CN107365855A - 一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法 - Google Patents

一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法 Download PDF

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CN107365855A CN201710705694.2A CN201710705694A CN107365855A CN 107365855 A CN107365855 A CN 107365855A CN 201710705694 A CN201710705694 A CN 201710705694A CN 107365855 A CN107365855 A CN 107365855A
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明公开了一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法，该方法应用微生物空气采样器按照六级过滤模式收集雾霾空气中的微生物，结合传统细菌培养法，对培养后的菌苔进行洗脱，以水煮法提取雾霾中细菌基因组DNA，应用实时荧光PCR技术对7种常见食源性致病菌进行快速筛查，同时以7种食源性致病菌目的片段构建的复合质粒DNA为阳性对照物。本发明采用的空气微生物收集方法，20min内即可完成六级过滤模式空气微生物的收集；DNA提取方法，30min内即可完成样品DNA提取的全过程；实时荧光PCR方法，90min内可完成样品的全过程鉴定，具有高效、快速、实时、操作简便等优势，为雾霾中病原微生物的快速筛查提供了技术支撑。

Description

一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法
技术领域
本发明属于空气微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及雾霾中微生物的收集和细菌基因组DNA提取，以及雾霾中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌7种病原微生物的实时荧光快速筛查方法。
背景技术
自2013年以来，我国空气污染形势严峻，大范围持续雾霾天气频发，呈现影响范围广、持续时间长、污染物浓度高等特征，雾霾已成为空气组成中备受关注的焦点，严重影响人民群众身体健康。2016年年底，世界卫生组织(WHO)与医学期刊《柳叶刀》(The Lancet)发布的数据显示，仅2015年，空气污染就造成全球640万人死亡，其中约280万人死于室内空气污染，约420万人受害于环境空气污染。这组数字十分惊人，因为在同样时间范围内，烟草致死人数为700万、艾滋病120万、结核病110万、疟疾70万，而空气污染已远远超过了这些危害性极大的传染病。2017年初，雾霾席卷了大半个中国，空气中悬浮的固体颗粒PM10和PM2.5污染受到人们的前所未有的担忧和关注，已有的科学研究表明，它们已成为当前危害公众健康的首要污染物，且于2014年1月，国家首次将雾霾天气纳入2013年自然灾情进行通报。
北京清华大学朱听课题组在北京雾霾天的大气样本中，鉴定出1300多种微生物。顾为东等提出中国式雾霾与微生物密切相关，雾霾为微生物提供了大量可附着颗粒物，可引起近地面紫外线强度减弱，从而使杀菌效果减弱，这在很大程度上增加了大气中微生物的数量。且研究发现，雾霾频发会导致大量微生物种群滋生，且改变微生物种群结构和优势微生物群落丰度，数据显示，雾霾天气微生物群落丰度较非雾霾天气微生物群落丰度呈指数增长。
空气虽不是微生物繁殖的良好场所，但土壤、水体、各种腐烂的有机物以及人和动物、植物体上的微生物，都可以随着气流运动被携带到空气中，因此空气是微生物的重要传播载体，其污染程度与我们的衣食住行息息相关。
因此，亟需针对雾霾环境中的病原微生物展开调查及安全性评估，确定风险隐患和危害程度，为风险交流与管理、科普宣传与解答公众疑虑提供科学依据，并增加民众对病原微生物的认知、自觉采取安全的防护措施。
发明内容
本发明的目的在于在筛查雾霾中的病原微生物时能够快速、简便的得到筛查结果，在第一时间控制病原微生物的蔓延，为食品安全突发事件争取有效的时间。本发明的快速筛查方法具有高效、快速、实时监测、操作简便等优势。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
(3)采用实时荧光PCR扩增引物及探针引物，对7种食源性致病菌的DNA进行扩增；
其中的实时荧光PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×Mix预混液10μL，上下游引物各1μL，探针引物0.4μL，ROX 0.4μL，模板2μL，无菌超纯水补足20μL，混匀后离心，在实时荧光PCR仪上开始循环。循环参数为：95℃预变性10min，然后进行40个循环，每个循环为95℃变性15s，60℃退火1min。
本发明所述的快速鉴定方法，其中7种病原微生物指的是：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌。
为了能更加清楚的说明本发明的快速筛查方法，下面以雾霾为样本实例，对本发明的快速筛查方法加以说明。
一、材料和引物
(1)样品：雾霾1号样本，西青区红旗农贸批发市场定点采集。
(2)主要仪器：空气微生物采样器，实时荧光定量PCR扩增仪，恒温水浴锅。
(3)主要试剂：
PCR引物、探针由上海生工公司合成，引物序列见表1。
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂购自TaKaRa公司。
表1病原微生物鉴定定量PCR引物序列
二、雾霾中病原微生物的收集及DNA提取
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
三、雾霾中病原微生物的实时荧光PCR扩增筛查试验：
1、PCR反应体系组成：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，ROX，0.4μL，供试黄瓜细菌基因组DNA模板，2μL，双蒸水补足20μL；
2、PCR反应程序：
95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；
3、实时荧光PCR扩增结果：
通过扩增曲线的有无及Ct值的大小，判断雾霾病原微生物的检出与否，结果见附图1。扩增结果为阳性的样品，再进行进一步的生化鉴定。
本发明具有的积极效果在于：
(1)采用分子生物学鉴定方法与传统培养方法相结合，有效的克服了因传统方法费时、费力、繁琐、且检测周期过长，难以满足应急预案处理的需要。
(2)本方法最大的优点在于其过程快速，简便，实时监测，充分提高了雾霾这一重要传播介质中病原微生物鉴定的检测效率。与传统的培养鉴定过程需要将近1周的时间相比，采用本方法，2天即可完成样本筛查的全过程。
(3)采用本发明方法对雾霾空气样品进行筛查，一次性可筛查的样本量相比传统培养法可大大提高。
附图说明:
图1为西青区红旗农贸批发市场雾霾样品中7种病原微生物筛查鉴定的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为病原微生物阳性对照样本；雾霾样本；空白对照样本；
图2为南开区华苑农贸市场雾霾空气样本、河西区纪庄子农贸市场雾霾空气样本、西青区津静公路收费站雾霾空气样本中7种病原微生物筛查鉴定的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为病原微生物阳性对照样本；雾霾样本；空白对照样本；
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
以南开区华苑农贸市场雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
实时荧光PCR检测：
1、对7种食源性致病菌进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
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2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，ROX，0.4μL，供试普通绿黄瓜细菌基因组DNA模板，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；
4、结果：南开区华苑农贸市场雾霾空气样本实时荧光PCR扩增结果见图2。
实施例2
以河西区纪庄子农贸市场雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
实时荧光PCR检测：
1、对7种食源性致病菌进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
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SM-R：5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’
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2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，ROX，0.4μL，供试普通绿黄瓜细菌基因组DNA模板，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；
4、结果：河西区纪庄子农贸市场雾霾空气样本实时荧光PCR扩增结果见图2。
实施例3
以西青区津静公路收费站雾霾空气为样本，采用本发明方法快速筛查7种病原微生物。制备方法如下：
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
实时荧光PCR检测：
1、对7种食源性致病菌进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
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2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，ROX，0.4μL，供试普通绿黄瓜细菌基因组DNA模板，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性10min；40个扩增循环(95℃，15sec；60℃，1min)；
4、结果：西青区津静公路收费站雾霾空气样本实时荧光PCR扩增结果见图2。
序列表
<110> 天津市农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法
<160> 21
<210> 1
<211> 19 bp
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtaat*gg*tt gtt*cg*caa 18

