CN105018474A - 一种基于g-四链体-氯血红素dna酶的探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，以及检测操作简单、低成本、免标记的检测蛋白质的方法。本发明的探针具有高灵敏度、低背景噪声的优点，进行蛋白质检测时，检测操作简单、耗时短、低成本，克服了现有技术中，对蛋白质的检测方法耗时长、成本高、检测探针制备复杂的问题。

Description

一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针及其应用

技术领域

本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针及其检测蛋白质的方法。

背景技术

脱氧核酶(DNA酶)属于人工核酸的一种，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。例如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA一对发夹序列，实质是杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子时，两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的自由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致两个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量自由的G-四链体序列即可与氯化血红素(hemin)结合，催化氧化H₂O₂介导的ABTS，从而检测靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在以下问题：

(1)背景噪声较大、灵敏度较差。具体而言，在反应体系中，发夹结构与未形成发夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合的环而被保护，导致G-四链体序列并不全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个发夹杂交形成的，也有部分是直链的序列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链体序列的，因此无法实现较为灵敏的检测。

(2)利用碱基的杂交配位进行靶分子的检测，实际上仅能实现DNA的检测，而无法实现蛋白质的检测。

在疾病的早期诊断或某种病理状态下，蛋白质(特别是那些与癌症相关的蛋白质)作为生命的分子机器，是非常重要的。目前，通过检测蛋白质对疾病进行诊断的方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用的方法。但是，基于抗体进行测定的ELISA法通常耗时较长，并包含多个清洗步骤、操作繁琐。此外，还存在灵敏度不足、动态范围有限等缺陷。作为基于抗体测定法的替代，基于适配体测定法受到了极大的关注。适配体，是通过体外选择过程从随机序列的核酸库中被挑选出来的单链的DNA或RNA。它们对于小分子、蛋白质或其他目标具有很高的亲和性以及很好的选择性。与抗体相比，适配体具有明显的优势，如：更好的长期储存稳定性，可通过化学合成、实现大量快速的制备，可灵活的修饰各种官能团等。目前，已发展出多种基于适配体扩增的蛋白质检测分析方法，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链式反应(LCR)。虽然这些方法可以很好的提高蛋白质检测的灵敏度，但是通常需要对适配体进行荧光素和淬灭剂的化学修饰，或是使用核酸外切酶、核酸内切酶、纳米颗粒等，使得制备成本大大增加，且加大了制备难度。因此，免标记的、低成本的、简单易行的蛋白质检测方法仍然是未来的研发热点。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中对蛋白质的检测方法耗时长、成本高、检测探针的制备复杂，进而提供一种检测操作简单、低成本、免标记的检测蛋白质的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针灵敏度低、背景噪声大，进而提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法。

本发明的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，包括一对邻位探针第一探针与第二探针、以及第一发夹与第二发夹；

所述第一探针包括：可特异性识别蛋白质的第一适配体区、可使所述第一探针与第二探针形成双链体的第一碱基互补区以及可与所述第一发夹部分杂交的第一DNA酶扩增区；

所述第二探针包括：可与所述第一发夹部分杂交的第二DNA酶扩增区、可使所述第一探针与第二探针形成双链体的第二碱基互补区以及可特异性识别蛋白质的第二适配体区；

所述第一发夹的一端部为第一G-四链体序列区、并依次连接有可与所述第二发夹杂交的第一环部、可与所述第一探针和/或第二探针的DNA酶扩增区杂交且与端部的G-四链体序列部分杂交的第一茎干区、以及设置在另一端的第二G-四链体序列区；

所述第二发夹的一端部为第三G-四链体序列区、并依次连接有可与所述第一环部杂交且与端部的G-四链体序列部分杂交的第二茎干区、可与所述第一茎干区杂交的第二环部、以及设置在另一端的第四G-四链体序列区。

所述第一发夹的第一G-四链体序列区的序列为所述G-四链体序列的3/4段序列；所述第一发夹的第二G-四链体序列区的序列为所述G-四链体序列的1/4段序列；所述第二发夹的第三G-四链体序列区的序列为所述G-四链体序列的1/4段序列；所述第二发夹的第四G-四链体序列区的序列为所述G-四链体序列的3/4段序列。

