CN108410952A

CN108410952A - 单核细胞增生李斯特氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN108410952A
Application number: CN201810449486.5A
Authority: CN
Inventors: 杨俊�; 王昱; 聂福平; 李贤良; 王国民; 陈冉越
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法。该探针包含一条捕获探针和一条检测探针，试剂盒包括一块包被了poly dT的96孔板、前处理液、菌液裂解液、裂解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液。利用本试剂盒在2h内即可完成全部过程，通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果。本发明可以快速、大量、特异性地检测靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测时间短。

Description

单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于生物芯片领域，具体涉及一种LM夹心DNA杂交技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种人畜共患病的病原菌。可引起人和动物的李斯特菌病，临床表现为人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产、胃肠炎等，尤以妊娠期妇女、新生儿及免疫功能低下的病人更易感染。近几年来，因食品污染单增李斯特菌而引起的食物中毒暴发事件日见增多，引起不少国家卫生部门的广泛关注。

单核细胞增生性李斯特菌为革兰氏阳性杆菌，大小为1～3×0.5μm。无芽孢，周生鞭毛，能运动。显微镜下观察其形态两端钝圆，直或稍弯，或呈V形、Y 形，有时也呈丝状或短链状，一般不形成荚膜，但于营养丰富的培养环境中可形成荚膜。该菌需氧或兼性厌氧，营养要求不高，37℃培养数天后在普通营养琼脂培养基上，形成半透明、细小、边缘整齐、稍带珠光的露水样菌落，在血平板(5％～7％)上形成的菌落通常也不大，呈灰白色。在欧美、日本等地区，单增李斯特菌所造成的疾病感染和食物污染问题，已经超过沙门氏菌，成为了细菌性食物中毒的首要污染源，我国的辽宁、福建、云南、香港等地也先后发现由该菌引发疾病而住院和死亡的案例。当今，我国的速冻、冷藏食品领域取得较快发展，但由于李斯特菌的嗜冷性，其对冷藏食品行业的危险性与日俱增，在国内外引起多起群发性食物中毒事件。所以对食品中的单核细胞增生性李斯特菌进行检测显得尤为重要，特别是在食品的出入境快速检测中。

目前，单核细胞增生性李斯特菌的检测方法主要有传统生化鉴定、免疫学检测方法、PCR和荧光PCR检测方法等。传统的检验方法是将通过分离培养后产生的可疑菌落进行生化反应、溶血实验、协同溶血实验、动物实验、典型运动后，再进行血清鉴定。传统检测方法对实验设备要求低、操作性强、灵敏度高、成本低，是检测单增李斯特菌的推荐性标准，但是试验周期长达7d，无法进行快速检测。免疫学检测技术建立在抗原抗体特异性结合基础之上，针对单增李斯特氏菌已经建立了酶联免疫法(ELISA)、免疫荧光分析法、胶体金免疫层析法(GIGC)等。相比传统检测法，操作简便、灵敏、快速、可同时检测大量样品。但是免疫学方法最大的缺点是依赖特异性较高的抗体，容易出现假阳性，需用传统方法进行确认，故免疫学方法通常用于初检。对于检测已知微生物，PCR是一种重要的检测技术。在PCR反应体系中以单增李斯特菌特异DNA序列为模板，在酶、引物等作用下短时间内可实现指数扩增，完成单增李斯特菌的检测工作，常用的几种靶基因包括hlyA、iap、inlB、inlA，具有快速、灵敏和特异的优点。传统PCR检测技术扩增后需经琼脂糖凝胶电泳观察是否有目标条带以达到鉴定的目的。实时荧光定量PCR是在传统PCR反应体系中加入能与双链DNA结合的荧光染料，在合适波长下对荧光染料进行扫描，可以简便且定量地检测目标菌。实时荧光定量PCR继承了传统PCR的高灵敏性，省略了传统PCR扩增后需电泳检测的步骤,并且可以扫描荧光信号实时监测扩增情况；但是实时荧光定量PCR仪价格昂贵，对于检测人员也有较高的技术要求。

