CN109295181B

CN109295181B - 一种用于检测细菌的杂交干扰实时pcr方法

Info

Publication number: CN109295181B
Application number: CN201810895495.7A
Authority: CN
Inventors: 徐华; 张嫄; 王满妮; 左琴琴; 彭鹏; 王锦; 褚晓月; 张薇薇; 毛娟; 兰静
Original assignee: XI'AN CITY CENTRAL BLOOD SUPPLY STATION
Current assignee: XI'AN CITY CENTRAL BLOOD SUPPLY STATION
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN109295181A

Abstract

本发明公开了一种用于检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，该方法如下：将等体积量的基础DNA模板和等量无菌双蒸水混合作为对照组；将等体积量的基础DNA模板和待检样本提取物混合为检测组；在检测组和对照组中加入引物试剂，在实时荧光定量PCR仪器中进行扩增反应，观察检测组和对照组中基础模板的Ct值，当检测组相对对照组中的对照组中的基础模板的Ct值变大，则得出待检样本中存在对扩增起到干扰作用的细菌DNA。所述方法用于非疾病诊断目的。反应体系只需要一对引物，DNA扩增酶为普通的扩增酶，在检测过程中，只需要在体系中加入待检的样本，接观察循环阈值的变化即可判定是否有细菌的DNA存在。

Description

一种用于检测细菌的杂交干扰实时PCR方法

技术领域

本发明属于细菌基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的杂交干扰实时PCR方法。

背景技术

细菌是是所有生物中数量最多的一类，人类生活环境中常见的革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌和肺炎链球菌等，常见的大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌和肉毒杆菌等。这些细菌相当一部分是条件致病菌，即存在于健康人体以及日常接触的物品和食物中，但在特定条件下可致病，与其毒力、侵入数量及侵入途径有关，如有伤口导致细菌进入血液、免疫力降低、使用被细菌污染的血液制品、食物活饮水中细菌的数量超标等，其中侵入或者污染的细菌数量尤为重要。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但大量增殖后可以引起皮肤感染、肺炎、脑膜炎和败血症等。因此对于食品、药品尤其是血液制品等，最为重要的是检测出是否存在被细菌污染的情况，使用的方法应敏感可靠和及时，从而能够有效保障公众的健康。

细菌培养是检测细菌传统的方法，通过对样本培养来检测细菌，传统的平板培养方法培养时间一般至少要求48小时，并且后续需要染色和检测等过程，工作量较大。全自动微生物检测系统是基于细菌培养方法基础上的自动检测系统，目前被美国FDA批准的用于细菌检测的常规培养系统有： BacT/ALERT系统、PALL eBDS系统。BacT/ALERT系统是将样本接种于含有肉汤培养基的培养瓶中有氧培养和无氧培养，通过仪器检测CO2的生成量来监测细菌的生长量，一般培养24小时。如果仪器报警阳性结果，表明 CO2的含量超过了警戒线，还需要将报警样本取出一部分进行革兰氏染色，一部分接种平板培养基。如果仪器报警阳性，平板培养阳性的样本证明样本被细菌污染；如果仪器报警阳性，平板培养阴性，说明是假阳性。BacT/ALERT 系统的缺点是所需要的时间比较长，通常需要48小时以上，并有一定的假阳性率。PALL eBDS系统是通过检测O2的消耗量来判断样品是否被细菌污染，当O2浓度小于9.4％时判断为阳性。该系统只对需氧菌和兼性厌氧菌有效，对厌氧菌无效。BacT/ALERT系统和PALL eBDS系统检测样品细菌污染都需要两个时段：①细菌增殖阶段，通常需要24小时；②培养至系统报警，也需要一定时间。对于生长速度较快的细菌，CO2的生成量和O2的消耗量变化明显，对于生长慢的细菌，如痤疮丙酸杆菌需要很长培养时间才能检测到阳性，用上述培养的方法检测会出现假阴性的结果。

16S rDNA和23S rDNA是细菌基因组DNA的保守序列，文献中引物的设计主要是针对细菌核糖体小亚基16S rDNA设计。16S rDNA是编码原核生物16S rRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物基因组中，由多个保守区和多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或者种特异性。常见检测16S rDNA 的方法有用荧光定量PCR的平台和环介导的等温扩增技术等，也有用常规 PCR扩增16S rDNA片段后电泳或者用胶体金的方法进行检测。荧光定量 PCR检测是指在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。有文献报道针对20余种常见致病性细菌设计扩增细菌16S rDNA的荧光定量PCR通用引物，检测细菌污染模拟标本，灵敏度可达105CFU/ml。环介导的等温扩增技术是一种新型的核酸扩增技术，在60-65℃等温的条件下，针对目的片段设计4～6条特殊引物，由具有链置换活性的Bst DNA聚合酶催化生成一系列大小不等的DNA片段，具有简单、快速、特异性强、扩增效率高等优点。利用等温扩增检测细菌已有文献报道和专利授权。

