CN111172325A

CN111172325A - 多靶点双染料等温扩增快速检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN111172325A
Application number: CN202010108428.3A
Authority: CN
Inventors: 徐堤
Original assignee: Tiandz Inc
Current assignee: Tiandz Inc
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-05-19
Also published as: WO2021164050A1

Abstract

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种多靶点双染料等温扩增技术快速检测靶基因的检测方法、试剂盒及采用的引物组。使用本发明检测方法和试剂盒引物混合物，阳性对照和阴性对照在PCR扩增仪器中进行等温扩增反应、常温肉眼观察反应管中颜色变化结合荧光扫描读数来判定检测对象是否含有目标核酸，本发明仪器要求简易、操作简单、可分别适应高浓度和低浓度病毒样品场景、具有灵敏度高、特异性强、通过肉眼即可判定结果等优点，成本低，对于低浓度和高浓度样品都能适应检测，也使基层及现场检测成为了可能。

Description

多靶点双染料等温扩增快速检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种多靶点双染料等温扩增核酸快速检测方法、试剂盒和检测用引物。

背景技术

2019年12月，“不明原因肺炎”在中国武汉出现，报告病例的症状包括发烧、咳嗽和呼吸急促(世界卫生组织2020c)。肺炎、严重急性呼吸系统综合症和肾衰竭在重症病例中有报道。从疑似感染发现一个月以来，美国，加拿大，日本、越南，韩国液都发现疑似和确诊患者。而且感染将继续以越来越快的速度传播到国际其它地区。在(到2020年2月4)的14天时间，我们的模型预测武汉的感染者人数将超过25万人(预测区间为164,602～351,396)。其病原体SARS-CoV-2是一种重要的人畜共患病致病菌，源于蝙蝠，广泛存在于土壤、动物和水产品等，主要通过空气溶胶、飞沫、粪口传播。SARS-CoV-2该病毒已被引起中国启动一级疾控防务措施，其快速精准诊断对于疫情快速诊断和防控具有重要意意义。

该病毒颗粒内有由病毒和蛋白质组成的核心是外面有脂质双层膜的RNA病毒。目前已经确认SARS-CoV-2全基因组序列(GenBank ID:MN908947.3)，为快速分子诊断的研究奠定了基础。针对spike,RdRp,3CLpro和PLpro四种蛋白为靶点的分子诊断可能可应用于针对新型冠状病毒感染的快速诊断。

此外，在食品、化妆品和药品生产领域，市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质期较短的产品对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，对生产线和管道进行快速清洁程度检测、特别快速检测原料及半成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物超标情况，快速检测方法尤其重要。国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向。

目前，常规的微生物感染检测方法中，尤其是电镜观察ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功，另外，主要有、免疫学方法(ELISA等)、；流式细胞技术和PCR等，这些方法可以进行特异的检测，但是具有明显的费时、费力、灵敏度低和特异性差等缺点。ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通常怀疑假阴性的可能。MicroStar仪器较昂贵，运行成本也非常贵，通常需16小时以上，不能用于检测未知的可能菌数较高的样品，采用传统的生化检测方法全过程至少需要7～10d，检出限较低，费时费力。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR或荧光定量PCR方法快速，特异、灵敏度很高，但需要昂贵的PCR仪。国外曾有少量文献报道利用mRNA模板针对iap基因以RT-PCR检测活体单增李斯特氏菌病毒，但需要以膜杂交来显示检测结果，时间长、技术复杂、费用高，不易推广应用。荧光染色技术可以对活菌进行检测，但技术复杂，需要高端仪器。因此建立一种简便、灵敏、快速、特异的包括病原菌在内的基因微店检测方法是目前急于解决的技术问题。

环介导等温扩增基因技术(loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注能够用于食品安全、胚胎鉴定、动植物检验检疫、转基因产品等多个领域的病毒、微生物、寄生虫等病原体的分子检测。

中国发明专利(申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6)分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌的方法。目前，行业内已有的环介导等温扩增基因技术检测产品仍存在一定假阳性，只能针对单把靶点，仍不能满足检测紧急疫情发生、科研攻关场景下的突发大量检测需求。

发明内容

为了解决现有微生物感染和基因检测方法不简便、灵敏低、时间长、特异性差的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一种检测生物样品中含待测目标核酸浓度的等温扩增快速检测方法，第二个目的是提供一种等温扩增快速检测的试剂盒，第三个目的是提供上述试剂盒的制备方法，本发明的四个目的是提供用于上述等温扩增检测方法和试剂盒的引物组合物。本发明等温扩增检测方法和试剂盒、引物组合物具有简便、灵敏、快速、特异好的特点，可广泛用于突发疫情预警、疫情流行病学调查临床感染和疫情相关的食品、水产品、环境检测与医疗卫生、化妆品污染源检测、公共卫生流行病学快速调查、海关进出口检疫等领域的可快速目标基因检测，如2020年初突发的新型冠状病毒感染的临床检测。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用以下的技术方案：

一种检测样品中是否含有目标核酸的等温扩增快速检测方法，其特征在于，所述等温扩增快速检测方法包括步骤：收集含目标核酸的生物样品、提取目标核酸，将目标核酸、阳性对照和阴性对照分别加入等温扩增反应体系和引物组合物的混合管中进行等温扩增反应、通过常温肉眼观察反应管中颜色变化和荧光扫描读数两者单独或两者结合来判定检测对象样品中是否含有目标核酸，其中，

