CN106191266B

CN106191266B - 基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的方法

Info

Publication number: CN106191266B
Application number: CN201610579267.XA
Authority: CN
Inventors: 姜玮; 王磊; 朱德颂
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: CN106191266A

Abstract

本发明公开了一种基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的方法。本发明通过将掩蔽效应应用于生物传感，设计DNA掩蔽单链，与过量识别探针杂交为稳定双链，消除了过量识别探针去除不完全而导致的假阳性信号，同时结合目标物的结合保护效应，触发级联的信号放大，包括SDA和ERCA，实现对转录因子及实际样品的高灵敏检测。

Description

基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的方法

技术领域

本发明涉及一种基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的方法。

背景技术

在人类基因调控过程中，转录因子(TFs)发挥关键作用。TFs通过识别位于基因调控区域中的一小段双链DNA序列进行基因信息的传递(DNA到RNA的表达)。TFs的正常调控对于细胞发育，细胞分化和增长等过程至关重要，而TFs的调控异常变化将会导致一系列疾病，例如，发育障碍，异常激素反应，炎症和癌症等。核因子κB(NF-κB)是一类广泛存在于各种细胞的转录因子，通常以二聚体形式存在于细胞质中，受到外界刺激时通过结合基因组中的κB位点对炎症和免疫等重要生物过程进行调控。但NF-κB的异常调控将会导致癌症、炎症等疾病。转录因子的表达水平能够敏感地反映出细胞发展过程和疾病状态，目前已被作为医学诊断和药物开发的重要标志物。

在疾病的早期阶段，TFs通常呈现较低的表达水平，因此，通过适当的信号扩增技术对 TFs进行高灵敏检测对于疾病的预防及早期诊断至关重要。外切酶切割辅助的荧光扩增检测法是最常用的转录因子的扩增检测途径，灵敏度高，但需要利用一种或两种外切酶切割过量识别探针，切割不完全将会导致识别探针进入下游信号输出过程，引起假阳性信号。所以，构建无需外切酶参与的高灵敏荧光检测策略具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的方法。通过将配位分析中的消除干扰的手段-掩蔽反应，应用于生物传感，设计DNA掩蔽单链，与过量识别探针杂交为稳定双链，避免了过量识别探针去除不完全而导致的假阳性信号，同时结合目标物的保护效应，触发级联的信号放大，实现了对转录因子的高灵敏度检测。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于检测转录因子的发夹识别探针，包括：

位于发夹识别探针茎部的转录因子识别序列，和位于发夹识别探针末端的用于链置换扩增反应(SDA)的引物序列。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种用于检测NF-κB p50的发夹识别探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：

发夹识别探针：5′-TTTTTAAAAAGGGACTTTCCCCCGCCTCCTCGCCGCCCGCTCGC CGCCTCCACCGCCCGGAAAGTCCCTTTTTAAAAATGAGGGTTCCAAGGAAAGTCAT-3′； (SEQ ID NO.1)；(序列中，粗体区域为目标物TF的识别序列，下划线区域为SDA的引物)。

本发明的第二方面，提供一种DNA掩蔽链，用于去除过量的发夹识别探针，所述DNA掩蔽链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体如下：

DNA掩蔽链：5′-ATGACTTTCCTTGGAACCCTCATTTTTAAAAAGGGACTTTCCGGGC GGTGGAGGCGGCGAGCGGGCGGCGAGGAGGCGGGGGAAAGTCCCTTTTTAAAAA-3′； (SEQ ID NO.2)。

本发明的第三方面，提供一种检测转录因子的试剂，包含：

上述发夹识别探针、DNA掩蔽链，以及模板链、滚环扩增引物和环状模板；

所述模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

模板链：5′-GGGAGTTGAGTGCTGAGGATGACTTTCCTTGGAACCCTCA-3′；(SEQ ID NO.3)(序列中阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点)

所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

5’-TCAGCACTCAACTCCC-3’(SEQ ID NO.4)；

所述环状模板包括：滚环扩增引物的互补序列，切刻酶识别位点和G四倍体的互补序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述滚环模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：

5’-AGTGCTGAGGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTGCTGAGGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTGCTGAGGGAGTTG-3’(SEQ ID NO.5)。(序列中，阴影部分为内切酶Nt.BbvCI 的识别位点，斜粗体部分为滚环扩增引物互补序列；正常字体部分 CCCTAACCCTAACCCTAACCCT为G四倍体的互补序列)。

进一步的，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI内切酶、T4DNA连接酶和Phi29DNA 聚合酶。

本发明的第三方面，提供一种检测转录因子的方法，步骤如下：

(1)向待检测样品中加入发夹识别探针，进行识别结合反应；

(2)向步骤(1)的反应体系中加入DNA掩蔽链，进行掩蔽反应；

(3)向步骤(2)的反应体系中依次加入dNTPs、KF聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行链置换反应；