建立在扩增细菌16S rDNA检测细菌有无方法的优点为检测时间短，从提DNA到最后判定结果一般需要4小时，具有显著的实用价值。但这几种方法也存在明显的缺点：由于PCR尤其是等温扩增技术的高扩增效率导致检测结果的假阳性率明显偏高，即使很少的细菌DNA污染(如实验室扩增中形成的含有细菌DNA的气溶胶)，也会在其后的DNA扩增反应中高效扩增，导致假阳性的结果。由于分子生物学实验室均存在不同程度的DNA残留，因此这个问题很难以被克服，通常采用的方法是加样、扩增和结果观察区域采用较远距离的物理分区隔离，但效果也并不理想；此外抽提细菌DNA 的过程中易受空气中细菌污染，微量的DNA也会造成骄阳性的结果。此外由于DNA的高效扩增，对于低含量但往往不具备致病性的细菌也出现阳性结果，即现有检测细菌的分子生物学方法很难控制检出的灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，反应体系只需要一对引物，在检测过程中，只需要在体系中加入待检的样本，检测结果不需要电泳或测序等手段，直接观察Ct值的变化即可判定是否有细菌的DNA存在。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，该方法包括如下：将等体积量的基础DNA模板和等量无菌双蒸水混合作为对照组；将等体积量的基础DNA模板和待检样本提取物混合为检测组；在检测组和对照组中加入引物试剂，在实时荧光定量PCR 仪器中进行扩增反应，观察检测组和对照组中基础模板的Ct值，当检测组相对对照组中的对照组中的基础模板的Ct值变大，则得出待检样本中存在对扩增起到干扰作用的细菌DNA。所述方法用于非疾病诊断目的。

进一步地，该基础DNA模板的初级序列如下：

TGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGTGAACGCTGGCGGCGCCTAACA CATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGG TGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGG TGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATC GCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGG TTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTAC ACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG AGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAG GGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTGAACAAGGTAACCGTAGGAATGCGGTTGGATCACCTCCTTA。

进一步地，该基础DNA模板由所述初级序列使用特异性引物扩增而得到，其序列如下：

GCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGT GGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGAC TCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGG GTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACG GCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCC ACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGAC TCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCC TTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTG。

进一步地，该引物试剂包括特异性扩增基础DNA模板的上游引物和下游引物：上游引物SEQ ID NO1序列为：TGCCAGCAGCCGCGGTAATAC；下游引物SEQ ID NO2序列为GCTACACACGTGCTACAATG；扩增长度为 294bp。

进一步地，该细菌DNA为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌或肉毒杆菌的DNA。

进一步地，该特异性引物为：上游引物SEQ ID NO3序列为：GCCTAACACATGCAAGTCG；下游引物SEQ ID NO4序列为 CACACCATGGGGTGAAGTCGT；扩增长度为513bp。

本发明还公开了一种基础DNA模板，其初级序列如下：

TGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGTGAACGCTGGCGGCGCCTAACAC ATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGGT GAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGT GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATCG CCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTT AAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTACAC CAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAG GCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGGG AATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTGAACAAGGTAACCGTAGGAATGCGGTTGGATCACCTCCTTA。

进一步地，该基础DNA模板由初级序列使用特异性引物扩增而得到，其序列如下：

本发明还公开了一种基础DNA模板在杂交干扰实时PCR方法中用于细菌检测的应用。

本发明一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法具有如下优点：1.经济、简便和直观，具有很好的稳定性和重复性。2.细菌的DNA作为一种干扰因子而不是扩增模板被引入体系中，避免了直接扩增细菌DNA的方法易出现假阳性的缺点。另一方面必须具有一定数量的细菌DNA才能产生显著的干扰效果，少许环境中的细菌DNA不会对检测结果产生影响，目前测试的检测下限为细菌浓度为100CFU/ml，提取的DNA量远高于环境及可能的气溶胶污染中存在的细菌DNA量。因此具有很好的准确性和重复性。3.在本发明设计的检测体系中，只需要加入细菌DNA，操作简便，检测体系的稳定性很好。4.可以通过调整本发明中检测体系的组分，可以满足对不同检测细菌敏感度的要求。如当基础DNA模板和引物的量增加时，作为扩增体系的干扰因素，要产生明显的干扰作用，细菌的DNA的量也要相应增加，这就建立起了基础DNA模板和引物的量与细菌DNA的量之间相互对应的关系；同样，要检测较少量的细菌DNA，只需要减少扩增体系中的基础模板和引物的量，使扩增体系对少量细菌DNA的干扰敏感。