所述等温扩增反应体系包含缓冲液组合物、可视化组合物和等温条件催化扩增反应的聚合酶；所述常温可视化组合物包括可见光显色染料和荧光信号产生化合物，所述可见光显色染料和荧光信号产生化合物在等温扩增反应前同时加入到扩增体系中；所述可见光显色染料和荧光信号产生化合物两者单独或两者结合用于检测含待测标本的目标核酸，所述荧光信号产生化合物包括荧光显色染料和荧光探针，或选自荧光显色染料和荧光探针中的一种；所述阳性对照是浓度已知的人工合成的目标核酸，可以被LAMP引物扩增；

所述等温扩增检测方法选自环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、单引物等温扩增技术(Singleprimerisothermalamplification，SPIA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)或链替代扩增(Strand displacementamplification，SDA)中，或所述等温扩增检测方法为环介导等温扩增。

在一些实施方式中，所述肉眼观察选自在常温完成上述等温扩增反应。

在一些实施方式中，肉眼观察是测定终点数据。所述测定终点数据是先肉眼看结果，判断阴性阳性，再把颜色变化不明显的反应管进一步荧光检测，测得终点数据(endpoint)，荧光值超过阴性对照10倍以上判为阳性。

在一些实施方式中，肉眼观察是测定实时数据。所述测定实时数据是直接在荧光PCR仪器上进行,每经过间隔时间读取一次荧光读数数据来测定实时数据，通过和阴性对照和阳性对照判断是否含目标核酸是否感染目标病原微生物。

在一些实施方式中，测定实时数据读取荧光读数的间隔时间为为1～5分钟，在一些实施方式中，测定实时数据所述读取荧光读数的间隔时间优选1～3分钟，在一些实施方式中，测定实时数据所述读取荧光读数的间隔时间优选1分钟。

在一些实施方式中，通过肉眼观察可见光显色鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显深色为阳性，颜色无明显变化的为阴性；进一步的若荧光检测到荧光信号为绝对值超过10000为阳性，荧光信号低于5000为阴性。

在一实施例中，用SYBR Green I和EvaGreen I为荧光染料，用FAM通道采集荧光数据。

在一优选实施方式中，可见光染料的浓度为0.01-2％。

在一优选实施方式中，所述荧光染料的浓度为0.1-100uM。

在一优选实施方式中，所述荧光探针的浓度为0.1-100uM。

在一优选实施方式中，反应温度控制在50-70℃，

或在一优选实施方式中，反应温度控制在55-65℃，

在一优选实施方式中，反应温度控制在60-65℃。

在一优选实施方式中，反应时间10-60min。

在一优选实施方式中，反应时间20-60min。

在一优选实施方式中，反应时间30-60min。

在一实施方式中，等温反应体系含缓冲液组合物、等温扩增聚合反应酶、可见光显色染料和荧光染料。

在一实施方式中，等温扩增聚合反应酶为Bst DNA聚合酶。

在一实施方式中，所述等温扩增聚合酶为Bst DNA聚合酶升级版。

在一实施方式中，所述等温扩增聚合酶phi29 DNA Polymerase。

在一实施方式中，缓冲液组合物为LAMP mix,每个20μL反应体系所述LAMP mix的反应体系包含5μL含双染料的反应液、1μL Bst DNA聚合酶、2.5μL引物混合物、2μL待检模板或阳性对照液和9.5μL ddH₂O。

在一实施方式中，等温扩增反应为环介导等温扩增。

在一实施方式中，等温扩增反应的反应程序为将配制好的PCR管于60～65℃反应1～1.5h，80℃终止反应。

本发明的等温扩增快速检测方法可应用于包括人致病性病原体、鱼贝类等水产生物致病性病原体、农牧养殖业中病原体、植物病源微生物和动植物转基因领域、食品安全领域的特异基因的快速检测，所述检测样品包括医学检验临床标本、转基因动物组织、畜牧兽医动物标本、转基因植物组织、农作物植株、米粉、面粉、豆制品、米制品、婴幼儿辅食、罐头食品、薯类和膨化食品、植食性饲料等。

在一些实施方式，所述的等温扩增检测方法可应用于人致病性病原体的快速基因检测。

在一些实施方式，所述的等温扩增检测方法可应用于鱼贝类等水产生物致病性病原体快速基因检测。

在一些实施方式，所述的等温扩增检测方法可应用于农牧养殖业中病原体的快速基因检测。

在一些实施方式，所述的等温扩增检测方法可应用于植物病源微生物的快速基因检测。

在一些实施方式，所述的等温扩增检测方法可应用于动植物转基因领域的特异基因的快速检测。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用以下的技术方案：

用于第一目的等温扩增快速检测方法的试剂盒，其包括等温扩增反应体系、引物组合物、阳性对照和阴性对照，所述等温扩增反应体系包含等温扩增聚合反应酶、可视化组合物、缓冲液组合物,所述可视化组合物包括可见光显色染料和荧光信号产生化合物，所述荧光信号产生化合物括荧光显色染料和荧光探针或选自荧光显色染料和荧光探针中的一种，所述的阳性对照液为待测目标核酸提取液。

在一优选实施方式中,所述试剂盒为多靶点双染料的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂盒通过常温可见光显色和荧光扫描读数两者单独或两者结合使用来结合判断待测生物样品中目标核酸的阳性和含量检测对象临床标本的核酸含量结果。

在一优选实施方式中，所述试剂盒功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定或辅助鉴定待测核酸是否为目标核酸；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有待测感染源。

