CN105063204A - 沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents

沙门氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法 Download PDF

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杨俊�
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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法。该探针包含一条捕获探针和一条检测探针，试剂盒包括一块包被了poly？dT的96孔板、菌液溶解液、溶解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液。利用本试剂盒在2h内即可完成全部过程，通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果。本发明可以快速、大量、特异性地检测靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测时间短。

Description

沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物芯片领域，具体涉及一种SAL夹心DNA杂交技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella,SAL)是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。沙门氏菌中最早被发现的是猪霍乱沙门氏菌。沙门氏菌主要为动物致病菌，但也可通过污染食品或水源等途径感染人类，成为人类的条件致病菌，如鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。由于沙门氏菌的分布广，如果畜禽粪便污染了食品加工场所的环境或用具，就会造成食品在加工、运输、贮存、销售及动物屠宰等环节受到沙门氏菌的污染。一旦条件适宜，沙门氏菌就会迅速的生长繁殖，当菌数在食品中达到一定数量，被消费者食用后就会造成食物中毒，危害人的身体健康，甚至危及生命。
据统计，在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首；而我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有2500个以上血清型。因此，沙门氏菌的检测一直是沙门氏菌研究的核心问题。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病，因此，建立一种快速，大批量的沙门氏菌检测方法尤为重要。国内外利用夹心DNA杂交方法对食品中微生物的检测已有一些报告，但对动物制品中SAL检测方法的报导还很少。
夹心DNA杂交技术（sandwichDNAhybridizationassay,简称DNAH）是2007年美国NEOGEN公司开发的一种核酸分子杂交技术，根据病原菌核糖体RNA（rRNA）特性，设计分别含有目标病原菌rRNA特异性的捕获探针和检测探针两种探针，在捕获探针3’端标记polydA将靶标核酸片段锚定在包被了polydT的96孔板微孔中，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶进行显色反应，两种探针与目标病原菌rRNA的特异性结合，能确保检测结果的准确性。检测过程可在2h内完成，最后结果判断可通过观察颜色变化并进行OD值的测定。与现有检测方法相比，夹心DNA杂交技术基于自发性的DNA杂交反应，两条探针共同捕获目标病原菌，极大地降低了假阳性和假阴性率，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响。
目前国内尚无利用夹心DNA杂交技术检测SAL的试剂盒。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种沙门氏菌夹心DNA杂交技术快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用探针的试剂盒的使用方法。
为了实现上述第一个目的本发明采用如下技术方案：沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针，包括SAL捕获探针和SAL检测探针，其中SAL捕获探针的DNA序列为SEQIDNO.1，SAL检测探针的DNA序列为SEQIDNO.2。
为了实现上述第一个目的本发明提供一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括包被了polydT的96孔板、菌液溶解液、溶解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其中一个微孔反应的用量为：
所述探针液由以下成分组成：
DNA序列为SEQIDNO.1的4μmol/L的SAL捕获探针20.8μL；
DNA序列为SEQIDNO.2的4μmol/L的SAL检测探针20.8μL；
合计41.6μL。
所述溶解液，体积为30μL（所述两瓶浓的菌液溶解液，为干粉状，每瓶需用6mL溶解缓冲液溶解；所述溶解缓冲液，体积为12mL）；
所述核酸杂交液，体积为83.4μL；
所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为150μL；
所述显色液，体积为150μL；
所述终止液，体积为100μL；
所述阳性对照液，为SAL菌液，体积为5mL；
所述阴性对照液，为非SAL菌液，体积为5mL。
为了实现本法明的第三个目的，本发明提了一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测方法，包括如下步骤：
（1）增菌用营养肉汤（NB）扩增待检样品12h，获得待检样品液；
（2）菌液溶解反应将待检样品液和溶解液按4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
（3）杂交反应吸取150μL步骤（2）溶解后的菌液加到包被了polydT的微孔中，再按2:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到每一个含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBSTBuffer洗板5次，加150μLTMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。
（4）结果判定（菌液OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深病原菌浓度越高。
本发明的原理是：根据致病菌核糖体RNA（rRNA）特性，设计分别含有目标致病菌rRNA特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标致病菌rRNA的特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到1CFU/25g样品。
夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的SAL检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。本发明应用夹心DNA杂交探针将核酸分子杂交技术运用于SAL的快速检测，特异性、准确性比普通PCR方法更高，同时可以免除昂贵的仪器投入，便于出入境和食品安全病原菌检测的推广应用。
本发明的优点是（1）、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版；（2）、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌rRNA结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；（4）、灵敏度高：扩增模板仅需1×105CFU/mL或更少，猪肉组织样品中细菌最低检测极限达到1.2CFU/mL；标本的检出率达到99%；（5）、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且（菌液OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）≥2.1即可判定为阳性（6）、用途广：可广泛用于SAL的安全快速检测。
附图说明
图1SAL的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；
图2SAL的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；
图3阴阳性对照夹心DNA杂交扩增结果；
图1中：1.肠炎沙门氏菌，2.鼠伤寒沙门氏菌，3.霍乱沙门氏菌，4.福氏志贺氏菌，5.大肠杆菌，6.金黄色葡萄球菌，7.单核细胞增生李斯特氏菌，8.副溶血性弧菌。
图2中：1、1.2×107CFU/mLSAL菌液，2、1.2×106CFU/mLSAL菌液，3、1.2×105CFU/mLSAL菌液，4、1.2×104CFU/mLSAL菌液，5、1.2×103CFU/mLSAL菌液，6、1.2×102CFU/mLSAL菌液，7、1.2×101CFU/mLSAL菌液，8、1.2CFU/mLSAL菌液。
具体实施方式
本发明中无特别说明的反应液，均为市售产品。
实施例1，SAL夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了polydT的96孔板、两瓶浓的菌液溶解液、一瓶溶解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：
探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQIDNO.1的4μmol/L的SAL捕获探针20.8μL；DNA序列为SEQIDNO.2的4μmol/L的SAL检测探针20.8μL；菌液溶解液，体积为30μL；核酸杂交液，体积为83.4μL；洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为150μL；显色液，体积为150μL；终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。
所述阳性对照液，管内为SAL菌液，体积为5mL；
所述阴性对照液，管内为非SAL菌液，体积为5mL。
实施例2，探针的设计
SAL夹心DNA杂交探针组，其设计是根据GenBank公布的SAL的invA基因参考序列，用ClustalW进行多重比对，分析序列的保守区。采用探针设计软件Primer5，设计特异性探针，分别标记为：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2。其中探针组中捕获探针:SEQIDNO.1；检测探针:SEQIDNO.2；体积比为1:1；在捕获探针3’端标记polydA，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶；所有探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。探针序列如下：
实施例3，阳性对照品的制备
用营养肉汤（NB）扩增标准阳性SAL菌液12h。利用平板菌落计数法测定菌液的浓度，使其浓度控制在5×108～8×108CFU/mL，一瓶5mL。
实施例4，阴性对照品的制备
用营养肉汤（NB）扩增无SAL感染的猪肉组织12h，扩增后取出分装，一瓶5mL。
实施例5、制备待检样品的菌液模板
取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，用营养肉汤（NB）扩增12h，即为菌液模板。
实施例6、杂交条件的优化
按照夹心DNA杂交技术步骤，将捕获探针和检测探针浓度分别依次设为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM，进行探针浓度的优化；将核酸杂交液和探针液的比例依次设为1﹕1，2﹕1，3﹕1，4﹕1，5﹕1，进行核酸杂交液和探针液配比的优化；将杂交温度按25℃～65℃依次进行10℃递增，确定最佳杂交温度；将杂交时间分别设为30min、60min、90min、120min，确定最佳杂交时间。经上述优化后最终确定沙门氏菌夹心DNA杂交反应条件，如实施例8所示。
实施例7、特异性和灵敏度
采用上述优化的杂交条件，对标准阳性肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、SAL阴性猪肉组织等菌液进行扩增，除肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌外，其余均无非特异性杂交，参见图1。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。
用灭菌去离子水梯度稀释阳性SAL菌液，采用上述优化的杂交条件进行反应，本发明的最低检测限分别约为1.2CFU/mL。
参见图2可以得到反应灵敏度结果。酶标仪中450nm处的吸光度如下表：
实施例8、试剂盒的组装
一块包被了polydT的96孔板、两瓶浓的菌液溶解液、一瓶溶解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
实施例9、SAL夹心DNA杂交技术快速检测方法，包括如下步骤：
（1）增菌用营养肉汤（NB）扩增SAL菌液或待检样品12h，获得SAL检测菌液或待检样品液。
（2）菌液溶解反应将SAL检测菌液或待检样品液与溶解液按4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
（3）杂交反应吸取150μL步骤（2）溶解后的菌液加到包被了polydT的微孔中，再按2﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液（捕获探针和检测探针以1﹕1的比例混合），吸取125μL加到每一个含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于45℃培养箱中温育1h。温育后用1×PBSTBuffer洗板5次，加150μLTMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。
（4）结果判定（菌液OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明病原菌浓度越高。
参见图3可以明显得出＋含有SAL。酶标仪中450nm处的吸光度如下表：
SEQUENCELISTING
<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
<160>2
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.1
ctggctttccctttccagtacgcttcgcc29
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.2
ctcatctgtttaccgggcataccatcca28