所述第一发夹的第一G-四链体序列区具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，序列SEQ ID No.1为：5’-AGG GCG GGT GGG T-3’；所述第一发夹的第二G-四链体序列区具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，序列SEQID No.2为：5’-T GGG T-3’；所述第二发夹的第三G-四链体序列区具有如SEQ ID No.3所示的序列结构，序列SEQ ID No.3为：5’-TGG GT-3’；所述第二发夹的第四G-四链体序列区具有如SEQ ID No.4所示的序列结构，序列SEQ ID No.4为：5’-TGG GTA GGG CGG G-3’。

所述第一碱基互补区与所述第二碱基互补区设置有6个碱基互补序列。

所述第一探针与所述第二探针的序列结构还包括多聚T序列；所述多聚T序列具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。所述多聚T序列为SEQ IDNo.5：5’-T TTT TTTTTTTTT T-3’。

所述多聚T序列的一端与所述适配体区连接，另一端与所述碱基互补区连接。

本发明的检测蛋白质的方法为基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针进行荧光检测。

所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法，包括以下步骤：将所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中，5-35℃下培育4-10h，然后向其中加入氯化血红素、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

进一步的，所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中具体包括以下步骤：先将所述第一探针、所述第二探针置于待测溶液中，培育20-50min，再向其中加入所述第一发夹、第二发夹。

优选的，加入氯化血红素的同时还加入氢离子缓冲液。

进一步的，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。

本发明所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的原理如下：反应体系中，所述第一探针与第二探针的适配体区分别与待测蛋白质特异性结合，第一探针与第二探针形成邻位，通过所述碱基互补区形成双链体，从而形成DNA蛋白质复合物。所述DNA蛋白质复合物的DNA酶扩增区与所述第一发夹的第一茎干区联结，打开所述第一发夹，释放出第一环部以及受保护的3/4的G-四链体序列。释放出的所述第一环部与所述第二发夹的第二茎干区杂交，通过链置换打开所述第二发夹。所述第二发夹的第二环部与所述第一发夹的第一茎干区十字交叉杂交，使端部的1/4的G-四链体序列、3/4的G-四链体序列自组装成裂分的G-四链体结构。在自动的十字交叉打开第一发夹、第二发夹的过程中，链杂交反应不断重复，产生大量的裂分G-四链体结构，在氯化血红素存在下，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，采用邻位的第一探针、第二探针，与待测蛋白质形成DNA蛋白质复合物，然后通过两个巧妙设计的发夹结构，第一发夹与DNA蛋白质复合物的识别触发了链杂交反应，导致大量的裂分的G-四链体结构形成，从而实现蛋白质的放大检测。另外，基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针使用适配体进行蛋白质的检测，不仅保留了适配体的良好的长期储存稳定性、可通过化学合成、实现大量快速的制备等优点，并且，避免了对适配体进行荧光素和淬灭剂的化学修饰，或是使用核酸外切酶、核酸内切酶、纳米颗粒等，成本较低、制备较为简单；

(2)本发明所述第一发夹与第二发夹在两端部连接3/4或1/4的G-四链体序列，并将端部的3/4的G-四链体序列与茎干区部分杂交，使部分G-四链体序列被保护，有效的阻止了G-四链体-氯血红素DNA酶的自组装，即使在反应体系中存在直链的、未被保护G-四链体序列，不完整的3/4或1/4的G-四链体序列也很难形成G-四链体结构，由此实现了仅在待测蛋白质存在、形成的DNA蛋白质复合物被识别、进而触发第一发夹打开的情况下，才能形成G-四链体-氯血红素DNA酶。有效的防止了假阳性信号的产生，大大减小了背景噪声，极大的提升了检测的灵敏度；

(3)本发明所述的第一探针、第二探针的碱基互补区为6个碱基互补序列。在没有待测蛋白质的情况下，两个碱基互补区的互补序列由于太短，不足以进行有效的杂交，然而，当反应体系中存在待测蛋白质时，所述第一探针、第二探针的适配体区同时与待测蛋白质特异性结合，使两个碱基互补区足够接近，引发相互杂交，形成稳定的DNA蛋白质复合物。通过两个邻近探针对于同一目标特异性和高亲和力的结合，使得其具有良好的特异性与选择性。更为优选的，所述第一探针与第二探针的适配体区为两个同一蛋白质的不同适配体序列。当两个适配体分别与待测蛋白的两个结合位点结合，才能形成邻位，更加提升了检测的特异性；

(4)本发明所述的第一探针与所述第二探针还包括多聚T序列，多聚T序列可起到减小所述适配体与蛋白质结合时产生的位阻。所述多聚T序列一端与所述适配体区连接，另一端与所述碱基互补区连接。待测蛋白质与所述适配体区结合后，与适配体区连接的多聚T序列可减小待测蛋白质产生的位阻，有利于所述碱基互补区的杂交；