在一优选实施方式中，所述等温扩增聚合酶为Bst DNA聚合酶。

在一些实施方式中，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8～16个活性单位。

在一优选实施方式中，所述等温扩增聚合酶为Bst DNA聚合酶升级版。

在一优选实施方式中，所述等温扩增聚合酶phi29 DNA Polymerase。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对一种生物来源的一个靶序列的LAMP引物组合物。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对一种生物来源的两个靶序列的LAMP引物组合物。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对一种生物来源的三个靶序列的LAMP引物组合物。

所述靶序列的引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对不同生物来源的一个靶序列。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对不同生物来源的两个靶序列。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对不同生物来源的三个靶序列。

在一优选实施方式中，所述引物组合物包括针对不同生物来源的多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C。

在一优选实施方式中，所述靶序列A的引物组A由体积比为1：1：4：4的外引物A1、外引物A2、内引物A1与内引物A2组成；在一优选实施方式中，所述靶序列点B的引物组B由体积比为1：1：4：4的外引物B1、外引物B2、内引物B1与内引物B2组成；在一优选实施方式中，所述靶序列点C的引物组C由体积比为1：1：4：4的外引物A1、外引物C2、内引物C1与内引物C2组成。

可见光显色染料选自FD&C蓝色#1、坚牢绿色FCF、赤藓红、诱惑红AC、酒石黄、日落黄FCF、靛蓝胭脂红、甜菜碱、叶绿素、焦糖色素、蝴蝶豌豆、香兰、群青、孔雀蓝、钙黄素绿、羟基萘酚蓝、钴蓝、酞菁和考马斯亮蓝、或PCR级绿如蓝染料。

在一实施方式中，所述可见光显色染料选自孔雀蓝，孔雀绿，钙黄素绿，羟基萘酚蓝、普鲁斯蓝中的一种。

在一实施方式中，所述可见光显色染料选自孔雀蓝，孔雀绿，钙黄素绿，羟基萘酚蓝、普鲁斯蓝。

在一些实施方式中，所述可见光显色染料为普鲁斯蓝。

在一实施方式中，所述可见光染料为钙黄素绿。

在一实施方式中，所述可见光染料为羟基萘酚蓝。

核酸荧光染料包括但并不限于SYBR系列染料、UltraPower核酸染料、GelRed&GelGreen、碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342、噻唑橙、吖啶橙。

SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性，YBR Green II与SYBR Green I则刚好相反，它是检测RNA或单链DNA的高灵敏染料，SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，SYBR Safe。

在一些实施方式中，荧光染料为SYBR Green I，采用FAM通道采集荧光数据；在一些实施方式中，荧光染料为EvaGreen I，采用FAM通道采集荧光数据.

荧光探针是根据靶位点序列人工合成的核酸探针。

在一实施方式中，用FAM标记的探针，检测时在FAM通道采集荧光数据。

在一些实施方式中，所述的反应液体系的缓冲液组合物是LAMP mix，所述LAMPmix内含的dUTP-UNG可防交叉污。所述LAMP mix由体积比为5：2：1：2的10×Thermopol反应缓冲液、7.5～12.5mM dNTP,100-200mM MgSO4与25～37.5M甜菜碱组成；所述的10×Thermopol含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100。

所述的阳性对照液为待测目标核酸提取液。在一实施例中，所述的阳性对照液为新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA。，在一实施例中，所述阳性对照为动物致病性非洲猪瘟病毒vp72基因组DNA。

在一实施方式中，所述阳性对照为人致病性淋球菌的porA基因核酸。

在一实施方式中，所述阳性对照为牛cytB基因。

在一实施方式中，所述阳性对照为食品嗜水气单胞菌的pilin基因提取物。

在一实施方式中，所述阳性对照为转基因甜菜H7-1品系外源基因。

在一实施方式中，所述样品为痰液临床标本。

在一实施方式中，所述样品为洗鼻液临床标本。

在一实施方式中，所述样品为咽拭子临床标本。

在一实施方式中，所述临床标本样品为静脉血液。

在一实施方式中，所述为尿液临床标本。在一实施方式中，所述为粪便临床标本。

在一实施方式中，所述为脑脊液临床标本。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用以下的技术方案：

实现本发明第二目的所述等温扩增检测试剂盒的制备方法。

所述等温扩增为环介导等温扩增(LAMP)；

在一实施方式中，所述引物组合物包括针对一种生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个靶序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C；

在一实施方式中，所述引物组合物包括针对不同生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C。

所述靶序列A引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物,

所述靶序列B引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物,

所述靶序列C引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物,；

为了实现本上述的第四个目的，本发明采用以下的技术方案：

一种用于第一方面的等温扩增技术快速检测和第二方面的等温扩增检测试剂盒的用引物组合物，其中，

所述等温扩增为环介导等温扩增(LAMP)；

所述引物组合物包括针对一种生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个靶序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C；或所述引物组合物包括针对不同生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C，其中

所述靶序列C引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物。

在一实施方式中，所述生物为SARS-CoV-2，所述针对A靶点靶序列A的引物组一对引物为外引物(F3A和B3A)，一对为内引物(FIPA和BIPA),序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，

所述针对点靶序列B的引物组一对引物为外引物(F3B和B3B)，一对为内引物(FIPB和BIPB),序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

所述靶序列C的引物组一对引物为外引物(F3C和B3C)，一对为内引物(FIPC和BIPC),序列分别如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

