CN112063691A - 一种基于g4-血红素dna酶系统检测单链靶核酸序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于G4‑血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法，属于分子生物信息学领域；本发明将两组探针用于DNA酶杂交，并摸索合适的温度和pH反应条件，调节相关试剂浓度，提高了该酶的核酸检测灵敏度，同时使用Tritonx‑100和NH₄ ⁺作为该酶的活化剂可显著提高其检测灵敏度；此外，本发明发现底物ABTS²‑被催化后的绿色产物ABTS·‑颜色快速褪色的原因是由于H₂O₂使ABTS·‑歧化，而不是H₂O₂降解血红素，而Tris‑NH₄Cl缓冲液被证实可以除去催化显色反应后残留的H₂O₂，避免H₂O₂清除绿色产物ABTS·‑，从而使绿色产物稳定存在，进而使检测结果能维持三天以上。

Description

一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法

技术领域

本发明涉及分子生物信息学领域，特别是涉及一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法。

背景技术

核酸检测通常是在将微量的靶核酸扩增到可检测水平后，通过固相或液相杂交进行。然而，固相杂交反应有许多缺点，特别是洗涤步骤较多、杂交过程耗时等原因，限制了其在核酸诊断的应用。因此仍然需要开发简单、快速、低成本和可靠的核酸检测方法。

G-四链体/血红素DNAzyme因其成本低、操作简便、杂交速度快、可肉眼观察检测结果等优点，在核酸检测中受到广泛关注。它表现出类似过氧化物酶的活性，因此能够在H₂O₂存在下催化无色的2,2′-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS^2-)氧化为绿色自由基ABTS·^-。此外，通过将G-四链体序列分成两部分，得到的分裂G-四链体与血红素结合，仍能形成保留原始催化活性的DNA酶。这一特性使其适合于核酸液相杂交。该酶已用于肿瘤突变p53基因、猪瘟病毒RNA和致病性结核分枝杆菌DNA的核酸检测。

事实上，G4DNA酶本质上仍然是一种简单的酶。在过去的20多年中，关于G4DNA酶的研究很多，但迄今为止还没有G4DNA酶的商业化产品用于核酸检测。目前其存在的两个主要问题是相对较低的催化活性、与底物ABTS^2-催化作用后显色时间较短。影响G4DNA酶性能的因素很多，如G4DNA酶形成序列及其结构、反应溶液组成、底物等。很多研究致力于解决上述两个问题，但到目前为止，还没有解决这些问题的系统性报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G4/血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供Tris-NH₄Cl在延长探针G4/血红素DNA酶系统中催化产物显色时间的应用。

本发明还提供一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统，包括：缓冲液A；所述缓冲液A包括Tris和NH₄Cl。

进一步的，所述缓冲液A的具体成分为Tris、探针、Triton X-100、氯化血红素和NH₄Cl；所述缓冲液B的具体成分为ABTS二铵盐和H₂O₂。

进一步的，所述Tris的终浓度为50mM；所述NH₄Cl的终浓度为150mM；0.0003％Triton X-100；所述探针的终浓度为400nM；所述hemin的终浓度为500nM；所述ABTS^2-的终浓度为6mM；所述H₂O₂的终浓度为2mM。

进一步的，所述Tris的pH为7.5-9.0。

进一步的，所述Tris的pH为8.0。

本发明还提供一种利用所述G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统进行核酸检测的方法，具体步骤包括：将靶ssDNA加入缓冲液A中，在42-45℃条件下杂交后，加入缓冲液B，室温下等待显色。

本发明还提供一种利用所述G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统在制备核酸诊断试剂盒中的应用。本发明公开了以下技术效果：本发明改进的G-四链体-hemin系统可以在不到20分钟内检测到比以前更低浓度的目标核酸。唯一需要的设备是一个小型金属热浴，操作过程简单，不需要额外的下游处理。阳性杂交结果显示为绿色，即使没有酶标仪读取信号，仅用肉眼可以也观察到结果。Tris-NH₄Cl缓冲液作为H₂O₂清除剂，可以使G4/hemin-DNAzyme底物(ABTS^2-)的有色自由基产物的寿命延长到3天以上，这大大提高其应用的可行性。所有这些优点都为便携式野外应用提供了现实的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的检测结果；