(5)本发明所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法，将所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中，5-35℃下培育4-10h后加入氯化血红素、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、过氧化氢即可。上述方法操作简单、条件易于控制且耗时较短；

(6)本发明所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法，先将所述第一探针、所述第二探针置于待测溶液中，培育20-50min，再向其中加入所述第一发夹、第二发夹。这样可以使待测蛋白质与述第一探针、所述第二探针充分结合后，再进行所述第一发夹、第二发夹的触发打开，检测效果更为理想。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例1的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针的检测原理示意图；其中，图中附图标记表示为：Ⅰ-第一适配体区；Ⅱ-多聚T序列；Ⅲ-第一碱基互补区；Ⅳ-第一DNA酶扩增区；Ⅳ’-第二DNA酶扩增区；Ⅲ’-第二碱基互补区；Ⅰ’-第二适配体区；Ⅴ-第一G-四链体序列区；Ⅵ-第二G-四链体序列区；Ⅷ-第一环部；Ⅶ-第一茎干区；Ⅵ’-第三G-四链体序列区；Ⅷ’-第二茎干区；Ⅶ’-第二环部；Ⅴ’-第四G-四链体序列区。

图2为实施例5的测定法的原理图；

图3为实施例2中检测的吸收光谱图；

图4为实施例2中检测的418nm处吸收光强度与凝血酶浓度的对数图；

图5为实施例4中传感系统对比色反应进行检测的结果示意图；

图6为实施例5中检测的吸收光谱图；

具体实施方式

实施例1：用于检测凝血酶的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针设计

本实施例中，所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针包括：第一探针P1、第二探针P2、第一发夹H1以及第二发夹H2，各组成序列如下表所示：

表1基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针序列

所述第一探针P1包括：可特异性识别凝血酶的第一适配体区Ⅰ，为Apt29，可结合于凝血酶的肝素结合位点；多聚T序列Ⅱ；与所述第二探针形成双链体的第一碱基互补区Ⅲ；可与所述第一发夹部分杂交的第一DNA酶扩增区Ⅳ。

所述第二探针P2包括：可特异性识别凝血酶的第二适配体区Ⅰ’，为Apt15，可结合于凝血酶的纤维蛋白原结合位点；多聚T序列Ⅱ；与所述第一探针形成双链体的第二碱基互补区Ⅲ’；可与所述第一发夹部分杂交的第二DNA酶扩增区Ⅳ’。

所述第一发夹H1包括：连接在5’末端的3/4的G-四链体序列——第一G-四链体序列Ⅴ、可与所述第二发夹杂交的第一环部Ⅷ、可与所述第一探针和/或第二探针的DNA酶扩增区杂交且与端部的3/4的G-四链体序列部分杂交的第一茎干区Ⅶ、连接在3’末端的1/4的G-四链体序列——第二G-四链体序列区Ⅵ。

所述第二发夹H2包括：连接在5’末端的1/4的G-四链体序列——第三G-四链体序列区Ⅵ’、可与所述第一环部杂交且与端部的3/4的G-四链体序列部分杂交的第二茎干区Ⅷ’、可与所述第一茎干区杂交的第二环部Ⅶ’、连接在3’末端的3/4的G-四链体序列——第四G-四链体序列区Ⅴ’。

其检测原理如图1所示为：

步骤1：在没有凝血酶的情况下，区域Ⅲ和Ⅲ'因为互补的序列(6个碱基)太短不足以进行有效的杂交,因此所述第一探针P1与第二探针P2不会联结。当目标凝血酶引入系统后，P1的区域ⅠApt29结合到了凝血酶的肝素结合位点，同时P2的区域I Apt15结合到了凝血酶的纤维蛋白原结合位点，P1与P2同时结合到蛋白质上导致区域Ⅲ和Ⅲ'足够接近，进而相互杂交形成一个稳定的DNA蛋白质复合物；

步骤2：DNA蛋白质复合物形成后，立即与所述第一发夹H1的茎干区Ⅶ进行联结，从而打开了所述第一发夹H1。H1的打开导致了单链的Ⅷ和受保护的3/4的G-四链体序列V被释放出来；

