CN113512597A - 结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液等，其中核酸提取液中包含优化设计的特异性捕获探针提取探针，可以对预处理后的试样中的靶标核酸进行有效富集提取和纯化，结合分步添加的检测液a、检测液b和SAT酶液，可以实现对结核分枝杆菌的高灵敏度检测。

Description

结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用 引物和探针
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及其专用引物和探针，尤其涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)检测样本中结核分枝杆菌(Tuberculousbacillus，TB)核酸的试剂盒及其专用引物和探针。
背景技术
结核分枝杆菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，结核分枝杆菌不仅感染人，哺乳动物也可以发生感染，人与动物之间除了靠空气中的气溶胶传播外，一些动物产品如肉、乳、动物皮毛等也是动物传染给人的主要传播途径，对结核分枝杆菌的检测能准确识别传染源和传染路径，另一方面，还有助于对可能由病菌污染的环境，例如河水、污水、物体表面附着物等，以及饮用水、食品等样本进行监测。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于：前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，因此无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。SAT技术已由申请人申请专利并授权(ZL200810111479.0)，然而，SAT技术在不同种类病原体的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病原体的特性进行专门设计。利用SAT技术对结核分枝杆菌进行核酸扩增检测已由申请人申请专利并获得授权(ZL201110137694.X)，但是在该专利文献的检测方法中，向预处理后的试样中一步加入用于检测结核分枝杆菌的引物和探针，可能会造成不同引物和探针之间的相互干扰，以及试样中存在的较多杂质的干扰，造成检测灵敏度的降低；另外，该专利文献在利用SAT技术扩增检测结核分枝杆菌核酸之前，采用NaOH溶液对样本进行预处理，会导致结核分枝杆菌死亡，造成RNA降解，从而出现假阴性结果并降低检测灵敏度；并且结核分枝杆菌对NaOH具有一定耐受性，这增加了操作人员的感染风险。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和提取探针，其中所述特异性捕获探针用于捕获检测序列，所述提取探针用于与靶标序列特异性结合；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述提取探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
上述试剂盒还包括：
(5)样品预处理液：其包含胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种；
优选地，所述样品预处理液的组分为：3～5M的胍盐和/或0.1～10％的去垢剂和/或0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤6.9；
可选地，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；所述去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种；所述巯基还原剂选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种。
在上述的试剂盒中，
所述核酸提取液的组分为：250～800mM HEPES、50～500mg/L磁珠、1～50μΜ所述的特异性捕获探针、25～150pmol/mL所述的提取探针；
所述检测液a的组分为：10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mMNTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，250～750pmol/mL所述的第二引物；
所述检测液b的组分为：10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mMNTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，143～857pmol/mL所述的第一引物，143～857pmol/mL所述的靶标检测探针；
所述SAT酶液的组分为：16000～160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000～80000U/mL的RNA聚合酶、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mMzinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、0.01～0.5mM EDTA、0.1～1％(v/v)Triton X-100和20～50％(v/v)glycerol。
上述试剂盒还包括：
(6)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
(7)矿物油；和/或
(8)阳性对照：含结核分枝杆菌核酸的体系；和/或
(9)阴性对照：不含有结核分枝杆菌核酸的体系。
上述洗涤液的组分为：HEPES 5～50mM，NaCl 50～500mM，0.5～1.5％SDS，EDTA 1～10mM；上述阳性对照为：含102～105CFU/mL结核分枝杆菌的菌液。