目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测LM的试剂盒。

本发明应用夹心DNA杂交探针将核酸分子杂交技术运用于LM的快速检测，特异性、准确性比普通PCR方法更高，同时可以免除昂贵的仪器投入，便于出入境和食品安全病原菌检测的推广应用。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交技术快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供使用上述试剂盒的使用方法。

为了实现上述第一个目的本发明采用如下技术方案：单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针，包括LM捕获探针和LM检测探针，其中 LM捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，LM检测探针的DNA序列为SEQ ID NO.2。

为了实现上述第一个目的本发明提供一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心 DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：包括包被了poly dT的96孔板、前处理液、菌液裂解液、裂解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其中一个微孔反应的用量为：

所述探针液由以下成分组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的LM捕获探针16μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的LM检测探针16μL；

合计32μL；

所述前处理液，体积为30μL。

裂解液，体积为30μL(裂解液由所述菌液裂解液和裂解缓冲液混合而成，两瓶浓的所述菌液裂解液，为干粉状，每瓶需用6mL裂解缓冲液裂解；所述裂解缓冲液，体积为12mL)；

所述核酸杂交液，体积为96μL；

所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；

所述显色液，体积为150μL；

所述终止液，体积为100μL；

所述阳性对照液，为LM菌液，体积为5mL；

所述阴性对照液，为非LM菌液，体积为5mL。

为了实现本发明的第三个目的，本发明提了一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测方法，包括如下步骤：

(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养待测菌液48h，获得待检样品液。

(2)菌液裂解反应将待检样品液、前处理液和裂解液按体积比4﹕1 ﹕1的比例在玻璃管中混合，放入37℃水浴锅中培养5分钟。

(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT 的微孔中，再按体积比3:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBSTBuffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值- 空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深病原菌浓度越高。

本发明的原理是：根据单核细胞增生李斯特氏菌侵袭相关蛋白(invasionassociated protein，iap)基因特性，分别设计特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸片段锚定，在检测探针末端标记辣根过氧化物酶，两种探针与目标菌靶基因特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到32CFU/mL。

夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的LM检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。本发明应用夹心DNA杂交探针将核酸分子杂交技术运用于LM的快速检测，特异性、准确性比普通PCR方法更高，同时可以免除昂贵的仪器投入，便于出入境和食品安全病原菌检测的推广应用。

本发明的优点是(1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为模版；(2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌靶基因结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：最低检出限为32CFU/mL；(5)、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性(6)、用途广：可广泛用于LM的安全快速检测。

附图说明

图1：LM的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；

图2：LM的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；

图3：阴阳性对照夹心DNA杂交扩增结果；

图1中：1-16分别为：福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、岅崎肠杆菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪链球菌、β-溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、英诺克李斯特菌；16：单核细胞增生李斯特氏菌

图2中：1、3.2×10⁷CFU/mL LM菌液，2、3.2×10⁶CFU/mL LM菌液，3、 3.2×10⁵CFU/mL LM菌液，4、3.2×10⁴CFU/mL LM菌液，5、3.2×10³CFU/mL LM 菌液，6、3.2×10²CFU/mL LM菌液，7、3.2×10¹CFU/mL LM菌液，8、3.2CFU/mL LM菌液。

具体实施方式

本发明中无特别说明的反应液，均为市售产品。

实施例1，LM夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了poly dT 的96孔板、一瓶前处理液、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：

探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的LM捕获探针16μL；DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的LM检测探针16μL；前处理液，体积为30μL；菌液裂解液，体积为30μL；核酸杂交液，体积为96μL；洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；显色液，体积为150μL；终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。

所述阳性对照液，管内为LM菌液，体积为5mL；

所述阴性对照液，管内为非LM菌液，体积为5mL。

实施例2，探针的设计

LM夹心DNA杂交探针组，其设计是根据GenBank公布的LM的nuc基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用探针设计软件 Primer 5，设计特异性探针，分别标记为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。其中探针组中捕获探针为SEQ ID NO.1；检测探针为SEQ ID NO.2；体积比为1:1；在捕获探针3’端标记poly dA，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶；所有探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。探针序列如下：