Claims (4)

1.用于鉴定7种病原微生物的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括沙门氏菌引物正向序列：5′-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3′，反向序列：5′-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3′，探针序列：5′-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-BHQ1-3′；金黄色葡萄球菌引物正向序列：5′-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3′，反向序列：5′-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3′，探针序列：5′-FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-BHQ1-3′；大肠杆菌O157:H7引物正向序列：5′-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3′，反向序列：5′-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3′，探针序列：5′-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-BHQ1-3′；单增李斯特氏菌引物正向序列：5′-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3′，反向序列：5′-CGCGACCGAAGCCAACTA-3′，探针序列：5′-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-BHQ1-3′；志贺氏菌引物正向序列：5′-CGCAATACCTCCGGATTCC-3′，反向序列：5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3′，探针序列：5′-FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-BHQ1-3′；副溶血性弧菌引物正向序列：5′-GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGT-3′，反向序列：5′-CATTCGCGTGGCAAACATC-3′，探针序列：5′-FAM-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-BHQ1-3′；蜡样芽孢杆菌引物正向序列：5′-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3′，反向序列：5′-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3′，探针序列：5′-FAM-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3′；。
2.用于实时荧光PCR筛查雾霾中7种病原微生物构建的复合质粒DNA阳性对照物，其特征在于，
GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCTTTTACATACAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACATTGTTATCAACATTCATTTATAAAATCGCGAATGAGCGTTTATTTAGTCGTGAAGAAATCGACTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTCGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACGTTGGTATTTATGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGGTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGATCGAGCGGCGTTGGAGAGTGATAACGGCAGGCGCAGTCTTTAGCATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCTGCGTGGTACGCTGCGCATCCTGCTTTTTCCATTGCTATCGAATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTACCCTGTCCACACGATGCCAATGTACTCGGAAAAATATCAAAAGCACCCTATAGCTGAGGAATCGACGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGAATCGACATTCGCGTGGCAAACATCAAACTGTTCGCACAAGGCTCGACGGCTGAATCGACAATTAATATTTCAGAGAAAGGTCGCATCGAGTCGTAATGACAGGTGATGGAGAGCTACGTACTTTGACGAAAGAAGCATTTGAATTTGGATATCGTAAGAGTGTATTTGCGAACAACCATTACATTATTCTTGAAGCGAGATTTGAACTTGAAGAAGG。
3.一种快速筛查雾霾中病原微生物的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
(1)采用六级过滤模式空气微生物采样器，于20min内定点收集雾霾中的微生物，将收集好的平板，36℃培养箱过夜培养；
(2)用灭菌的磷酸盐缓冲液1mL洗脱菌苔于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100μL去离子水中，封口膜封好，沸水浴10min，取出后迅速冷冻于-20℃冰箱中10min，去掉封口膜，13200rpm离心3min，上清即为DNA；
(3)采用实时荧光PCR扩增引物及探针引物，对7种食源性致病菌的DNA进行扩增；
其中的实时荧光PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×Mix预混液10μL，上下游引物各1μL，探针引物0.4μL，ROX 0.4μL，模板2μL，无菌超纯水补足20μL，混匀后离心，在实时荧光PCR仪上开始循环。循环参数为：95℃预变性10min，然后进行40个循环，每个循环为95℃变性15s，60℃退火1min。
4.利要求1、2所述的快速鉴定方法，其中7种病原微生物指的是：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108410952A (zh) * 2018-05-11 2018-08-17 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 单核细胞增生李斯特氏菌夹心dna杂交快速检测用探针、试剂盒和检测方法
CN112831603A (zh) * 2021-01-27 2021-05-25 河南省疾病预防控制中心 基于多重pcr技术检测食源性致病菌的试剂盒及方法

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