步骤3：释放出来的所述第一环部Ⅷ和所述第二发夹H2中的茎干区Ⅷ'进行杂交，通过链置换打开了所述第二发夹H2；

步骤4：接下来，所述第二发夹H2中的第二环部Ⅶ’通过与所述第一发夹H1中的第一茎干区Ⅶ进行十字交叉杂交，导致两个G-四链体子单元(3/4的G-四链体序列和1/4的G-四链体序列)自组装成一个裂分G-四链体结构；

在自动的十字交叉打开H2和H1的过程中，链杂交反应(HCR)不断重复，产生大量的裂分G-四链体结构。在氯化血红素存在下，形成的具有催化活性的G-四链体-氯血红素仿过氧化物酶DNA酶通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本实施例中使用的DNA寡核苷酸购于南京金斯瑞生物科技有限公司(Genscript公司)，为PAGE纯，用20mM(M代表mol/L,下同)的Tris-HCl缓冲液(100mMNaCl,25mMKCl，2mM MgCl₂,pH＝7.4)稀释成100μM的储备液，人工合成上述第一探针P1、第二探针P2、第一发夹H1以及第二发夹H2。

实施例2：基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针对不同浓度的凝血酶的检测

本实施例中使用的人α-凝血酶(Tb)购买于Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)，氯化血红素、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过氧化氢购买于Aladdin试剂公司(上海，中国)，上述材料的各市售型号的产品之间效果并无差异。配制溶液均使用Milli-Q纯化系统(比尔里卡，马萨诸塞州，美国)制备的重蒸水。

对凝血酶的检测包括以下步骤：

首先，取所述第一发夹、第二发夹的溶液，加热至95℃，保持5min，再缓慢降至室温，备用。采用二甲亚砜(DMSO)配制1mM的氯化血红素溶液，并在-20℃下储存于暗处，备用。配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液待用，该缓冲液包括：25mM的HEPES，200mM的NaCl，20mM的KCl，0.05v％的Triton X-100，1v％的DMSO，pH值为7.4。

配制Tris-HCl缓冲液待用，该缓冲液包括：20mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，25mM的KCl，2mM的MgCl₂，pH值为7.4。取人α-凝血酶用上述Tris-HCl缓冲液稀释至凝血酶的浓度为2.5pM(即pmol/L，下同)、5pM、10pM、25pM、100pM、250pM、1000pM、2500pM的溶液，以及未加入人α-凝血酶的缓冲液，作为待测溶液。

分别取实施例1中的浓度为0.5μM的所述第一探针溶液、浓度为0.5μM的所述第二探针溶液各10μL，置于体积为25μL的待测溶液中，将混合液在25℃下培育30min，再向其中加入浓度为2.5μM的所述第一发夹溶液10μL、浓度为2.5μM的第二发夹溶液10μL，培育6h，然后向其中加入10μL浓度为2.5μM的氯化血红素溶液、125μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，继续培育30min，最后加入浓度为40mM的ABTS以及浓度为40mM的H₂O₂，使混合液中ABTS、H₂O₂的浓度分别为2mM，培育5min，即可测定。

取上述混合液作为样品，置于SpectraMax M5e多功能酶标仪上进行吸光度的检测，溶液的吸收光谱测定波长范围为390-490nm。吸收光谱的测定结果如图3、4所示。图3中，曲线a为凝血酶浓度为0的混合液、曲线b为凝血酶浓度为2.5pM的混合液、曲线c为凝血酶浓度为5pM的混合液，依次类推，10pM(曲线d)、25pM(曲线e)、100pM(曲线f)、250pM(曲线g)、1000pM(曲线h)、2500pM(曲线i)。

由上述检测结果可知，对不同浓度的凝血酶进行吸收光谱检测，吸收强度随着凝血酶浓度的增加而相应的增加。而凝血酶吸收强度和浓度之间的关系如图4所示，呈现出了很好的线性相关，浓度范围跨越3个数量级从2.5pM到2500pM(图4中的插图)。线性回归方程为Y＝0.1854+0.11084log₁₀C，线性相关系数为0.9922，其中，Y和C分别代表吸收强度和凝血酶的浓度。通过对平均响应的空白加上三倍标准偏差的计算，可知本发明的方法的检测限为1.9pM。其灵敏度比现有技术的比色法(检测限分别为20nM和20.5nM)高出4个数量级(Li et al.,2008；Zhang et al.,2011)；比基于AuNPs和限制性内切酶扩增的比色测定法(检测限50nM)高1个数量级(Liet al.,2012)；和基于限制性内切酶和DNA酶扩增的比色测定法(检测限1.5nM)灵敏性相当，但是程序更为简单(Huang et al.,2013)。