在一实施方式中，所述生物非洲猪瘟病毒，所述引物组合物包括针对非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物，所述非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物包括靶序列D的为外引物(F3D和B3D)，一对为内引物(FIPD和BIPD),序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

本发明所说的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP)，快速检测样品感染病原微生物的基因组核酸如新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA、猪瘟病毒的DNA的方法是利用等温扩增反应聚合酶如热稳定的Bst DNA和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎--环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，可见光染料发生颜色变化，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下10至60分钟内完成。

这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；采用本发明中的基因诊断试剂盒检测仅需0.5小时。并且，本发明的反应液中添加了可见光和荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。

LAMP产物的可视化检测方法可以广泛应用于下列领域有关生物的特异基因的快速检测：

(1)可用于人致病性病原体的检测，包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福赛坦氏菌(Tannerella forsythia，Tf〕、齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter(Actinobacillus)

a c t i n o m y c e t e m c o m i t a n s)、直肠弯曲菌(C a m p y l oba c t e r r e c t u s)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrod ens)、具核梭杆菌(Fuso bacterium nuclea tum)、解肝素普氏菌(Prevotella intermedia)和嗜沫嗜血杆菌(Aggregatibacteractino mycetemcomitans)、假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)、由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝杆据(Mycobacterium africanum)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)组成的结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex)、鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分支杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、堪萨斯分支杆(Mycobacteriumkansasii)、戈登分支杆菌(Mycobacteriumgastri)、军团菌属(Legionella species)、志贺氏菌

(Shigella)、侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli)、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)和大肠杆菌普通株(common strainsof Escherichia coli)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、艰难梭菌(Clostridium d i f f i c i l e,C.d)、百日咳博德特氏菌(B o r d e t e l l a p er t u s s i s)、铜绿假单胞菌

(Pseudomonas aeruginosa)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori,H.pylori或Hp)(Minami et al,2006)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)和副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、产vero毒素大肠杆菌(toxin-producing Escherichiacoli)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和产肠毒素金黄色葡萄球菌(enterotoxigenic Staphylococcus aureus)、产毒素霍

乱弧菌(c h o l e r a t o x i n-p r o d u c i n g V i b r i o c h o le r a e)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)、空肠弯曲杆菌(Ca m pylo ba cte r je juni)、结肠弯曲杆菌(Ca m pylo ba cte r coli)和胎儿弯曲杆菌

(Campylobacter fetus)、沙门氏菌O9(Salmonella O9)、布鲁氏菌(Brucellaspp)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、人类疱疹病毒6型(human herpesvirus)、急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(severe acute respiratorysyndrome(SARS)coronavirus)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、流感病毒A型(human influenza A viruses)和流感病毒B型(human influenza B viruses)、腮腺炎病毒(mumps virus)、登革热病毒(dengue virus)、麻疹病毒(measles virus)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)、流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)、诺如病毒(norovirus,NV)、风疹病毒(rubella virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、腺病毒(adenovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型肝炎病毒(Hepa titis A Virus，HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)、人细小病毒B19型(human parvovirus B19)、爱泼斯坦-巴尔病

毒(Epstein-Barr Virus,EBV)、猴痘病毒(Monkeypox Virus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeciency virus type1,HIV-1)、兽棚病毒(flockhouse virus,FHV)和导致肾移植患者发生多瘤病的病毒(BK virus)、非洲锥体虫(African trypanosomes)、布氏冈比亚锥虫(T r y p a n o s o m a b r u c e i g a m b i e n s e)、布氏罗得西亚锥虫(T r y p a n o s o m a

bruceirhodesiense)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、肺孢子虫(Pneumocystis pneumonia)、恙虫东方体(Orientiatsutsugamushi)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等。

(2)可用于鱼贝类致病性病原体的检测，包括对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus)和、斑节对虾的黄头病毒(Yellow head virus)、鱼虹彩病毒(fish irid ovirus)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)、传染性造血器官坏死症病毒(infectioushematopoietic necrosis virus,IHNV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)、皮下及造

血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus,IHHNV)、罗氏沼虾诺达病毒(M a c r o b ra c h i u m r o s e n be rg i i Nod a v i r u s,M r N V)、小病毒颗粒(extravsmall virus,XSV)、锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,KHV)、鲤春血症病毒(spring

v i r a e m i a o f c a r p v i r u s,S V C V)、诺如病毒(n o r o v i ru s)、迟钝爱德华氏菌(Ed w a rd s i e l l a ta rd a)、叉尾鮰爱德华菌(Ed w a rd si e l l a i c ta l u r i)、柱状黄杆菌

(Flavobacteriumcolumnare)、脚鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)、鲁克氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)、鲑鱼肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum)、黑美人弧菌(Vibrio n i g r i p u l c h r i t u d o)、微孢子虫(M i c r o s p o r i d i a)、粘孢子虫(Tetracapsuloidesbryosalmonae)和脑粘体虫(Myxoboluscerebralis)等。

