘルパープラスミドを含有する大腸菌(E.coli)宿主株DH10Bac(商標)を形質転換し、発現カセットの転位後に組換えバクミドの作製を可能にした。次いで、本発明のバキュロウイルス発現カセットおよびGFPをコードする遺伝子を含有する組換えバクミドのDNAを使用し、Cellfectin(登録商標)を使用して昆虫細胞、例えば、Sf21細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を回収し、第1組換えバキュロウイルス世代を得た(図2)。次いで、この組換えバキュロウイルスは、従来のプロトコールに従ってさらに増幅され、および/または力価測定され得る。市販のBEVSによって提供されるその他のトランスファーベクターを有する組換えバキュロウイルスを作製するために、同様の手順が使用され得る(図3)。
各時点から感染細胞(1×106)を回収し、遠心分離した。上清を除去し、PBSに細胞ペレットを再懸濁し、凍結(−196℃)および解凍(37℃)の3サイクルに付した。細胞片は、遠心分離によって除去した。
Sf9、Sf21またはHi−5(商標)細胞を、5または0.1のMOIを使用して、調節、エンハンサーおよびプロモーターエレメントの種々の組合せの制御下でGFPを発現する種々の組換えバキュロウイルスに感染させた。細胞培養物を、種々の時点(感染後24、48、72、96および120時間)で回収し、蛍光顕微鏡、蛍光定量的アッセイ、SDS−PAGEとそれに続くクーマシーブルー染色またはウエスタンブロットによって、またマイクロ流体分離および定量化(Experion(商標)自動化電気泳動系;Bio−Rad(商標)、USA)によってGFP発現を分析した。
感染細胞を、Leica(商標)DMIL(商標)倒立蛍光顕微鏡でGFPフィルターを使用して6ウェル細胞培養プレート中で直接的に可視化した。
種々の量の組換えGFPタンパク質を含有する感染細胞に由来する約20μgの総可溶性タンパク質を分析し、Tecan(商標)GENios(商標)(CA、USA)蛍光プレートリーダー(励起[Ex]、485/発光[Em]、535)によって定量化した。
組換えバキュロウイルスに感染した細胞からの総可溶性タンパク質画分(10μg)を、15%のSDS−PAGEゲルで分離した。ゲルをクーマシーブルー染色法によって染色するか、またはニトロセルロースメンブランにトランスファーした。ウエスタンブロットを、1:1000の抗GFPモノクローナル抗体mab2515(Millipore(商標)、USA)またはアクチン抗血清(20−33;Sigma−Aldrich(商標))を用いて探索し、免疫複合体は、二次抗体として、それぞれ、1:2,000希釈した抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識コンジュゲート(KPL(商標)、UK)を用いて、または1:2,000希釈した抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識コンジュゲート(KPLTM、UK)によって示された。タンパク質バンドは、ECLウエスタンブロッティング検出系を使用して検出し、ChemiDoc(商標)XRSゲルイメージングシステム(Bio−Rad(商標)、USA)によって分析した。
BJHSP−2遺伝子(pB2)の上流のDNA領域を、これまでに報告されたBJHSP2配列(GenBank受託番号U41640)に基づいてT.ni昆虫DNAからPCR増幅した。2つの挿入、8つの欠失ならびに17の突然変異を含む増幅されたDNA領域は、注釈がつけられた配列(配列番号34)とはいくつかの面で異なっていた。種々のバイオインフォマティクス分析を使用して、ホルモン応答エレメントと関連する6つの推定結合部位が、pB2配列に沿って見られ、そのうち4つが、推定エクジソン応答エレメント(EcR)に対応し、それらの3つが推定Broad−Complex部位(Br−C)に対応していた(図9AおよびB)。
pB2またはpB29配列および従来のバキュロウイルスプロモーターpolhまたはp10を含む種々のキメラプロモーターを構築し、その結果、組合せpB2polh、polhpB2、pB2p10、p10pB2およびpB29p10が得られた。それらのすべてを使用して、組換えバキュロウイルスを作製し、そのプロモーター特徴について試験した。感染の24時間後に、polhpB2およびpB29p10ハイブリッドプロモーターによって駆動されるGFPタンパク質発現は、従来のプロモーターpolhまたはp10を使用するよりも高かった(図10A)。興味深いことに、キメラプロモーターpolhpB2の制御下でのGFP発現は、感染後48時間で低下し、キメラプロモーターpB29p10の制御下で発現されたGFPは、時間に沿って、polhプロモーターを使用することによって得られたものよりもかなり高いレベルに増大した(図10B)。キメラプロモーターpB2p10は、感染後48時間で最大GFP発現レベルを示したが、発現増大は、その後の時間では直線的ではなかった(図10B)。結論として、ハイブリッドプロモーターpB29p10は、polhまたはp10プロモーター単独よりも早期に強力であった。
文献
Claims (44)
- 転写調節因子として機能するタンパク質IE−1、IE−0および/またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む組換えバキュロウイルスであって、核酸は、
(a)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、
(b)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
(c)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
(d)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される、組換えバキュロウイルス。 - 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも1種の組換え相同領域(hr)をさらに含む、請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 組換え相同領域(hr)が、配列番号27に示される配列(hr1)である、請求項2に記載の組換えバキュロウイルス。
- 相同領域(hr)と作動可能に連結したプロモーターが、
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項2または3に記載の組換えバキュロウイルス。 - 配列番号17〜26を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項1から4のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項1から5に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項1から5のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。
- 転写調節因子として機能するタンパク質IE−0、IE−1および/またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含み、バキュロウイルスにおける組込みまたは転位に適した核酸配列をさらに含む、請求項1から6のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスの生産に適したトランスファーベクター。
- 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも1種の組換え相同領域(hr)をさらに含む、請求項7に記載のトランスファーベクター。
- 組換え相同領域(hr)が、配列番号27に示される配列(hr1)である、請求項8に記載のトランスファーベクター。
- 相同領域(hr)と作動可能に連結したプロモーターが、
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項8または9に記載のトランスファーベクター。 - 配列番号17〜26を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項7から10のいずれかに記載のトランスファーベクター。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項7から11の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項7から11のいずれかに記載のトランスファーベクター。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項7から11のいずれかに記載のトランスファーベクター。
- バクミドであることを特徴とする、請求項7から13のいずれかに記載のトランスファーベクター。