Claims (5)

1.沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括SAL捕获探针和SAL检测探针，其中SAL捕获探针的DNA序列为SEQIDNO.1，SAL检测探针的DNA序列为SEQIDNO.2。
2.一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括包被了polydT的96孔板、菌液溶解液、溶解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其中一个微孔反应的用量为：
所述探针液由以下成分组成：
DNA序列为SEQIDNO.1的4μmol/L的SAL捕获探针20.8μL；
DNA序列为SEQIDNO.2的4μmol/L的SAL检测探针20.8μL；
合计41.6μL；
所述溶解液，体积为30μL；
所述核酸杂交液，体积为83.4μL；
所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为150μL；
所述显色液，体积为150μL；
所述终止液，体积为100μL。
3.根据权利要求2所述沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为SAL菌液；所述阴性对照液为非SAL菌液。
4.一种沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测方法，包括如下步骤：
（1）增菌用营养肉汤（NB）扩增待检样品12h，获得待检样品液；
（2）菌液溶解反应将待检样品液和溶解液按4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟；
（3）杂交反应吸取150μL步骤（2）溶解后的菌液加到包被了polydT的微孔中，再按2:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到每一个含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBSTBuffer洗板5次，加150μLTMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度；
（4）结果判定（菌液OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深病原菌浓度越高。
5.根据权利要求4所述沙门氏菌夹心DNA杂交快速检测方法，其特征在于：所述探针液中捕获探针和检测探针按以1﹕1的比例混合。
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