(3)可用于农牧养殖业中病原体的检测，包括猪水泡病病毒(Swine Vesicular

Disease Virus,SVDV)、猪圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪瘟(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、H5N1禽流感病毒(H5N1avian influenza virus)、H9禽流感病毒(H9 avian influenza virus)、鸭瘟病毒(duckplagues virus,DPV)犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus)、犬细小病毒(canineparvovirus)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus,BLV)羊传染性脓疱病毒(orfvirus)、锥体虫(trypanosomes)、犬吉氏巴贝斯虫(Babesiagibsoni)、马泰(Theileriaequi)、驽巴贝斯虫(Babesiacaballi)、环形泰勒焦虫(Theileriaannulata)、吕氏泰勒虫(Theilerialuwenshuni,UTRlu8)、尤氏泰勒虫(Theileriauilenbergi,UTRu6)、牛巴贝西虫属寄生虫(bovine Babesia parasites)、隐孢子虫(C r y p t o s p o r i d iu m)、绦虫(T a e n i a)、副结核分枝杆菌(M y c o b a c t e r i u mparatuberculosis)、钩端螺旋体(Leptospira)等。

(4)可用于植物病源微生物的检测，包括番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)、病毒马铃薯病毒Y型(Potato virus Y,PVY)、李树和桃树的李痘病毒(Plum pox virus,PPV)、柑橘青果病细菌(Citrus Greening Organism)、柑橘黄龙病病原类细菌(Liberibacter SpeciesAssociated with Citrus Huanglongbing)、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、青枯菌(Ralstoniasolanacearum)及疫霉属的栎树猝死(Phytophthoraramorum)等。

(5)可用于食品中病源微生物的检测，包括沙门氏菌(Salmonella)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、创伤弧菌(Vibrio v u ln if i c us)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y e rs i n ia e n te r o c o l i t i ca)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)金黄色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、志贺氏菌(Shigella.Spp)和大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)等。

本发明的试剂盒检测指标效果：

1.10-30分钟出结果(取决于病毒浓度)，逆转录和LAMP一步完成，比RT-PCR快1小时以上。

2.反应可以在水浴锅或金属浴上做，先肉眼看结果，判断阴性阳性，再把颜色变化不明显的反应管拿去测荧光，此时测得的是终点数据(end point)，荧光值超过阴性对照10倍以上判为阳性。(如果用SYBR Green I和EvaGreen I荧光染料，则用FAM通道采集荧光数据)，只需千余元的恒温水浴锅，不需几十万的荧光PCR仪，适合基层单位。

3.反应也可以直接在荧光PCR仪器上进行,每分钟读取一次数据(如果用SYBRGreen I和EvaGreen I荧光染料，则用FAM通道采集荧光数据)，这样测得的是实时(realtime)数据。

4.含可见光和荧光染料，故肉眼可判断结果(阴性呈浅蓝、阳性呈蓝色，见下图)，

不确定结果还可用荧光PCR仪进行更精准的研判。

5.同时扩增数个靶基因，避免突变造成漏检。

7.提供RNA阳性对照和外参，监控提取和扩增操作。

8.若用本司第三代病毒采运液，可免提取直扩。

9.特异性比RT-PCR高，因使用四条引物而不是两条。

10.灵敏性比RT-PCR高，可达10拷贝/反应以下，故假阴性率更低。

本发明技术方案的优势：

(1)、不需要特殊试剂与设备；

(2)、高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9﹪，假阳性率小于0.1﹪；

(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；

(4)、灵敏度高：扩增模板仅需10拷贝或更少，最低检测极限达到10CFU/ml；标本的检出率达到99﹪；

(5)、鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，可通过肉眼观察鉴定；还可通过测定荧光读数，跟可见光结果相互印证，更加明显可靠；

(7)可见光显色和荧光显色、探针检测协同，适用于较大范围的样品核酸含量范围。

(6)、用途广：可广泛用新型冠状病毒感染的急性疫情感染检测、以及感染源相关的食品、水产品、化妆品与医疗卫生等领域和海关进出口检疫的安全快速检测。

附图说明

图1.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A的LAMP扩增引物组N3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应常温显色可视化观察结果

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品和10E3浓度的样品反应后常温显色可视化观察结果为阴性，10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用常温显色可视化检测出来。

图2.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A的LAMP扩增引物组N3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品琼脂糖凝胶电泳结果为阴性，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用琼脂糖凝胶电泳检测出来。

图3.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A的LAMP扩增引物组N3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的荧光显色结果，

A,B C和D荧光读数在5000以下的为阴性，，E、F、G和H检测1万以上的为阳性。

图4.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点B和C的LAMP扩增引物组N1+2的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应常温显色可视化观察结果。

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品反应后常温显色可视化观察结果为阴性，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用常温显色可视化检测出来.。

图5.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点B和C的LAMP扩增引物组N1+2的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图6.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点B和C的LAMP扩增引物组N1+2的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的荧光显色结果。

A,B和C检测到荧光读数在5000以下的为阴性，D、E、F、G和H检测到荧光读数在1万以上的为阳性。

图7.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和B的LAMP扩增引物组N1+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应常温显色可视化观察结果。

图8.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和B的LAMP扩增引物组N1+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图9.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和B的LAMP扩增引物组N1+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的荧光显色结果，

A,B C和D荧光读数在5000以下的为阴性D、E、F、G和H检测到荧光读数1万以上的为阳性.