本发明另一方面提供一种用于上述的试剂盒中的特异性捕获探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明另一方面提供一种结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其用于上述的试剂盒中，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的特异性捕获探针；核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的提取探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第一引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第二引物的和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的靶标检测探针。
本发明再一方面提供一种检测结核分枝杆菌核酸的非疾病诊断方法，其利用上述的试剂盒，包括以下步骤：
1)向预处理后试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤5)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有结核分枝杆菌核酸；若dt>35，则试样中不含有结核分枝杆菌核酸。
上述方法中，步骤1)中所述预处理的具体操作为：向所述试样中加入样品预处理液进行试样的预处理，获得预处理后试样；优选地，所述预处理的条件为将所述试样和样品预处理液的混合液在90～100℃的条件下进行高温处理，时间为10～20min；所述高温处理的同时或之后在200～400W的功率下进行超声处理，时间为10～20min。
上述方法中，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min；步骤3)中所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为41-43℃；步骤3)中所述第二步反应的条件为41℃-43℃反应3-15min；步骤4)中所述第三步反应的条件为41℃-43℃反应30-50min。
上述试样来源包括动物产品，河水、污水、物体表面附着物，饮用水、食品、气溶胶。
基于以上技术方案提供的结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液等，在核酸提取液中包含用于结合检测序列的特异性捕获探针和用于与靶标序列特异性结合的提取探针，在检测液a中可含有第二引物，在检测液b中可含有第一引物、靶标检测探针等，SAT酶液则含有反应过程中所需要的RNA聚合酶和反转录酶等。在使用过程中将核酸提取液加入到预处理后的试样中可以有效富集提取和纯化试样中的结核分枝杆菌核酸，并去除试样中存在的其他杂质，因此可以有效避免试样中存在的杂质对后续反应体系的干扰；还在向反应体系中加入检测液a之前，除去反应体系中多余的核酸提取液成分，可以避免核酸提取液中存在的特异性捕获探针和提取探针对后续反应体系的干扰；随后逐步加入检测液a、SAT酶液和检测液b，可以避免不同引物、探针之间的相互干扰，进而实现对结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性检测。本发明提供的试剂盒中还可包括样品预处理液，其主要成分为胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种，该样品预处理液可以对试样进行有效预处理，便于后续核酸提取过程中结核分枝杆菌核酸的高效富集提取，并在预处理的过程中可保护病原体核酸不被大量降解，有利于后续高灵敏度检测，并极大程度降低操作人员的感染风险。
本发明除用于医学领域的结核分枝杆菌检测，还可以用于对非医学诊断用样本，例如动物制品，河水、污水、气溶胶、物体表面附着物等环境样本，以及饮用水、食品等样本中结核分枝杆菌的检测，适合大范围推广使用。
与现有的检测方法相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明试剂盒在核酸提取液中包含用于结合检测序列的特异性捕获探针和用于与靶标序列特异性结合的提取探针，在使用过程中将核酸提取液加入到预处理后的试样中可以有效富集提取和纯化试样中的结核分枝杆菌核酸，并有效去除试样中存在的其他杂质，因此可以有效避免试样中存在的杂质对后续反应体系的干扰，且获取较多的结合分枝杆菌核酸样本，为后续结核分枝杆菌核酸的高灵敏度检测奠定基础；随后在向经核酸提取液中捕获探针和提取探针富集提取的结核分枝杆菌核酸体系中加入检测液a之前，先除去体系中多余的核酸提取液成分，可以避免核酸提取液中存在的特异性捕获探针和提取探针对后续反应体系的干扰，随后逐步加入检测液a、SAT酶液和检测液b分步反应，可以有效避免不同引物、探针之间的相互干扰，因此相对于现有技术(例如ZL201110137694.X)可以实现更高的检测灵敏度，实施例结果表明，本发明提供的试剂盒和方法对结核分枝杆菌检测的灵敏度可达1CFU/mL，是ZL201110137694.X公开的检测方法获得的灵敏度(10CFU/mL)的10倍。
(2)本发明试剂盒中还包含的样品预处理液的主要成分为胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种，其可以对试样进行有效预处理(可指使试样液化，还可指裂解病原体使病原体核酸得以释放)，相对于NaOH溶液，不仅可以实现预处理时间的缩短，还能够有效保护试样中的结核分枝杆菌核酸不被大量降解，为后续核酸提取液对结核分枝杆菌核酸的富集提取奠定基础，并减少假阴性检测结果，提高检出率；另外，使用本发明试剂盒中的样品预处理液预处理试样时，联合采用高温处理和超声处理结合的方式，处理过程可以灭活结核分枝杆菌，因此降低了操作者感染风险；再者，使用本发明试剂盒中的样品预处理液预处理试样时不需要离心操作，因此更容易实现自动化检测；
(3)本发明试剂盒中引物和探针组合是根据结核分枝杆菌RNA序列中保守性片段进行优化设计获得，并结合采用分步添加至反应体系的方式，具有高灵敏度、高准确度和高特异性的特点，可以用于对结核分枝杆菌进行快速、准确、高灵敏度和高特异性检测。
附图说明
图1为实施例1中组1(A幅)、组2(B幅)和组3(C幅)引物和探针对系列浓度的结核分枝杆菌阳性标准品的扩增曲线；
图2为实施例3中检测结核分枝杆临床样本的扩增曲线；
图3为实施例4中采用本发明的方法(A幅)与ZL201110137694.X公开的方法(B幅)检测结核分枝杆菌临床样本的扩增曲线。
具体实施方式
针对现有技术中存在的结核分枝杆菌检测方法的缺陷，本发明提供了用于结核分枝杆菌检测的核酸恒温同步放大检测试剂盒及其专用引物和探针以及检测方法。