(4)向步骤(3)的反应体系中加入环状模板和T4DNA连接酶，恒温反应，然后再加入dNTPs、Phi29DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行指数滚环扩增反应(ERCA)；

(5)向步骤(4)反应后的溶液中加入KCl，ThT，孵育，检测荧光强度，构建净荧光强度与转录因子浓度之间的线性方程，对样品中的转录因子含量进行定量检测。

步骤(1)中，所述识别结合反应是在Cutsmart缓冲体系中进行的；所述Cutsmart缓冲体系的组成为：20mM Tris-HAC，50mM KAC，10mM MgAC₂，100ug/mL BSA，pH 7.9。

步骤(1)中，所述识别结合反应的条件为：37℃恒温箱中，反应2-4h，优选为3h。

步骤(2)中，所述掩蔽反应的条件为：37℃下反应0.5-1h。

步骤(3)中，所述链置换反应的条件为：37℃下反应0.5-1.0h，然后于85℃失活0.5h，结束反应。

步骤(4)中，指数滚环扩增反应的条件为：37℃下反应2-4h，然后于75℃失活0.5h，结束反应。

步骤(5)中，荧光强度检测的光谱条件为：激发波长425nm，发射波长498nm，狭缝宽度均为5nm，电压700V，荧光光谱收集范围：450nm-650nm。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(4)，构建的净荧光强度与转录因子(NF-κBp50) 浓度之间的线性方程为：△F＝2939+227log₁₀C(C：M,R²＝0.993)。

上述线性方程的线性范围为1.5×10^-13M-1.0×10^-8M。

本发明的基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的原理为：

将配位分析中常用的消除干扰的手段—掩蔽反应，应用于生物传感，设计DNA掩蔽链，去除过量识别探针，避免了过量识别探针去除不完全而导致的假阳性信号，同时结合目标物的保护效应，触发级联的信号扩增(链置换扩增SDA和指数滚环扩增ERCA)，实现目标物的高灵敏检测，如图1所示，设计发夹识别探针、DNA掩蔽链、模板链、滚环扩增引物和环状模板，其中：发夹识别探针的茎部为目标物转录因子的识别序列，末端为引物序列。当目标物不存在时，DNA掩蔽链与发夹识别探针的末端引物序列杂交，进而打开发夹，形成稳定的双链结构。末端的引物序列被封闭在双链中，无法与模板链杂交，进而无法引发后续级联的信号放大。

目标物(转录因子)存在时，目标物与发夹识别探针结合形成复合物，位阻效应导致DNA 掩蔽链无法靠近发夹识别探针，因此，发夹识别探针的末端引物序列可与模板链杂交，模板链中包含内切酶(Nt.BbvCI)的识别序列，接着在聚合酶(Klenow fragment)和内切酶 (Nt.BbvCI)的作用下发生聚合、延伸、切割介导的SDA，产生大量单链DNA，单链DNA 作为引物，在T4连接酶(T4DNA ligase)作用下与环状模板杂交，然后在Phi29聚合酶(Phi29 DNApolymerase)和内切酶(Nt.BbvCI)的作用下进行聚合-延伸-切割-连接-聚合介导的ERCA。

其中，滚环模板的设计尤为重要，它包括三部分：引物的互补序列，Nt.BbvCI的识别位点和G四倍体的互补序列。经过两步级联扩增，产生大量的G四倍体，插入硫磺素T(ThT)获得荧光信号，利用荧光强度的变化实现了目标物转录因子的高灵敏检测(在本发明的一个具体实施方式中，对于NF-κB p50检测的灵敏度为0.1pM)。本发明的检测策略避免了外切酶的引入，反应中的过量识别探针与掩蔽链杂交形成稳定的双链结构，无法引发后续的信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。此外，本策略还实现了实际样品中的NF-κB p50的检测，在临床诊断和药物开发领域具有广阔的应用前景。

本发明的有益效果：

本发明的用于检测转录因子的检测试剂和检测方法是基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略进行设计的，能够用于转录因子的高灵敏检测。本发明的检测方法消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号，同时实现了对核转录因子的高灵敏检测，灵敏度可达0.1pM。可用于实际样品中的转录因子的检测，为临床诊断和药物开发提供了一种具有潜力的研究工具。

附图说明

图1：基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子的原理图。

图2：协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的信号放大高灵敏检测转录因子的可行性研究；图中，a：染料Th T的荧光强度，b：阴性(Negative)的荧光强度，c：目标物存在时(Positive) 的荧光强度。

图3：荧光强度与目标物NF-кB p50浓度的线性关系。

图4：协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大高灵敏检测转录因子的特异性；图中，1-人凝血酶，2-人免疫球蛋白G，3-BSA，4-NF-κB p50，5-混合样品，误差棒为三次重复测定的标准偏差。

