CN108611431A - 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents

霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108611431A
CN108611431A CN201810448163.4A CN201810448163A CN108611431A CN 108611431 A CN108611431 A CN 108611431A CN 201810448163 A CN201810448163 A CN 201810448163A CN 108611431 A CN108611431 A CN 108611431A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
bottle
hybridization
bacterium
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810448163.4A
Other languages
English (en)
Inventor
杨俊�
王昱
聂福平
李贤良
王国民
吴蕊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau filed Critical Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority to CN201810448163.4A priority Critical patent/CN108611431A/zh
Publication of CN108611431A publication Critical patent/CN108611431A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法。该试剂盒根据靶序列设计2条探针(一条捕获探针和一条检测探针)，还包括一块包被了poly dT的96孔板、菌液裂解液、裂解缓冲液、杂交液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液。利用本试剂盒在2h内即可完成全部过程，通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果。本发明可以快速、大量、特异性地检测靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测时间短。

Description

霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明具体涉及一种VC夹心DNA杂交技术技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae，VC)是霍乱的病原菌，其传播快，发病急，病死率高，可导致感染者剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。霍乱弧菌引起的食源性疾病已成为当今许多国家面临的公共卫生问题，近200年来，全球共发生过7次霍乱大流行，给人类历史带来了巨大的灾难。霍乱已被《中华人民共和国传染病防治法》定为甲类传染病，也是当前三种国际检疫传染病之一。随着霍乱第7次大流行向西半球的扩展和霍乱弧菌新的致病血清群—O139群的出现，其流行特点发生了变化，也给防治工作带来了许多新的挑战，此时对其在食品安全的快速准确检出显得尤为重要。
霍乱弧菌是革兰阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，特殊结构有菌毛，无芽孢，有的菌株(O139)有荚膜，在菌体一端有一根单鞭毛。霍乱弧菌是需氧菌，而且对培养基的营养要求不高，在普通培养基上生长良好，也可利用碱性蛋白胨水进行选择性增菌，在选择性的TCBS培养基上培养，菌落呈黄色，光滑，扁平，中心不透明。根据菌体抗原不同，将霍乱弧菌分成若干O血清群，目前已分出200个以上的O血清群，但仅发现O1群和O139群霍乱弧菌能引发霍乱。
霍乱弧菌的常规鉴定通常是在碱性蛋白胨水经选择性增菌，然后通过划线接种TCBS琼脂平板或弧菌显色培养基分离，再经一系列的生物化学检验进行鉴定。传统的生物化学或微生物学方法的分离和鉴定,费时费力,需要长时间的培养和选择性增菌。另外,霍乱弧菌在某些不适合生长的条件下,如营养缺乏、抗生素存在或温度不适时,可形成L型菌或变成球型表型等不可培养状态。由于霍乱弧菌存在这种存活但不可培养状态(viablebut not culniralle state,VBNCS),采用传统的免疫学方法和生物学方法都不能全面地检测和鉴定霍乱弧菌。但利用核酸检测的方法,即使在不进行选择性富集培养或纯化的情况下,也可以进行检测检定。因此,基于核酸的检测法比传统的富集培养检测法更具优势。
目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测VC的试剂盒。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种霍乱弧菌夹心 DNA杂交快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供上述检测用探针的试剂盒的使用方法。
为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：该探针包括VC捕获探针和VC检测探针，所述VC捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，所述VC检测探针的DNA序列为SEQ IDNO.2。
为了实现上述第二目的本发明提供一种VC夹心DNA杂交技术快速检测用试剂盒，它包括一块包被了poly dT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：
所述一瓶探针液瓶内由以下成分组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的8μmol/L的VC捕获探针12.5μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的8μmol/L的VC检测探针12.5μL；
合计25μL；
裂解液，体积为30μL(所述两瓶浓的菌液裂解液，为干粉状，每瓶需用6mL 裂解缓冲液裂解；所述裂解缓冲液，体积为12mL)；
所述杂交液，体积为100μL；
所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；
所述显色液，体积为150μL；
所述终止液，体积为100μL；
以上为一个微孔反应的用量。
进一步，在上述试剂盒中，所述阳性对照液，瓶内为VC菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，瓶内为非VC菌液，体积为5mL。
为了实现上述第三目的本发明提供一种VC夹心DNA杂交快速检测方法：包括如下步骤：
(1)增菌 用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养待检菌48h，获得待检菌液。
(2)菌液裂解反应 将待检菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
(3)杂交反应 吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按体积比4:1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针按一定浓度先以体积比1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育。温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm 处的吸光度。
(4)结果判定 (菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明待测菌浓度越高。