图10.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和C的LAMP扩增引物组N2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应常温显色可视化观察结果。

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品反应后常温显色可视化观察结果为阴性，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用常温显色可视化检测出来。

图11.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和C的LAMP扩增引物组N2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图12.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A和C的LAMP扩增引物组N2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的荧光显色结果。

A,和B没有检测荧光读数在5000以下的为阴性，C、D、E、F、G和H检测到荧光读数1万以上的为阳性。

图13.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A|、B和C的LAMP扩增引物组N1+2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应常温显色可视化观察结果。

图14.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A|、B和C的LAMP扩增引物组N1+2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图15.一组SARS-CoV-2样品再添加靶位点A|、B和C的LAMP扩增引物组N1+2+3的LAMP扩增反应体系对不同浓度样品等温扩增反应产物的荧光显色结果。

A,和B和C检测荧光读数在5000以下的为阴性，D、E、F、G和H检测到1万以上的为阳性。

图16.添加UNG和未添加UNG的LAMP mix反应体系中添加靶位点A|、B和C的LAMP扩增引物组N1+2+3扩增样品的常温可视化结果

图17.未添加UNG的LAMP mix反应体系中添加靶位点A|、B和C的LAMP扩增引物组N1+2+3扩增样品的琼脂糖凝胶电泳结果。

图18.不含样品的阴性对照和阳性对照检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，可见光染料和荧光染料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1检测靶点确定和引物设计

1.SARS-CoV-2的检测靶点确定和引物设计

选择新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA的N蛋白基因、S蛋白基因和冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)作为靶点A、B和C,，分别设计LAMP引物如下

针对A靶点靶序列A的引物组一对引物为外引物(F3A和B3A)，一对为内引物(FIPA和BIPA),序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，

2.非洲猪瘟病毒的检测靶点确定和引物设计

所述引物组合物包括针对非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物，所述非洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物包括靶序列D的为外引物(F3D和B3D)，一对为内引物(FIPD和BIPD),序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

实施例2 SARS-CoV-2快速检测试剂盒的制备

本发明所提供的基因诊断试剂盒是由引物组，阳性对照、阴性对照、和含双染料及dUTP和UNG酶的反应液组成。

(1)20-30μM引物组合物：包括针对3个靶序列3套引物，每套组合物有体积比为1：1：4：4的外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成，其中，引物组合物1中外引物1、外引物2、内引物1与内引物2的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，引物组合物2中外引物1、外引物2、内引物1与内引物2的序列如SEQ ID No.51、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，引物组合物1中外引物1、外引物2、内引物1与内引物2的序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

(2)反应液为LAMP mix，所述LAMP mix由5：2：1：2的10×Thermopol反应缓冲液、7.5-12.5mM dNTP，100-200mM MgSO4与25-37.5M甜菜碱组成；其中，10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100；

(3)Bst DNA聚合酶为Bst DNA polymerase，每微升含8个活性单位；

(5)可见光染料为普鲁士蓝，荧光染料为SYBR Green I；

(6)阳性对照液为新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA提取物。

实施例3.猪瘟病毒快速检测试剂盒的制备

除了(2)20-30μM引物由组合物包括针对1个靶序列1套引物，每套组合物有体积比为1：1：4：4的20-30μM外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成，其中，引物组合物1中外引物1、外引物2、内引物1与内引物2的序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，阳性对照为猪瘟病毒DNA提取物，其余于实施例2相同。

实施例4一套LAMP引物组检测SARS-CoV-2基因组RNA单靶点N3的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、配制反应体系：

按照下表添加组分，

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，

Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

C.可见光显色结合荧光定量CT值和琼脂糖凝胶电泳对比检测分析判断反应产物结果：

在荧光定量仪(60℃1h，每1min打荧光信号)，反应结束后拍照。

荧光读数结果见表1

如图1、图2和图3所示。

低浓度的A,B C和D荧光值低于5000，为阴性，E、F、G和H荧光值高于10000，为阳性。其中，样品A、B、C、D、E、F和G分别对应样品1～8。

实施例4两套LAMP引物组检测双靶点的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组：

上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、在200ulPCR管配制反应体系：

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，

Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

(3)、分析判断反应产物结果：

可见光显色结合荧光定量CT值和琼脂糖凝胶电泳对比检测分析判断反应产物结果：

在荧光定量仪(60℃1h，每1min打荧光信号)，反应结束后拍照。

结果荧光读数见表1。如图4、图5和图6：

低浓度样品A,B和C没有检测到拷贝数的陡峭剧增峰型，D、E、F、G和H检测到拷贝数的陡峭剧增峰型，其中，样品A、B、C、D、E、F和G分别对应样品9～16。

实施例5两套LAMP引物组检测双靶点的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组：

上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、配制反应体系：

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，

Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

(3)、可见光显色结合荧光定量CT值和琼脂糖凝胶电泳对比检测分析判断反应产物结果：

在荧光定量仪(60℃1h，每1min打荧光信号)，反应结束后拍照。：

荧光读数结果见表1，如图7、图8和图9

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品琼脂糖凝胶电泳结果为阴性，，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用琼脂糖凝胶电泳检测出来.。

A,B C和D荧光读书低于5000，为阴性，E、F、G和H荧光读书高于10000，为阳性，其中，样品A、B、C、D、E、F和G分别对应样品17～24。

实施例6两套LAMP引物组检测双靶点的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组：

上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、在PCR管配制反应体系：

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

(3)可见光显色结合荧光定量CT值和琼脂糖凝胶电泳对比检测分析判断反应产物结果：

结果见表1，如图10、图11和图12

阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品反应后常温显色可视化观察结果为阴性，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用常温显色可视化检测出来。阴性对照水和正常人DNA以及低浓度的10E2样品琼脂糖凝胶电泳结果为阴性，10E3、10E4、10E5、10E6和10E7浓度的样品可采用琼脂糖凝胶电泳检测出来.。A和B荧光读书低于5000为阴性，C、D、E、F、G和H检测荧光读数高于10000，为阳性，其中，样品A、B、C、D、E、F和G分别对应样品25～32。