其中提供的试剂盒中可包含用于SAT技术体系的核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，还可以包含用于试样预处理的样品预处理液。其中，样品预处理液中包含胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种，优选包含其中两者及以上，更优选包含三者，还包含10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤6.9。
胍盐在样品预处理液中的作用是核酸酶抑制剂，可以保护病原体释放的核酸不被大量降解，可选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；胍盐在样品预处理液中的浓度为3～5M，可选为3～4M、4～5M等。
去垢剂在样品预处理液中的作用是对试样预处理过程中裂解病原体释放的核酸进行有效保护，可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种；去垢剂在样品预处理液中的浓度为0.1～10％(质量体积浓度，例如0.1％表示0.1g/100ml，下同)，可选为0.1～1％、0.1～2％、0.1～3％、0.2～4％、0.2～5％、0.3～10％、0.3～6％或0.4～8％等。
巯基还原剂在样品预处理液中的作用是使试样彻底液化和/或促使试样中病原体裂解，使得大量的病原体核酸被释放出来，其可选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种；巯基还原剂在样品预处理液中的浓度为0.1～3％(质量体积浓度)，可选为0.1～0.5％、0.3～1.0％、0.5～1.0％、0.5～3％、1.0～3％等。
样品预处理液中的Tris-HCl作为pH缓冲介质，EDTA用于稳定体系pH值，并除去作为核酸酶活性辅因子的金属离子。
在使用样品预处理液对试样进行预处理时，将样品预处理液加入试样中后进行高温处理和超声处理操作，其中高温处理是指在90～100℃下处理10～20min，可选90℃下处理10～20min、95℃下处理10～20min、100℃下处理10～20min等，高温处理的作用是使试样彻底液化和/或使试样中病原体破碎，使得病原体核酸释放出来，同时使病原体灭活降低生物安全危害；超声处理是指在高温处理的同时或之后在功率200～400W下超声10～20min，可选在功率200W下超声10～15min、功率200W下超声15～20min、功率300W下超声10～15min、功率300W下超声15～20min、功率400W下超声10～20min、功率400W下超声15～20min、功率400W下超声10～15min等，超声处理的作用是与高温处理协同彻底裂解试样中的病原体，使得更多核酸释放出来，在这一过程中样品预处理液中的胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种可以有效保护核酸不被大量降解和/或促进病原体核酸的释放，有利于后续病原体核酸的有效富集和提取。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、荧光探针等用已有技术合成。
实施例1：用于实时荧光核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的专用引物和探针的设计本发明人根据ZL201110137694.X公开的检测序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，按照引物和探针设计原则进行引物和探针设计，以对结核分枝杆菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
该实施例共设计了多组引物和探针，其中选择以下三组引物和探针(组1、组2和组3)对结核分枝杆菌阳性对照和阴性对照(不含有结核分枝杆菌核酸的体系，例如生理盐水)进行检测验证，从而筛选出特异性、灵敏度和重复性均较好的引物和探针组，用于检测结核分枝杆菌。
组1：
特异性捕获探针：caatattccccactgctgcctcccgtaggatttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO:2)；
提取探针：aatttaatacgactcactatagggagacaccaacaagctgataggccgcgg(SEQ IDNO:3)；
第一引物：aatttaatacgactcactatagggagacaccaacaagctgataggccgcgg(SEQ IDNO:4)；
第二引物：gcaagtcgaacggaaaggtctc(SEQ ID NO:5)；
靶标检测探针：cguccggauaggaccacgggacg(SEQ ID NO:6)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记；
其中第一引物和第二引物的扩增区域作为靶标序列，靶标检测探针与该靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合。
组2：
特异性捕获探针-1：ctgctgcctcccgtaggagtctgtttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO:7)；
提取探针-1：aatttaatacgactcactatagggagagtcaccccaccaacaagctgataggc(SEQID NO:8)；
第一引物-1：aatttaatacgactcactatagggagagtcaccccaccaacaagctgataggc(SEQID NO:9)；
第二引物-1：gagtggcgaacgggtgagtaac(SEQ ID NO:10)；
靶标检测探针-1：ccacggauaggaccacgggaugcgugg(SEQ ID NO:11)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记；
组3：
特异性捕获探针-2：同SEQ ID NO:7所示序列；
提取探针-2：同SEQ ID NO:3所示序列；
第一引物-2：同SEQ ID NO:4所示的序列；
第二引物-2：同SEQ ID NO:5所示的序列；
靶标检测探针-2：同SEQ ID NO:6所示的序列，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