本发明的原理是：根据霍乱弧菌GroEL基因特性，分别设计特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标致病菌靶基因的特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到10CFU/mL样品。
夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的VC检测周期较长，约3～5天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。
本发明的优点是(1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版；(2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌groEL基因结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：最低检测极限达到10CFU/mL；(5)、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值) ≥2.1即可判定为阳性(6)、用途广：可广泛用于VC的安全快速检测，特别是在食品出入境的快速检测中。
附图说明
图1VC的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；
图2VC的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；
图3阴阳性对照夹心DNA杂交检测结果；
图1中：1：霍乱弧菌；2-13：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴性对照、空白对照。
图2中：1、1.0×107CFU/mL VC菌液，2、1.0×106CFU/mL VC菌液，3、 1.0×105CFU/mL VC菌液，4、1.0×104CFU/mL VC菌液，5、1.0×103CFU/mL VC 菌液，6、1.0×102CFU/mL VC菌液，7、1.0×101CFU/mL VC菌液，8、1.0CFU/mL VC菌液。
具体实施方式
实施例1，VC夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了poly dT 的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：
探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQ ID NO.1的8μmol/L的VC捕获探针12.5μL；DNA序列为SEQ ID NO.2的8μmol/L的VC检测探针12.5μL；裂解液，体积为30μL；杂交液，体积为100μL；洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；显色液，体积为150μL；终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。
实施例2，探针的设计
在VC的核酸检测中，常选择ctx、zot和rtx等毒力基因作为检测对象，但这样容易出现假阳性或假阴性结果。而以看家基因(housekeeping genes)为目标基因建立检测方法则可以避免这样的问题，groEL基因编码分子伴侣GroEL，在维持细胞渗透压方面发挥重要作用，该基因在自然界的普遍性和保守性以及在种间的变异性使其非常适宜作为一种系统发育标记。
根据GenBank公布的VC的groEL基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用探针设计软件Primer 5，设计特异性探针，分别标记为：SEQ ID NO1，SEQID NO2。其中探针组中捕获探针:SEQ ID NO.1；检测探针:SEQ ID NO.2；体积比为1:1；在捕获探针3’端标记poly dA，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶；所有探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。探针序列如下：
探针序列号 序列(5′～3′)
SEQ ID NO1 CTGAAGATGTGGATGGCGATG
SEQ ID NO2 CAACCGACGCCAGACAGA
实施例3，阳性对照品的制备
用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养标准阳性VC菌液48h。利用平板菌落计数法测定菌液的浓度，使其浓度控制在1.0×107～1.0×108CFU/mL，一瓶5mL。
实施例4，阴性对照品的制备
用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养大肠杆菌48h，取出分装，一瓶5mL。
实施例5、制备待检样品的菌液模板
取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 扩增48h，即为菌液模板。
实施例6、杂交条件的优化
以霍乱弧菌的菌液为模板，采用正交试验的方法，进行优化。首先挑选出影响DNAH检测的因素主要有探针液浓度、探针杂交液配比、杂交温度、杂交时间，每个因素都取4个水平即探针液浓度分别设计为2、3、4、5umol/L；探针杂交液配比分别设计为1：2、1:3、1:4、1:5；杂交温度设计为35、45、55、 65℃；杂交时间设计为50、60、70、80min。采用四因素四水平进行试验，最终确定霍乱弧菌夹心DNA杂交反应条件。
实施例7、特异性和灵敏度
采用上述优化的杂交条件，对标准阳性霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌等菌液进行扩增，除霍乱弧菌外，其余均无非特异性杂交。酶标仪中450nm 处的吸光度如下表。
用灭菌生理盐水梯度稀释阳性VC菌液，采用上述优化的杂交条件进行反应，本发明的最低检测限分别约为10CFU/mL。
参见图2可以得到反应灵敏度结果。图中1-8分别为1.0×107CFU/mL到1.0 CFU/mL
实施例8、试剂盒的组装
一块包被了poly dT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
实施例9、VC夹心DNA杂交技术快速检测方法，包括如下步骤：
(1)增菌 用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养VC菌液48h。
(2)菌液裂解反应 将VC菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
(3)杂交反应 吸取150μL裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按体积比3﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针以1﹕1 的比例混合)，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150 rpm速度摇板2分钟后置于45℃培养箱中温育1h。温育后用1×PBST Buffer 洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。
(4)结果判定 (菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值- 空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明病原菌浓度越高。
参见图3可以明显得出+含有VC。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
<160> 2
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.1
ctgaagatgt ggatggcgat g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.2
caaccgacgc cagacaga 18

Claims (4)