因此，本发明的方法不仅操作简单，且具有优越的灵敏度。

实施例3：基于G-四链体-氯血红素DNA酶的凝血酶探针对人血清中凝血酶的检测

本实施例中使用的人血清来自江原医院(已获得伦理批准)。取上述人血清稀释10倍，取人α-凝血酶采用上述人血清稀释液稀释至凝血酶的浓度为10pM、100pM、1000pM，分别编号为1、2、3，作为待测溶液。采用与实施例2中相同的方法进行检测。

上述检测进一步验证了本发明的方法在真实生物环境中的可行性，在对实际生物样品(比如稀释后的人血清中蛋白质)进行检测时，可实现准确的定量检测，如表2所示，其回收率的检测结果在97.63-103.60％范围内。

因此，本发明的方法具有较好的实用性，可适用于实际生物样品中的蛋白质的检测。

表210％人血清中凝血酶回收率检测结果

实施例4：基于G-四链体-氯血红素DNA酶的凝血酶探针对其他蛋白质的检测

本实施例中使用的人免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)购买于Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。

分别取浓度为25nM的人免疫球蛋白G溶液、浓度为25nM的牛血清白蛋白溶液、浓度为25nM的人血清白蛋白溶液以及浓度为2.5nM的人α-凝血酶溶液，作为待测溶液。采用与实施例2中相同的方法进行处理，并取最终的混合液作为样品，通过传感系统对比色反应进行检测。

检测结果如图5所示，可知，浓度为2.5nM的凝血酶会引起吸光度数值的增加，而其他浓度为25nM的蛋白质均不会引起明显的吸收强度的变化，其中，误差线显示三次实验的标准偏差。

上述结果表明，本发明的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的凝血酶探针具有良好的选择性。

实施例5：结合诱导的未扩增的凝血酶比色测定法

本实施例中，设计了2个DNA酶序列T1、T2，以代替实施例1中的第一发夹H1、第二发夹H2。

所述DNA酶序列T1的序列为：

所述DNA酶序列T2的序列为：

S1为3/4的G-四链体序列，S2为1/4的G-四链体序列。

其检测原理如图2所示为：当目标凝血酶引入系统后，所述第一探针P1的区域I Apt29结合到了凝血酶的肝素结合位点，同时所述第二探针P2的区域I Apt15结合到了凝血酶的纤维蛋白原结合位点，P1与P2同时结合到蛋白质上导致区域III and III'足够接近，进而相互杂交形成一个稳定的DNA蛋白质复合物(以上过程同实施例1)；所述DNA酶序列T1、T2部分与所述第一探针P1、第二探针P2的DNA酶扩增区Ⅳ杂交，并自组装成一个G-四链体结构，在氯化血红素存在下，形成的具有催化活性的G-四链体-氯血红素仿过氧化物酶DNA酶通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本实施例采用上述凝血酶探针，并采用实施例2中的方法分别对浓度为2500pM的凝血酶溶液、以及不含凝血酶的缓冲液进行检测。同时，采用实施例2中所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针对浓度为2500pM的凝血酶溶液、以及不含凝血酶的缓冲液进行检测，以作比较。吸收光谱的检测结果如图6所示，曲线a为本实施例的不含凝血酶的缓冲液(空白试验)的吸收光谱，曲线b为本实施例的2500pM的凝血酶溶液的吸收光谱，曲线c为作为对比的、本发明的2500pM的凝血酶溶液的吸收光谱，曲线d为作为对比的、本发明的不含凝血酶的缓冲液的吸收光谱。

由上述检测结果可知，与不存在凝血酶(曲线a)相比，凝血酶的存在(曲线b)导致吸收强度的增加。该增加是由于DNA蛋白质复合物与T1和T2的联结，导致两个G-四链体子单元组装成一个裂分G-四链体结构，形成的G-四链体-氯血红素DNA酶将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，从而导致418nM处吸收强度的增加。而本发明则是通过使用两个巧妙设计的发夹结构H1和H2，其中一个发夹结构对于DNA蛋白质复合物的识别触发了链杂交反应(HCR)，这导致了大量的裂分G-四链体结构的形成，由此在418nM处观测到206％信号强度的增加(曲线d)。直线1表示的206％信号强度的增加与直线2表示96％未扩增两者的对比如图6所示。

上述结果表明，本发明实现了放大检测凝血酶的信号，可更为灵敏、准确的检测蛋白质。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省原子医学研究所

 

<120>  一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针及其应用

 