该实施例中阳性对照的制备方式包括以下步骤：
(1)将从中国医学细菌保藏中心购买的H37Ra(ATCC25177)标准菌株扩大培养；
(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数，菌液浓度为105CFU/mL；
(3)将计数的培养物用样品预处理液(以下详述)稀释成阳性对照，所含菌液浓度为102～105CFU/mL。
利用上述三组引物和探针(组1、组2和组3)分别对系列稀释的结核分枝杆菌阳性标准品(菌液浓度分别为103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL、1CFU/mL)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以下实施例3所述)。结果如图1所示，其中A幅为组1的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，B幅为组2的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，C幅为组3的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，可见组1的引物和探针的检测灵敏度可达1CFU/mL，而组2和组3的引物和探针的检测灵敏度只达到10CFU/mL，因此组1的引物和探针的检测灵敏度显著高于组2和组3的引物和探针的检测灵敏度，因此优选组1所示的引物和探针用于以下实施例中对结核分枝杆菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测。虽然组1和组3的引物探针组区别仅在于核酸提取液中的特异性捕获探针不同，但是在本发明的检测体系中，不同的特异性捕获探针，可能会得到不同的检测灵敏度。
实施例2：实时荧光核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒
该实施例提供的用于结核分枝杆菌核酸检测的试剂盒是基于RNA核酸恒温同步放大检测原理检测结核分枝杆菌核酸(16S rRNA的一段基因保守区，对应的DNA序列如SEQ IDNO：1所示)的试剂盒，在实施例确定的组1所示的引物和探针基础上，具体包括以下组分：
(1)核酸提取液：用于提取和纯化样本中的结核分枝杆菌核酸，含有250～800mMHEPES、50～500mg/L磁珠(固相支持物)、1～50μΜ特异性捕获探针(SEQ ID NO:2)、25～150pmol/mL提取探针(SEQ ID NO:3)；
(2)检测液a：其包含10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mMNTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，250～750pmol/mL的第二引物(SEQ ID NO:5)；
(3)检测液b：其包含10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mMNTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，143～857pmol/,mL的第一引物(SEQ ID NO:4)，143～857pmol/mL的靶标检测探针(SEQ ID NO:6)；
(4)SAT酶液的组分为：16000～160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000～80000U/mL的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)、2～10mM HEPES pH 7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.04～0.4mM zinc acetate(乙酸锌)、10～100mMtrehalose(海藻糖)、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、0.01～0.5mM EDTA、0.1～1％(v/v)Triton X-100和20～50％(v/v)glycerol(甘油)。
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
(5)样品预处理液：用于对试样进行预处理，其含有3～5M的胍盐和/或0.1～10％的去垢剂和/或0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤6.9；
(6)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方为HEPES 5～50mM、NaCl 50～500mM、0.5～1.5％SDS、EDTA 1～10mM；
(7)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
(8)阳性对照；可以为含102～105CFU/mL的结核分枝杆菌的菌液；
(9)阴性对照：不含结核分枝杆菌核酸的体系，例如生理盐水或样本保存液。
实施例3：实时荧光核酸恒温扩增检测结核分枝杆菌的方法
该实施例方法基于RNA恒温同步放大检测原理检测结核分枝杆菌核酸，其利用上述实施例2提供的试剂盒对从受试者获取的痰液样本中是否含有结核分枝杆菌核酸进行检测，具体操作步骤为：
3.1、样品处理
取痰液样本1mL，加入1mL的样品预处理液(十二烷基硫酸锂(LLS)8％、15mM的Tris-HCl、0.3mM的EDTA)，涡旋振荡1min获得混合液，将上述混合液90℃加热处理15min，再进行超声处理300w，15min，获得预处理后样本。
3.2、核酸提取
(1)取1mL预处理后样本于EP管，加入250μL核酸提取液(HEPES 500mM、特异性捕获探针(SEQ ID NO:2)15μΜ、磁珠150mg/L、提取探针(SEQ ID NO:3)浓度为100pmol/mL，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟；
(2)将EP管置于磁珠分离装置上，静置2～5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持EP管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM、NaCl 150mM、1wt％SDS、EDTA 2.5mM)振荡均匀后静置2～5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μL洗涤液和150μL矿物油，振荡均匀后静置2～5分钟，弃液体，保留磁珠；