实施例7三套LAMP引物组检测双靶点的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组：

上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、在PCR管配制反应体系：

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，

Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

在荧光定量仪(60℃1h，每1min打荧光信号)，反应结束后拍照。分析判断反应产物结果：

结果见表1，

结果如图13、图14和图15

A,和B荧光读数低于5000，为阴性，B和C、D、E、F、G和H检测荧光读数高于10000，为阳性，其中，样品A、B、C、D、E、F和G分别对应样品33～40。

表1.实施例3～7扩增结束后每个管子的荧光读数

绝对读数是扩增结束后每个管子的荧光读数。阴性对照没有扩增，染料就不会发荧光，所以读数很低，才1000多，而有扩增的，荧光就很高。我们根据这个来判断是否扩增。

实施例8.添加UNG和未添加UNG作用的三套LAMP引物组检测双靶点的等温扩增常温显色检测方法

被检样品：新型冠状病毒感染缓则的洗鼻液等被检样品。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒RNA基因组：

上清即可作为待用的模板RNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、在200ulPCR管配制反应体系：

引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，

Bst polymerase Large Fragment 1ul(8U),

准备好的模板RNA 2ul,加14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应30min，80℃终止反应。

(3)、分析判断反应产物结果：如图16和17

7-13组样品用的是新配置的LAMP mix，反应每隔10分钟取出，观察颜色变化

根据上述结果可以看出，N1+N2+N3引物检测最灵敏，能检测到600拷贝。

根据荧光定量结果，发现，荧光定量可以检测出6000拷贝的样品，但结果不稳定。

再次验证只加入人基因组荧光定量也有数读数，且数值小，但反应没有颜色变化。

结果如图16和图17所示，凝胶结果表明，非可视化的LAMP mix可用。可视化的需要添加UNG。

由实施例3～8结果可知，本发明的种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA的双染料一到多靶点等温扩增可视化检测方法、试剂盒和引物组，可达到如下技术指标：

1.10-30分钟出结果(取决于病毒浓度)，RT和LAMP一步完成，比RTPCR

快1小时以上。

2.只需千余元的恒温水浴锅，不需几十万的荧光PCR仪，适合基层单位。

3.含可见光和荧光染料，故肉眼可判断结果(阴性呈浅蓝、阳性呈蓝色)。

不确定结果还可用荧光PCR仪进行更精准的研判。

4.同时扩增三个靶基因，避免突变造成漏检。

5.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。

6.提供RNA阳性对照和外参，监控提取和扩增操作。

7.若用本司第三代病毒采运液，可免提取直扩。

8.特异性比RT-PCR高，因使用四条引物而不是两条。

9.灵敏性比RT-PCR高，可达10拷贝/反应以下，故假阴性率更低。

实施例9.两套LAMP引物组双靶点的等温扩增常温显色检测猪瘟病毒感染的方法

被检样品：猪瘟病毒感染病患猪的洗鼻液等被检样品。

对被检样品的预处理：按常规方法提取病毒基因组：

引物如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18所示。

序列表

<110> 北京天恩泽基因科技有限公司

<120> 多靶点双染料等温扩增快速检测方法和试剂盒

<130> 20200217

<141> 2020-02-21

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Shanghai bioengineer Co.Ltd

<400> 1

tggctactac cgaagagct 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 2

tgcagcattg ttagcaggat 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 3

tctggcccag ttcctaggta gtgacgaatt cgtggtggtg a 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 4

agacggcatc atatgggttg cagcgggtgc caatgtgatc 40

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 5

agatcacatt ggcacccg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 6

ccattgccag ccattctagc 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 7

tgctcccttc tgcgtagaag ccaatgctgc aatcgtgcta c 41

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 8

ggcggcagtc aagcctcttc cctactgctg cctggagtt 39

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 9

gccaaaaggc ttctacgca 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 10

ttgctctcaa gctggttcaa 20

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 11

tcccctactg ctgcctggag gcagtcaagc ctcttctcg 39

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 12

tctcctgcta gaatggctgg catctgtcaa gcagcagcaa ag 42

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

<400> 13

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<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

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<212> DNA

<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

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<213> Shanghai Bioengineer Co.Ltd

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Claims

1.一种检测样品中是否含有目标核酸的等温扩增快速检测方法，其特征在于，所述等温扩增快速检测方法包括步骤：收集含目标核酸的生物样品、提取目标核酸，将目标核酸、阳性对照和阴性对照分别加入等温扩增反应体系和引物组合物的混合管中进行等温扩增反应、通过常温肉眼观察反应管中颜色变化和荧光扫描读数两者单独或两者结合使用来判定检测对象样品中是否含有目标核酸；其中，

所述等温扩增快速检测方法选自环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、单引物等温扩增技术(Singleprimerisothermalamplification，SPIA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)或链替代扩增(Strand displacementamplification，SDA)中的一种，或所述等温扩增快速检测方法为环介导等温扩增。

2.根据权利要求1所述的检测生物样品中是否含有目标核酸的的等温扩增快速检测方法，其特征在于，

所述肉眼观察选自在常温条件上完成所述等温扩增快速检测反应，所述肉眼观察选自测定终点数据和测定实时数据，所述测定终点数据是先肉眼根据颜色变化结果判断阴性阳性，再把颜色变化不明显的反应管进一步荧光检测，测得终点数据(end point)，将荧光绝对值超过阴性对照10倍以上判为阳性；所述测定实时数据是直接在荧光PCR仪器上进行,每经过间隔时间读取一次荧光读数；来测定实时数据，通过和阴性对照和阳性对照判断是否含目标核酸，其中，所述间隔时间为1～5分钟，或优选1～3分钟，或优选1分钟。