<130>  SHA201400193

 

<160>  11   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  13

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

agggcgggtg ggt                                                        13

 

 

<210>  2

<211>  5

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgggt                                                                  5

 

 

<210>  3

<211>  5

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tgggt                                                                  5

 

 

<210>  4

<211>  13

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tgggtagggc ggg                                                        13

 

 

<210>  5

<211>  14

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tttttttttt tttt                                                       14

 

 

<210>  6

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

agtccgtggt agggcaggtt ggggtgactt tttttttttt tttgtgaggt gtttaagta      59

 

 

<210>  7

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

agaagaaggc ctcacttttt tttttttttg gttggtgtgg ttgg                      44

 

 

<210>  8

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

agggcgggtg ggtgtttaag ttggagaatt gtacttaaac accttcttct tgggt          55

 

 

<210>  9

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

tgggtcaatt ctccaactta aactagaaga aggtgtttaa gttgggtagg gcggg          55

 

 

<210>  10

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

tacttaaact gggcgggtgg gt                                              22

 

 

<210>  11

<211>  14

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

tgggtccttc ttct                                                       14

 

 

Claims (11)

1.一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述探针包括一对邻位探针第一探针与第二探针、以及第一发夹与第二发夹；

所述第一探针包括：可特异性识别蛋白质的第一适配体区(Ⅰ)、可使所述第一探针与第二探针形成双链体的第一碱基互补区(Ⅲ)以及可与所述第一发夹部分杂交的第一DNA酶扩增区(Ⅳ)；

所述第二探针包括：可与所述第一发夹部分杂交的第二DNA酶扩增区(Ⅳ’)、可使所述第一探针与第二探针形成双链体的第二碱基互补区(Ⅲ’)以及可特异性识别蛋白质的第二适配体区(Ⅰ’)；

所述第一发夹的一端部为第一G-四链体序列区(Ⅴ)、并依次连接有可与所述第二发夹杂交的第一环部(Ⅷ)、可与所述第一探针和/或第二探针的DNA酶扩增区杂交且与端部的G-四链体序列部分杂交的第一茎干区(Ⅶ)、以及设置在另一端的第二G-四链体序列区(Ⅵ)；

所述第二发夹的一端部为第三G-四链体序列区(Ⅵ’)、并依次连接有可与所述第一环部杂交且与端部的G-四链体序列部分杂交的第二茎干区(Ⅷ’)、可与所述第一茎干区杂交的第二环部(Ⅶ’)、以及设置在另一端的第四G-四链体序列区(Ⅴ’)。

2.根据权利要求1所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述第一发夹的第一G-四链体序列区(Ⅴ)的序列为所述G-四链体序列的3/4段序列；所述第一发夹的第二G-四链体序列区(Ⅵ)的序列为所述G-四链体序列的1/4段序列；所述第二发夹的第三G-四链体序列区(Ⅵ’)的序列为所述G-四链体序列的1/4段序列；所述第二发夹的第四G-四链体序列区(Ⅴ’)的序列为所述G-四链体序列的3/4段序列。

3.根据权利要求1或2所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述第一发夹的第一G-四链体序列区(Ⅴ)具有如SEQID No.1所示的序列结构；所述第一发夹的第二G-四链体序列区(Ⅵ)具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述第二发夹的第三G-四链体序列区(Ⅵ’)具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述第二发夹的第四G-四链体序列区(Ⅴ’)具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。

4.根据权利要求1-3任一所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述第一碱基互补区(Ⅲ)与所述第二碱基互补区(Ⅲ’)设置有6个碱基互补序列。

5.根据权利要求1-4任一所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述第一探针的第一适配体区(Ⅰ’)与所述第二探针的第二适配体区(Ⅰ)分别为同一蛋白质的不同适配体序列。

6.根据权利要求1-5任一所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述第一探针与所述第二探针的序列结构还包括多聚T序列(Ⅱ)；所述多聚T序列(Ⅱ)具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。

7.根据权利要求6所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，其特征在于，所述多聚T序列(Ⅱ)的一端与所述适配体区连接，另一端与所述碱基互补区连接。

8.一种检测蛋白质的方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针进行荧光检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-7任一所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中，5-35℃下培育4-10h，然后向其中加入氯化血红素、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中具体包括以下步骤：先将所述第一探针、所述第二探针部分置于待测溶液中，培育20-50min，再向其中加入所述第一发夹、第二发夹部分。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，加入氯化血红素的同时还加入氢离子缓冲液，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。