(3)将EP管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
3.3、SAT扩增检测
(1)向EP管中各加入40μL检测液a(Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、第二引物(SEQ ID NO:5)浓度为500pmol/mL)振荡重悬磁珠；
(2)取振荡混匀的上述40μL反应检测液a加至洁净微量反应管，向每个反应管中加入50μL矿物油。向微量反应管中加入25μL SAT酶液(42℃条件下预热，含有M-MLV反转录酶60000U/mL、T7 RNA聚合酶40000U/mL、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mMTris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(甘油))，42℃7min；
(3)向微量反应管中加入35μL的检测液b(Tris15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、第一引物(SEQ ID NO:4)浓度为428pmol/mL，靶标检测探针(SEQID NO:6)浓度为428pmol/mL)，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM通道。
3.4、结果判定
根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点对应的横坐标读数。结果判定标准为：
FAM通道dt≤35，则样本为阳性，即样本中含有结核分枝杆菌；
FAM通道dt>35，则样本为阴性，即样本中不含有结核分枝杆菌；
利用上述方法对10例临床痰液样本进行实时荧光核酸恒温扩增检测。结果如图2和下表1所示，可见10例临床样本检测结果均为阳性，即均含有结核分枝杆菌核酸。
表1：10例临床痰液样本的结核分枝杆菌检测结果
CT值
痰液样本1 14.16
痰液样本2 8.99
痰液样本3 7.81
痰液样本4 12.16
痰液样本5 12.33
痰液样本6 9.76
痰液样本7 8.89
痰液样本8 14.27
痰液样本9 10.62
痰液样本10 15.73
参照本实施例，同样可以对其他临床诊断样本(如鼻拭子、肺泡关系液、血液、粪便等)进行检测，还可以对非临床诊断样本，例如动物制品，河水、污水、物体表面附着物、气溶胶等环境样本，以及饮用水、食品等样本中结核分枝杆菌进行检测，均具有较高的检测灵敏度。
实施例4：本发明方法与ZL201110137694.X公开的方法同时检测临床痰液样本中的结核分枝杆菌的比较
4.1、痰液样本制备
将H37Ra(ATCC25177)菌株比浊至1mg/mL，用生理盐水将菌液进行10倍倍比稀释。取16份结核分枝杆菌阴性痰液临床样本，每份各取2个1mL痰液，分别加入相同稀释倍数(10-1倍-10-7倍)菌液100μL混匀，阴性对照不加菌液，共获得两组痰液样本，每组重复一次。
4.2、痰液样本处理
步骤4.1制备的痰液样本中的一组按照实施例3提供的方法对痰液样本中的结核分枝杆菌核酸进行检测，结果如图3中A幅所示；
步骤4.1制备的痰液样本中的另一组按照ZL201110137694.X中公开的方法对痰液样本中的结核分枝杆菌核酸进行检测，具体为：在痰液样本中加入1～2倍体积的4％NaOH涡旋振荡1min，使痰液充分匀化，室温放置15min～20min，将液化好的痰液样本13000rpm离心5min，弃上清；加入1ml生理盐水重悬洗涤，13000rpm离心5min，弃上清，加入50μL TB稀释液(含0.1～1％RNAse抑制剂的灭菌DEPC水溶液)重悬，300W超声处理15min，然后进行检测。检测结果如图3中B幅所示。
根据图3中A幅和B幅所示的结果，可见利用本发明的方法可以检测到10-7倍稀释度，而ZL201110137694.X中公开的方法仅检测到10-6倍稀释度，说明相对于ZL201110137694.X公开的方法，本发明的方法具有相对更低的检测下限(低了一个数量级)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海仁度生物科技股份有限公司
<120> 结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg gaaaggtctc ttcggagata ctcgagtggc 60
gaacgggtga gtaacacgtg ggtgatctgc cctgcacttc gggataagcc tgggaaactg 120
ggtctaatac cggataggac cacgggatgc atgtcttgtg gtggaaagcg ctttagcggt 180
gtgggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg acggcctacc aaggcgacga 240
cgggtagccg gcctgagagg gtgtccggcc acactgggac tgagatacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca aatgggcgca agcctgatgc 360
agcgacgccg cgtgggggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcac catcgacgaa 420
ggtccgggtt ctctcggatt gacggtaggt ggagaagaag caccggccaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttgtccggaa ttactg 526
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatattccc cactgctgcc tcccgtagga tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaa 63
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g 51