探针序列号	序列(5′～3′)
		SEQ ID NO.1	ATACGATAACATCCACGGCTCTC
SEQ ID NO.2	TCTAGTTGGCTTCGGTCGC

实施例3，阳性对照品的制备

用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养标准阳性LM菌液48h。利用平板菌落计数法测定菌液的浓度，使其浓度控制在1.0×10⁷～1.0×10⁸CFU/mL，一瓶5mL。

实施例4，阴性对照品的制备

用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养大肠杆菌48h，取出分装，一瓶5mL。

实施例5、制备待检样品的菌液模板

取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 培养48h，即为菌液模板。

实施例6、杂交条件的优化

以相同浓度单核细胞增生李斯特氏菌菌液为检测对象，分别对探针液浓度 (2μM、3μM、4μM、5μM)、探针杂交液配比(1:2、1:3、1:4、1:5)、杂交温度(35℃、45℃、55℃、65℃)、杂交时间(50min、60min、70min、80min)设计四因素四水平正交试验，确定本检测方法的最优条件。如实施例8所示。

实施例7、特异性和灵敏度

采用上述优化的杂交条件，对标准阳性单核细胞增生李斯特氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、岅崎肠杆菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪链球菌、β-溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、英诺克李斯特菌的增菌液进行检测，除单核细胞增生李斯特氏菌外，其余均无非特异性杂交，参见图1。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。

用灭菌生理盐水梯度稀释阳性LM菌液，采用上述优化的杂交条件进行反应，本发明的最低检测限分别约为32CFU/mL。

实施例8、试剂盒的组装

一块包被了poly dT的96孔板、一瓶前处理液、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶核酸杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。

实施例9、LM夹心DNA杂交技术快速检测方法，包括如下步骤：

(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养LM菌液或待检样品48h，获得LM检测菌液或待检样品液。

(2)菌液裂解反应将LM检测菌液或待检样品液与前处理液和裂解液按体积比4﹕1﹕1的比例在玻璃管中混合，放入37℃水浴锅中培养5分钟。

(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT 的微孔中，再按体积比3﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针以1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于45℃培养箱中温育70min。温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值- 空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明病原菌浓度越高。

参见图3可以明显得出+含有LM。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法

<160> 2

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

atacgataac atccacggct ctc 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

tctagttggc ttcggtcgc 19

Claims

1.单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用探针，其特征在于：包括LM捕获探针和LM检测探针，其中LM捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，LM检测探针的DNA序列为SEQID NO.2。

2.一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，包括包被了poly dT的96孔板、前处理液、菌液裂解液、裂解缓冲液、核酸杂交液、探针液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液，其特征在于：其中一个微孔反应的用量为：

所述探针液由以下成分组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的6μmol/L的LM捕获探针16μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的6μmol/L的LM检测探针16μL；

合计32μL；

所述前处理液，体积为30μL；

裂解液由所述菌液裂解液和裂解缓冲液混合而成，裂解液体积为30μL；

所述核酸杂交液，体积为96μL；

所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；

所述显色液，体积为150μL；

所述终止液，体积为100μL。

3.根据权利要求2所述单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为LM菌液；所述阴性对照液为非LM菌液。

4.一种单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交非疾病检测目的的快速检测方法，包括如下步骤：

(1)增菌用胰蛋白胨大豆肉汤培养待检菌液48h，获得待检样品液；

(2)菌液裂解反应将待检样品液、前处理液和裂解液按4﹕1:1的比例在玻璃管中混合，放入37℃水浴锅中培养5分钟；

(3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，再按3:1比例混合核酸杂交液和探针液，吸取125μL加到含有菌液的微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于培养箱中进行温育；温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度；

(4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深待测菌浓度越高。

5.根据权利要求4所述单核细胞增生李斯特氏菌夹心DNA杂交快速检测方法，其特征在于：所述探针液中LM捕获探针和LM检测探针按体积比1﹕1的比例混合。