图5：冬凌草素的抑制效应考察。

图6：协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的信号放大用于实际样品的检测；图中，a：Hela细胞核提取液，b：Hela细胞核提取液与冬凌草素的混合物，c：Hela细胞裂解缓冲液。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实验试剂和仪器：

本发明实施例中所用到的实验试剂和仪器如下：

荧光分光光度计(F-7000，Hitachi，日本)，电热恒温培养箱(DNP-9052型，上海精宏实验设备有限公司，上海)，高速微量离心机(Pico 17，美国)，电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)，超声波清洗机(Branson-200型，中美合资必能信超有限公司，上海)，干式恒温器(K30，杭州奥盛仪器有限公司，杭州)，涡旋震荡器(H-101型，上海康禾光电仪器有限公司，上海)，酸度计(pHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司，上海)。

重组NF-κB p50由Cayman Chemical(Ann Arbor,MI,USA)提供，肿瘤坏死因子(TNF-α) 激活的海拉细胞核提取物购于Active Motif(Carlsbad,CA,USA)，人凝血酶、人免疫球蛋白G、牛血清白蛋白(BSA)均购于Sigma-Aldrich Co.(St Louis,MO,USA)，KF聚合酶(Klenow fragment)、内切酶(Nt.BbvCI)、T4连接酶(T4DNA ligase)以及Phi29聚合酶(Phi29DNA polymerase)均购于New England Biolabs(Ipswich,MA)，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)购于上海生物工程有限公司，冬凌草素购于广润生物科技有限公司(南京，中国)。荧光染料硫磺素T(ThT)购于Abcam(剑桥，英国)。其它试剂均来自上海国药集团化学试剂有限公司。

缓冲溶液Cutsmart：20mM Tris-HAC，50mM KAC，10mM MgAC₂，100ug/mL BSA， pH7.9。

T4链接反应缓冲溶液：50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP，pH 7.5。

裂解缓冲溶液(Lysis Buffer)：20mM Hepes(pH 7.5)，350mM NaCl，20％glycerol,1mM MgCl2,0.5mM EDTA and 0.1mM EGTA,5mM DTT.

实验中所用溶液均采用高纯水(>18.25MΩ)配制。

实验中所用核酸链均委托上海生物工程有限公司合成和纯化。本发明实施例中所用到的核酸链具体见表1。

表1：

表中粗体区域为目标物TF的识别序列，下划线区域为SDA的引物，阴影部分为内切酶 Nt.BbvCI的识别位点，斜粗体部分为滚环扩增引物互补序列。环状模板中的CCCTAACCCTAACCCTAACCCT为G四倍体的互补序列

实施例1：基于协同的掩蔽效应和结合保护效应介导的级联信号放大策略检测转录因子 (NF-κB p50)

具体方法如下：

(1)目标物与发夹识别探针的结合

在10μL的反应体系中包含1μL Cutsmart，40nM发夹识别探针，不同浓度的NF-κBp50 或实际样品，反应体系体积为10μL，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应3h。

(2)掩蔽反应

在11μL的反应体系中包含10μL的结合产物，1μM DNA掩蔽链,轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应0.5h。

(3)链置换扩增(SDA)

在20μL的反应体系中包含11μL的掩蔽反应产物，2μL Cutsmart，1.5mM dNTPs，1UKlenow fragment，2U Nt.BbvCI，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应0.5h，然后，85℃失活0.5h。

(4)指数滚环扩增(ERCA)

ERCA包括连接反应和扩增反应。连接反应在30μL的反应体系中进行，包含20μL的SDA产物，3μL T4连接buffer，1μM滚环模板,120U T4连接酶,轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应1h，然后，扩增反应在40μL的反应体系中进行，包含30μL的连接反应产物， 2μLCutsmart，1.5mM dNTPs，3U Phi29DNA polymerase，3U Nt.BbvCI,轻微振荡后置于 37℃恒温箱，反应3h，然后，75℃失活0.5h。

(5)荧光光谱的测量

向反应体系中加入KCl，ThT，反应体系总体积为50μL，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应0.5h后测定荧光强度。参数设置如下：激发波长425nm，发射波长498nm，狭缝宽度均为5nm，电压700V，荧光光谱收集范围：450nm-650nm。

构建净荧光强度与转录因子浓度之间的线性方程，△F＝2939+227log₁₀C(C：M, R²＝0.993)。对待测样品，可通过测定样品的净荧光强度，代入线性方程，计算待测样品的转录因子浓度。