3.根据权利要求1所述的检测生物样品中是否含有目标核酸的的等温扩增快速检测方法，其特征在于，所述可见光显色染料的浓度为0.01-2％，所述荧光染料的浓度为0.1-100uM，所述荧光探针的浓度为0.1-100uM。

4.根据权利要求1所述的检测生物样品中是否含有目标核酸的的等温扩增快速检测方法，其特征在于，所述等温扩增快速反应温度控制在50-70℃，、55-65℃或60-65℃；或所述等温扩增反应时间15-60min、20-60min，或30-60min。

5.根据权利要求1所述的检测生物样品中是否含有目标核酸的等温扩增检测快速方法，其特征在于，所述等温扩增快速检测方法可应用于包括人致病性病原体、鱼贝类等水产生物致病性病原体、农牧养殖业中病原体、植物病源微生物和动植物转基因领域、食品安全领域的特异基因的快速检测，所述检测样品包括医学检验临床标本、转基因动物组织、畜牧兽医动物标本、转基因植物组织、农作物植株、米粉、面粉、豆制品、米制品、婴幼儿辅食、罐头食品、薯类和膨化食品、植食性饲料等。

6.用于权利要求1～5任一项所述的等温扩增快速检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含等温扩增反应体系，引物组合物，阳性对照和阴性对照，所述等温扩增反应体系包含等温扩增聚合反应酶和可视化组合物、缓冲液组合物,所述可视化组合物包括可见光显色染料和荧光信号产生化合物，所述荧光信号产生化合物括荧光显色染料和荧光探针或选自荧光显色染料和荧光探针中的一种，所述的阳性对照液为待测目标核酸提取液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为多靶点双染料的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，所述环介导等温扩增(LAMP)试剂盒通过常温可见光显色和荧光扫描读数两者单独或两者结合来判断待测生物样品中是否含有目标核酸。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定或辅助鉴定待测核酸是否为目标核酸(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有待测感染源。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增聚合酶包括热稳定的BstDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶升级版、phi29 DNA Polymerase，或所述等温扩增聚合酶为热稳定的Bst DNA聚合酶；

所述引物组合物包括针对一种生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个靶序列包括靶点A和靶点B和靶点C；或所述引物组合物包括针对不同生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C；

所述靶序列A的引物组A由体积比为1：1：4：4的外引物A1、外引物A2、内引物A1与内引物A2组成；所述靶序列B的引物组B由体积比为1：1：4：4的外引物B1、外引物B2、内引物B1与内引物B2组成；所述靶序列C的引物组C由体积比为1：1：4：4的外引物A1、外引物C2、内引物C1与内引物C2组成。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液组合物LAMP mix；

所述LAMP mix包含由体积比为5：2：1：2的10×Thermopol反应缓冲液、7.5～12.5mMdNTP,100-200mM MgSO4与25～37.5M甜菜碱；

所述的10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100，所述的BstDNA聚合酶每微升含8～16个活性单位。

11.根据权利要6～10任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述可见光显色染料选自FD&C蓝色#1，坚牢绿色FCF，赤藓红，诱惑红AC，酒石黄，日落黄FCF，靛蓝胭脂红，甜菜碱，叶绿素，焦糖色素，蝴蝶。豌豆，香兰，群青，孔雀蓝，钙黄素绿，羟基萘酚蓝，钴蓝，酞菁和考马斯亮蓝，或PCR 级绿如蓝染料,所述荧光信号产生化合物包括核酸荧光染料和荧光探针，所述核酸荧光染料包括SYBR系列染料、UltraPower核酸染料、GelRed&GelGreen、碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342、噻唑橙、吖啶橙，所述SYBR系列染料包括SYBR Green I和EvaGreen，所述荧光探针是根据靶位点序列人工合成，所述荧光探针包括FAM和Hex＝或选自FAM和Hex＝中的一种。

12.权利要求6～11任一项所述的试剂盒的制备方法。

13.用于权利要求1～5任一项所述的等温扩增反应检测方法或权利要求6～12任一项所述试剂盒的引物组合物，其特征在于，

所述等温扩增为环介导等温扩增(LAMP)；

所述引物组合物包括针对一种生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个靶序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C；或所述引物组合物包括针对不同生物来源的一个靶序列、两个靶序列、三个靶序列或多个靶序列的LAMP引物组合物，所述多个序列包括靶序列A和靶序列B和靶序列C

14.根据权利要求13所述的引物组合物，其特征在于，所述生物为SARS-CoV-2，所述针对靶序列A的引物组的一对引物为外引物(F3A和B3A)，一对为内引物(FIPA和BIPA),序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，

所述针对靶序列B的引物组的一对引物为外引物(F3B和B3B)，一对为内引物(FIPB和BIPB),序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

所述靶序列C的引物组的一对引物为外引物(F3C和B3C)，一对为内引物(FIPC和BIPC),序列分别如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

15.根据权利要求13所述的引物组合物，其特征在于，所述生物为非洲猪瘟病毒，所述引物组合物包括针对洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物，所述洲猪瘟病毒的LAMP引物组合物包括靶序列D的为外引物(F3D和B3D)，一对为内引物(FIPD和BIPD),序列分别如SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。