附图说明

图1是基础DNA模板设计的原理图；

图2是本发明中不同的基础DNA模板浓度对细菌DNA的干扰的敏感度；

图3是本发明中不同浓度的细菌DNA对基础DNA模板的干扰度；

具体实施方式

本发明公开了一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，该方法包括如下：一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，该方法包括如下：将等体积量的基础DNA模板和等量无菌双蒸水混合作为对照组；将等体积量的基础 DNA模板和待检样本提取物混合为检测组；在检测组和对照组中加入引物试剂，在实时荧光定量PCR仪器中进行扩增反应，观察检测组和对照组中基础模板的Ct值，当检测组相对对照组中的对照组中的基础模板的Ct值变大，则得出待检样本中存在对扩增起到干扰作用的细菌DNA。所述方法用于非疾病诊断目的。

上述方法采用的PCR反应体系为20μl，对照组和检测组的模板量均为 2μl，引物试剂为18μl，引物试剂包括扩增DNA基础模板的上游引物、下游引物和Mix液(SelectMaster Mix,Applied Biosystems^TM 4472908) 及双蒸水。该PCR反应体系包括10μl 2倍Mix液，10uM的上游引物和下游引物各0.4ul，终浓度0.2μmol/L，基础DNA模板1μl，其浓度为1.5× 10^-10g/L，待检样本1μl，加双蒸水7.2ul。将上述反应体系混匀后放入实时荧光定量PCR仪，设定的扩增条件为：95℃变性5分钟，然后进行33个循环的PCR反应，即95℃下持续30秒，64℃下持续40秒和72℃下持续30秒。上游引物SEQ ID NO1序列为：TGCCAGCAGCCGCGGTAATAC；下游引物 SEQ ID NO2序列为GCTACACACGTGCTACAATG；扩增长度为294bp。扩增所用的引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2只能特异性地扩增初级序列，而不能扩增人类DNA和细菌DNA。

上述基础DNA模板的制备过程如下：通过检索常见细菌的16S rDNA，比对不同细菌之间在16S rDNA序列中的相同部分，以大肠杆菌的16S rDNA 为参考模板，与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌和肉毒杆菌的16S rDNA进行比对，如图1所示，图1中黑色部分即为这些细菌的16SrDNA 中相同的序列。依据比对结果，挑选其中较长的相同序列，即连续>20bp的序列，将这些相同的序列以及其互补序列予以交错拼接，形成基础模板的初级序列，长度为590bp。初级序列如下：

将上述初级序列交由生物公司合成，连接入质粒后，导入感受态大肠杆菌，将细菌通过培养增殖后，获得稳定的模板基因来源。提取DNA，采用一对特异性引物进行扩增，获得高浓度和高纯度的基础DNA模板。所用的上、下游引物均位于模板的初级序列中；采用的PCR反应体系为25μl，所初级序列模板为2μl，引物及试剂为23μl，包括特异性扩增基础DNA模板的上游引物、下游引物、DNA扩增酶、dNTP、Mg²⁺和双蒸水。上游引物SEQ ID NO3序列为：GCCTAACACATGCAAGTCG；下游引物SEQ ID NO4序列为CACACCATGGGGTGAAGTCGT；扩增长度为513bp。扩增所用的引物 SEQ ID NO3和SEQ ID NO4只能特异性地扩增初级序列，而不能扩增人类 DNA和细菌DNA。

该PCR反应体系包括2.5μl 10倍缓冲溶液，2.0μl浓度为2.5mM的dNTP 混合物，0.5μl浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，1.5μl浓度为25mM的MgCl₂溶液，上游引物和下游引物各0.6ul，终浓度0.3μmol/L，初级序列模板2μl，和双蒸水15.3ul。扩增条件为：94℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR 反应，即94℃下持续30秒，62℃下持续30秒和72℃下持续30秒，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。获得高纯度和单一的检测用基础DNA 模板，其序列如下：

上述细菌DNA为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌或肉毒杆菌的DNA。

本发明还公开了上述方法中使用的一种基础DNA模板，其其初级序列如下：

该基础DNA模板由初级序列使用特异性引物扩增而得到，其序列如下： GCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGT GGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTG GCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAG GGTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTAC GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGC CACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGA CTCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGC CTTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTG。