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaagtcgaa cggaaaggtc tc 22
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cguccggaua ggaccacggg acg 23
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcgcccccg aggagcgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 47
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatttaatac gactcactat agggagagtc accccaccaa caagctgata ggc 53
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatttaatac gactcactat agggagagtc accccaccaa caagctgata ggc 53
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagtggcgaa cgggtgagta ac 22
<210> 11
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccacggauag gaccacggga ugcgugg 27

Claims (11)

1.一种结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和提取探针，其中所述特异性捕获探针用于捕获检测序列，所述提取探针用于与靶标序列特异性结合；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中所述特异性捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述提取探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(5)样品预处理液：其包含胍盐、去垢剂和巯基还原剂中的至少一种；
优选地，所述样品预处理液的组分为：3～5M的胍盐和/或0.1～10％的去垢剂和/或0.1～3％的巯基还原剂、10～100mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA，pH≤6.9；
可选地，所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；所述去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或多种；所述巯基还原剂选自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，
所述核酸提取液的组分为：250～800mM HEPES、50～500mg/L磁珠、1～50μΜ所述的特异性捕获探针、25～150pmol/mL所述的提取探针；
所述检测液a的组分为：10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mM NTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，250～750pmol/mL所述的第二引物；
所述检测液b的组分为：10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl2，1～20mM NTP，0.1～10mM dNTPs，1～10％PVP40，143～857pmol/mL所述的第一引物，143～857pmol/mL所述的靶标检测探针；
所述SAT酶液的组分为：16000～160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000～80000U/mL的RNA聚合酶、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zincacetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、0.01～0.5mM EDTA、0.1～1％(v/v)Triton X-100和20～50％(v/v)glycerol。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(6)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
(7)矿物油；和/或
(8)阳性对照：含结核分枝杆菌核酸的体系；和/或
(9)阴性对照：不含有结核分枝杆菌核酸的体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，
所述洗涤液的组分为：HEPES 5～50mM，NaCl 50～500mM，0.5～1.5％SDS，EDTA 1～10mM；
所述阳性对照为：含102～105CFU/mL结核分枝杆菌的菌液。
6.一种用于权利要求1-5中任一项所述的试剂盒中的特异性捕获探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，用于权利要求1-5中任一项所述的试剂盒中，其包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的特异性捕获探针；核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的提取探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第一引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第二引物的和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的靶标检测探针。
8.一种检测结核分枝杆菌核酸的非疾病诊断方法，其利用权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
1)向预处理后试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