1.霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括VC捕获探针和VC检测探针，所述VC捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，所述VC检测探针的DNA序列为SEQ ID NO.2。
2.霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括一块包被了poly dT的96孔板、两瓶菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：
所述探针液由以下成分组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的8μmol/L的VC捕获探针12.5μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的8μmol/L的VC检测探针12.5μL；
合计25μL；
裂解液，体积为30μL，由所述两瓶菌液裂解液与裂解缓冲液混合制备而成；
所述杂交液，体积为100μL；
所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；
所述显色液，体积为150μL；
所述终止液，体积为100μL；
以上为一个微孔反应的用量。
3.根据权利要求2所述霍乱弧菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液，管内为VC菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，管内为非VC菌液，体积为5mL。
4.一种霍乱弧菌夹心DNA杂交的非疾病检测目的的快速检测方法：包括如下步骤：
(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤培养待检菌48h，获得待测菌液；
(2)菌液裂解反应将待测菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟；
(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按体积比4:1的比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育，温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度；
(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明待测菌浓度越高。
CN201810448163.4A 2018-05-11 2018-05-11 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法 Pending CN108611431A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810448163.4A CN108611431A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810448163.4A CN108611431A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108611431A true CN108611431A (zh) 2018-10-02

Family

ID=63662903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810448163.4A Pending CN108611431A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108611431A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1831143A (zh) * 2005-12-15 2006-09-13 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN101768636A (zh) * 2009-01-06 2010-07-07 蔡剑平 检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法
CN102719542B (zh) * 2012-06-19 2014-10-01 上海仁度生物科技有限公司 霍乱弧菌(vc)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN104928300A (zh) * 2014-10-31 2015-09-23 上海市计量测试技术研究院 一种用于霍乱弧菌实时荧光定量pcr检测的多核苷酸、方法和试剂盒
CN105063204A (zh) * 2015-08-07 2015-11-18 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1831143A (zh) * 2005-12-15 2006-09-13 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN101768636A (zh) * 2009-01-06 2010-07-07 蔡剑平 检测霍乱弧菌的组合物、试剂盒和检测方法
CN102719542B (zh) * 2012-06-19 2014-10-01 上海仁度生物科技有限公司 霍乱弧菌(vc)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN104928300A (zh) * 2014-10-31 2015-09-23 上海市计量测试技术研究院 一种用于霍乱弧菌实时荧光定量pcr检测的多核苷酸、方法和试剂盒
CN105063204A (zh) * 2015-08-07 2015-11-18 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. DA-SILVA等: "Development of a PCR-free DNA-based assay for the specific detection of Vibrio species in environmental samples by targeting the 16S rRNA", 《ENVIRONMENTAL SCIENCE AND POLLUTION RESEARCH》 *
ELSE M. FYKSE ET AL: "Detection of Vibrio cholerae by Real-Time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
ELSE M. FYKSE ET AL: "Real-time PCR and NASBA for rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae in ballast water", 《MARINE POLLUTION BULLETIN》 *
蒋蔚等: "水产品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR 检测方法的建立", 《中国动物传染病学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102367475B (zh) 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法
CN103966353A (zh) 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物
CN102827918A (zh) 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基
CN107365869B (zh) 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物
CN102154497B (zh) 食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法
CN105063204A (zh) 沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
CN101381777B (zh) 单增李斯特菌检测试剂盒及其检测方法
CN112961805B (zh) 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用
Ahmad et al. Identification of Acinetobacter baumannii and Determination of MDR and XDR Strains
CN112961804B (zh) 一种鼠伤寒沙门菌及其应用
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN105525015A (zh) 用于沙门氏菌与大肠杆菌o157:h7的多重pcr-elisa检测试剂盒及应用
WO2015180484A1 (zh) 对普罗威登斯菌031，041，042，043和050特异的核苷酸及其应用
CN113249500A (zh) 一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法
CN106801103A (zh) 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法
CN110699470A (zh) 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重pcr引物、试剂盒、应用和方法
CN108611431A (zh) 霍乱弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
Sprygin et al. Biological characterization of Russian Mycoplasma gallisepticum field isolates
CN114214238A (zh) 一种多重耐药印第安纳沙门菌及其应用
CN111549148A (zh) 一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法
CN108410952A (zh) 单核细胞增生李斯特氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
CN113913318B (zh) 一种同时携带四个喹诺酮类药物耐药突变位点的鼠伤寒沙门菌及其应用
Arachchillaya Development and evaluation of a paper based biochemical sensor for realtime detection of food pathogen
CN108611432A (zh) 副溶血性弧菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
US10604783B2 (en) Vibrio assay methods and kits

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181002