本发明还公开了上述一种基础DNA模板在杂交干扰实时PCR方法中用于细菌检测的应用。

图2所示为本发明不同浓度的基础DNA模板对细菌DNA的干扰的敏感度，图中所示当基础模板浓度由7.5×10^-10g/L稀释5倍至1.5×10^-10g/L时，循环阈值由Ct表示，Ct值右移，即达到荧光阈值的循环数增加，则提示可以通过调整基础DNA模板浓度控制检测的敏感度。本发明中使用的细菌DNA提取自浓度为10CFU/ml的菌液，检测结果显示本方法具有很高的灵敏度；在测试中，每次加样为3孔，均有一致的曲线，显示本方法具有很好的稳定性和重复性。

图3所示为本发明不同浓度的细菌DNA对基础DNA模板的干扰度，图中所示基础模板浓度为7.5×10^-10g/L，使用的细菌DNA提取自浓度为 10CFU/ml的菌液；当细菌DNA稀释一倍后，Ct值已无明显变化，说明随着细菌DNA浓度的下降，对反应体系的干扰效果不明显，这项对比提供了细菌DNA对实时PCR反应体系的干扰证据；在测试中，每次加样为3孔，均有一致的曲线，显示本测试方法具有很好的稳定性和重复性。

本发明中设计建立一种特定序列的基础DNA模板，并以此模板设计引物，能够在体系中稳定扩增基础模板。细菌DNA的16S rDNA序列与基础 DNA模板存在相同或者互补的情况，因此在扩增体系中，加入细菌DNA，在高温变性后，在退火阶段可以与基础模板或者引物发生互补结合，即杂交，从而导致对原有体系的扩增效率的干扰，即细菌DNA作为一种干扰因素而不是扩增模板被引入。

将本发明制定的基础模板序列与美国国立卫生研究院(NIH)的Genbank 数据库进行比对，比对结果显示，本发明制定的基础模板序列与数据库中所有细菌的基因序列重合率不超过37％，并且重合的序列在细菌的基因中不连续；除与细菌的部分基因序列有重合部分，与其它生物基因无重合。

<110> 西安市中心血站

<120> 一种用于检测细菌的杂交干扰实时PCR方法

<130> 无

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 基础DNA模板的初级序列

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 基础DNA模板的初级序列

TGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGTGAACGCTGGCGGCGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTGAACAAGGTAACCGTAGGAATGCGGTTGGATCACCTCCTTA 590

<210> 基础DNA模板的序列

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 基础DNA模板的序列

GCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTG 513

<210> SEQ ID NO1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO1

TGCCAGCAGCCGCGGTAATAC 21

<210> SEQ ID NO4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO4

GCTACACACGTGCTACAATG 20

<210> SEQ ID NO3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO3

GCCTAACACATGCAAGTCG 19

<210> SEQ ID NO4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO4

CACACCATGGGGTGAAGTCGT 21

Claims

1.一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，其特征在于，该方法包括如下：将等体积量的基础DNA模板和等量无菌双蒸水混合作为对照组；将等体积量的基础DNA模板和待检样本提取物混合为检测组；在检测组和对照组中加入引物试剂，在实时荧光定量PCR仪器中进行扩增反应，当检测组相对对照组中的基础模板的循环阈值变大，则得出待检样本中存在对扩增起到干扰作用的细菌DNA；所述方法用于非疾病诊断目的；

所述基础DNA模板的序列如下：

GCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTG；

所述引物试剂包括特异性扩增基础DNA模板的上游引物和下游引物：上游引物SEQ IDNO1序列为：TGCCAGCAGCCGCGGTAATAC；下游引物SEQ ID NO2序列为GCTACACACGTGCTACAATG；扩增长度为294bp。

2.根据权利要求1所述的一种检测细菌的杂交干扰实时PCR方法，其特征在于，所述细菌DNA为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、无芽胞厌氧菌或肉毒杆菌的DNA。

3.一种基础DNA模板，其特征在于，其序列如下：

GCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGGCGAAGGCGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGTGGACTACCAGGGTATCTAATCGCCGTAAACGATGAGCTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATTAAGCTTGCAACGCGAAGAACCTTACCATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGCATTGTAGCACGTGTGTAGCGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGGGAATCGCTAGTAATCGTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTACGACTTCACCCCATGGTGTG。

4.根据权利要求3所述的一种基础DNA模板在非疾病诊断目时用于杂交干扰实时PCR方法中用于细菌检测的应用。