5)根据步骤5)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有结核分枝杆菌核酸；若dt>35，则试样中不含有结核分枝杆菌核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述预处理的具体操作为：向所述试样中加入样品预处理液进行试样的预处理，获得预处理后试样；
优选地，所述预处理的条件为将所述试样和样品预处理液的混合液在90～100℃的条件下进行高温处理，时间为10～20min；所述高温处理的同时或之后在200～400W的功率下进行超声处理，时间为10～20min。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，
步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min；
步骤3)中所述SAT酶液使用前事先预热，预热温度为41-43℃；
步骤3)中所述第二步反应的条件为41℃-43℃反应3-15min；
步骤4)中所述第三步反应的条件为41℃-43℃反应30-50min。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述试样来源包括动物产品，河水、污水、物体表面附着物，饮用水、食品、气溶胶。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502341A (zh) * 2021-07-13 2021-10-15 上海仁度生物科技股份有限公司 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN115851926A (zh) * 2022-08-04 2023-03-28 上海仁度生物科技股份有限公司 前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN117025587A (zh) * 2023-10-10 2023-11-10 北京博晖创新生物技术集团股份有限公司 一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6709813B1 (en) * 1993-05-14 2004-03-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures
CN101333565A (zh) * 2007-06-27 2008-12-31 上海仁度生物科技有限公司 核酸恒温同步放大检测方法及其应用
CN102181572A (zh) * 2010-05-25 2011-09-14 上海仁度生物科技有限公司 一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒
CN104450953A (zh) * 2013-09-12 2015-03-25 上海仁度生物科技有限公司 Rna恒温扩增的禽流感病毒h7n9(2013)核酸检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6709813B1 (en) * 1993-05-14 2004-03-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures
CN101333565A (zh) * 2007-06-27 2008-12-31 上海仁度生物科技有限公司 核酸恒温同步放大检测方法及其应用
CN102181572A (zh) * 2010-05-25 2011-09-14 上海仁度生物科技有限公司 一种利用rna恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒
CN104450953A (zh) * 2013-09-12 2015-03-25 上海仁度生物科技有限公司 Rna恒温扩增的禽流感病毒h7n9(2013)核酸检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONTENEGRO LML等: ""The Performance of an in-house nested-PCR technique for pleural tuberculosis diagnoses"", 《REV SOC BRAS MED TROP》 *
刘宁等: ""结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测法"", 《中国预防医学杂志》 *
孙洁等: ""猪瘟病毒实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立与评价"", 《中国兽医科学》 *
柴国祥等: ""RNA 实时荧光核酸恒温扩增检测技术在结核病诊断中的价值分析"", 《中国实用医药》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502341A (zh) * 2021-07-13 2021-10-15 上海仁度生物科技股份有限公司 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN115851926A (zh) * 2022-08-04 2023-03-28 上海仁度生物科技股份有限公司 前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN115851926B (zh) * 2022-08-04 2023-10-31 上海仁度生物科技股份有限公司 前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN117025587A (zh) * 2023-10-10 2023-11-10 北京博晖创新生物技术集团股份有限公司 一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用
CN117025587B (zh) * 2023-10-10 2024-03-01 北京博晖创新生物技术集团股份有限公司 一种痰液液化及分枝杆菌核酸提取的裂解液、试剂盒、提取方法及应用

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