实施例2：本发明的检测方法的可行性研究

为了验证本发明的检测方法的可行性，本发明通过测定不同条件下的荧光强度来考察本文提出的新型检测策略的可行性，如图2所示。可以看出，染料ThT(曲线a)和阴性(曲线b)显示出较为微弱的荧光，说明不存在目标物NF-κB p50时，掩蔽链与识别探针杂交形成稳定的双链结构，紫色末端被封闭在双链中，无法与模板链杂交，引发后续级联的信号放大。目标物存在时，荧光强度显著增强(曲线c)，表明目标物与识别探针结合形成复合物，位阻效应导致掩蔽链无法靠近识别探针，因此，末端的引物可与模板链杂交，引发级联的SDA和ERCA。此检测方法避免了外切酶的引入，反应中的过量的识别探针通过掩蔽效应被封闭，无法引发后续的信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。

实施例3：本发明的检测方法的灵敏度考察

通过测定目标物不同浓度对应的荧光强度，可以确定本方法的线性范围和灵敏度。如图 3所示。可以看出，目标物浓度在1.5×10^-13M-1.0×10^-8M范围内时，ΔF与目标物浓度的对数呈线性关系(R²＝0.993)，经估算本检测方法的LOD为1.0×10^-13M，优于大多数文献报道的灵敏度。

实施例4：本发明的检测方法的特异性考察

特异性是评价检测方法的重要指标，为了验证该检测策略对转录因子的特异性，我们对干扰蛋白质的非特异性结合情况进行了考察，如图4所示。当检测体系中只有人凝血酶或人免疫球蛋白G或BSA时，体系显示的荧光强度远远小于存在目标物NF-κB p50时的荧光强度。但当检测体系中存在混合样品时，能够获得与只有NF-κB p50时相当的荧光强度，充分说明该检测策略对转录因子具有良好的特异性。

实施例5：本发明的检测方法的精密度和重现性考察

精密度和重现性是衡量分析方法实际应用的重要参数，我们考察了日内精密度和日间精密度。我们选取三个浓度并计算其相对标准偏差(RSD)(n＝3)。结果表明，一次实验中，在 10nM、0.1nM和1pM三个不同浓度下的RSD分别为3.8％、4.2％和4.1％。在同样三个浓度下，连续三次实验之间的RSD分别为3.9％、4.2％和4.6％，说明了本发明的检测方法具有良好的精密度和重现性。

实施例6：抑制效应考察

冬凌草素(oridonin)是已知的TF的小分子抑制剂，可以抑制NF-κB的双链DNA结合活性。为了评估本检测策略在筛选NF-κB抑制剂方面的应用潜力，我们选择冬凌草素进行分析，如图5所示。可以看出，与体系中不存在冬凌草素时显示的显著的荧光响应相比，存在冬凌草素时反应体系的荧光强度显著降低，这表明本发明提出的检测策略具有用于筛选转录因子抑制剂的潜力。

实施例7：实际样品测定

NF-κB p50起初存在于细胞质中，并与抑制蛋白IκB结合，不具有活性。受到刺激(例如细胞因子，细菌和病毒)后，NF-κB p50将会被激活，从IκB上释放，进入细胞核。为了进一步检验本发明提出的检测策略的实际应用价值，我们测定了肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的HeLa细胞核提取液中的NF-κB p50的活性。如图6所示。可以看出，与裂解缓冲溶液仅能引起非常低的荧光信号(曲线c)相比，含有TNF-α刺激的HeLa细胞核提取液的体系 (曲线a)显示了明显的荧光增强。为了进一步证实荧光增强是由NF-κB p50引起的而不是由其它组分引起的，抑制剂冬凌草素被加入到体系中，结果未显示出明显的荧光增强(曲线 b)。以上结果充分表明本发明提出的TF的高灵敏检测策略能够用于实际生物样品中NF-κB p50的活性检测。

Claims

1.一种检测转录因子的试剂，其特征在于，包含：

发夹识别探针、DNA掩蔽链，以及模板链、滚环扩增引物和环状模板；

所述发夹识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述DNA掩蔽链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述环状模板由滚环扩增引物的互补序列，切刻酶识别位点和G四倍体的互补序列组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的检测转录因子的试剂，其特征在于，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvC I内切酶、T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶。

3.一种在非疾病诊断领域利用权利要求1或2所述的试剂检测转录因子的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)向待检测样品中加入发夹识别探针，进行识别结合反应；

(2)向步骤(1)的反应体系中加入DNA掩蔽链，进行掩蔽反应；

(3)向步骤(2)的反应体系中依次加入模板链，dNTPs、KF聚合酶和Nt.BbvC I内切酶，进行链置换反应；

(4)向步骤(3)的反应体系中加入环状模板和T4 DNA连接酶，恒温反应，然后再加入dNTPs、Phi29 DNA聚合酶和Nt.BbvC I内切酶，进行指数滚环扩增反应；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述识别结合反应的条件为：37℃恒温箱中，反应2-4h。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述掩蔽反应的条件为：37℃下反应0.5-1h。

6.权利要求1所述的检测转录因子的试剂在筛选转录因子抑制剂中的用途。