- バキュロウイルス発現系「Bac−to−Bac(登録商標)」(invitrogen(商標))、「BacPAK(商標)」(Clontech(商標))、「FlashBAC(商標)」(Oxford Expression Technologies(商標))、「BacuVance(商標)」(GenScript(商標))、「Bac−N−Blue DNA(商標)」(invitrogen(商標))、「BaculoDirect(商標)」(invitrogen(商標))、「BacVector(登録商標)」1000、2000、3000(Novagen(登録商標))、「DiamondBac(商標)」(Sigma−Aldrich(登録商標))または「BaculoGold(商標)」(BD biosciences(商標))のいずれかに由来することを特徴とする、請求項7から14のいずれかに記載のトランスファーベクター。
- 転写調節因子として機能するタンパク質IE−0、IE−1および/またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含み、細菌複製にさらに適している、請求項1から15のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するのに適したクローニングベクター。
- 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも1種の組換え相同領域(hr)をさらに含む、請求項16に記載のクローニングベクター。
- 組換え相同領域(hr)が、配列番号27に示される配列(hr1)である、請求項17に記載のクローニングベクター。
- 相同領域(hr)と作動可能に連結したプロモーターが、
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項17または18に記載のクローニングベクター。 - 配列番号17〜26を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項16から19のいずれかに記載のクローニングベクター。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項16から20に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項16から20のいずれかに記載のクローニングベクター。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項16から20のいずれかに記載のクローニングベクター。
- 転写調節因子として機能するタンパク質IE−0、IE−1および/またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含む、請求項1から22のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するのに適した核酸配列。
- 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも1種の組換え相同領域(hr)をさらに含む、請求項23に記載の核酸配列。
- 組換え相同領域(hr)が、配列番号27に示される配列(hr1)である、請求項24に記載の核酸配列。
- 相同領域(hr)と作動可能に連結したプロモーターが、
(a)配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
(b)組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号10〜16のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項24または25に記載の核酸配列。 - 配列番号17〜26を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項23から26のいずれかに記載の核酸配列。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項23から27に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項23から27のいずれかに記載の核酸配列。
- 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項23から27のいずれかに記載の核酸配列。
- 請求項1から29のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列で感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
- 昆虫細胞系統であることを特徴とする、請求項30に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
- 鱗翅目または双翅目の属に属する昆虫に由来することを特徴とする、請求項30または31に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
- イラクサギンウワバ、ヨトウガ、アスカラファ・オドラタ、カイコ、キイロショウジョウバエまたはネッタイシマカに由来することを特徴とする、請求項30から32のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
- Hi−5(商標)、Sf9、Sf21、BTI−Tn5B−1、Tn368、ExpresSf+(登録商標)、BTI−TnAo38、ATC−10およびSchneiderのショウジョウバエ系統2からなる群から選択される細胞系統であることを特徴とする、請求項30から33のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
- 請求項1から29のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列を含む培養培地。
- 請求項30から34に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞、ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
- 組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンおよび診断用タンパク質試薬を含む群から選択される、請求項36に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。
- 請求項1から6のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを生産するための、請求項7から15のいずれかに記載のトランスファーベクターの使用。
- 請求項1から15のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するための、請求項16から22のいずれかに記載のクローニングベクターの使用。
- 請求項1から22のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するための、請求項23から29のいずれかに記載の核酸配列の使用。
- (a)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、
(b)配列番号1〜5のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
(c)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
(d)配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される核酸である導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞系統。 - 昆虫、鳥類または哺乳類起源のものである、請求項41に記載のトランスジェニック細胞系統。
- 請求項41または42に記載のトランスジェニック細胞系統の成長ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
- 組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能する核酸配列を含む核酸配列であって、
(a)配列番号12、14または15に示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、および
(b)配列番号12、14または15に示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される、核酸配列。
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