图2为使用两对探针研究DNAzyme浓度对DNAzyme催化作用的影响；其中，A为用两对探针检测ssDNA/ssRNA的G4DNA酶系统的流程；B、C、D分别为血红素、两对探针(每对探针400nM)、靶ssDNA浓度变化时(0-1000nM)检测结果的代表性图像；E为当血红素(黑色)、探针(蓝色)和靶ssDNA(红色)浓度变化时，产物形成的统计结果；所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图3为活化剂对DNAzyme催化作用的影响；其中，A、B、C分别为钠离子、钾离子、铵离子对DNA酶催化活性影响的代表性图像；D为不同浓度(0-200mM)的钠离子(黑色)、钾离子(蓝色)、铵离子(红色)对DNAzyme催化活化影响的产物形成统计结果；E为不同浓度TritonX-100(0-0.3％)对DNAzyme催化活性的影响；所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图4为缓冲液对DNAzyme催化作用的影响；A为使用不同缓冲液时检测结果的颜色随时间变化的代表性图像；B为使用不同缓冲液时检测结果随时间变化的吸光度值；所有缓冲液pH均为8.0，所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图5为Tris和Hepes对DNAzyme催化底物(ABTS^2-)自由基颜色持续时间不同的分析；其中，A为用琼脂糖凝胶电泳测定G4/hemin复合物的浓度；B为用圆二色谱分析G4的构象；C为用紫外分光光度计测定血红素浓度；D为ABTS^2-在Hepes-NH₄Cl缓冲液中通过DNAzyme氧化6小时，从无色溶液中分离出的DNAzyme，并分别在Tris-NH₄Cl或Hepes-NH₄Cl缓冲液中添加不同浓度的hemin(0-300nM)，观察显色情况并检测吸光度值；E为检测不同时间点在有DNAzyme时不同缓冲液中的H₂O₂浓度；F为检测不同时间点在无DNAzyme时不同缓冲液中的H₂O₂浓度；G为添加H₂O₂(0-2mM)对自由基产物ABTS·^-颜色保持的影响；

图6为使用一对探针研究DNAzyme浓度对DNAzyme催化作用的影响；其中，A为用一对探针检测ssDNA/ssRNA的G4DNA酶系统的流程；B、C、D分别为血红素、两对探针、靶ssDNA浓度变化时(0-1000nM)检测结果的代表性图像；E为当血红素(黑色)、探针(蓝色)和靶ssDNA(红色)浓度变化时，产物形成的统计结果。所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图7为pH、温度对DNAzyme催化作用的影响；其中，A为在Tris-NH₄Cl缓冲液中，pH(6.0-9.0)对DNAzyme催化活性的影响；B为加入ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)并在4-50℃的条件孵育5分钟后观察温度对DNAzyme催化活性的影响，在42-45℃条件下杂交10分钟；所有数据均为平均值±SEM(n＝3)；

图8为底物(ABTS^2-)和H₂O₂浓度对DNAzyme催化作用的影响；其中，A为ABTS^2-浓度对DNAzyme催化作用的影响；B为不同浓度H₂O₂(0.5-5mM)对无靶ssDNA对照组的吸光度值随着时间的推移而变化；C为不同浓度H₂O₂(0.5-5mM)对试验组的吸光度值随着时间的推移而变化；D为H₂O₂浓度对DNA酶催化作用影响的代表性图像，在每个时间点拍摄照片。所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图9为不对称PCR检测不同浓度(拷贝数)的EBV；

图10为DNAzyme激活剂对DNA酶催化产物形成的影响；其中，A为镁离子(0-10mM)；B为甲酰胺(0-10％)、C为ATP(0-5mM)；D为不同G4序列对DNAzyme催化自由基生成的影响。所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图11为核酸扩增反应系统常用试剂对DNA酶催化作用的影响；其中，A为额外添加的二甲基亚砜(0-10％)；B为额外添加的钾离子(0-100mM)；C为额外添加的DTT(0-250μM)；所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示；

图12为Tris缓冲液和Hepes缓冲液对DNAzyme催化作用的影响；所有数据均以平均值±SEM(n＝3)表示。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1单链靶核酸检测

1.1溶液配制

氯化血红素(hemin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为100μM；ABTS二铵盐和H₂O₂溶解于超纯水，终浓度分别为150mM、200mM。

缓冲液A为Tris(pH8.0)、两组探针、Triton X-100、hemin和NH₄Cl。缓冲液B为ABTS二铵盐水溶液与H₂O₂水溶液的混合溶液。

100μL反应体系中每种试剂的终浓度分别如下：50mM Tris(pH 8.0)，150mMNH₄Cl，0.0003％Triton X-100，400nM探针和靶ssDNA，500nM hemin，6mM ABTS^2-，2mM H₂O₂。探针和引物的顺序见表1和表2。

表1

表2

实验使用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两对探针(每对探针400nM)、靶ssDNA(400nM)、血红素(500nM)和其他额外成分进行，并在42-45℃下杂交10分钟。然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后拍照并测量吸光度。

如图1所示，更改能与靶核酸互补配对的探针序列后，基于G4-血红素DNA酶系统的方法还能检测其他单链靶核酸序列，如人丙型肝炎病毒(HCV)的进化保守区——UTR区，或人的内参基因之一的18sRNA的保守序列。推而广之，当探针的一部分能与靶核酸互补配对，另一部分能形成G4结构，即可检测其它所有的一定浓度的单链靶核酸序列，即改良后的G4/血红素DNA酶系统有望适用于各种单链靶核酸序列的分析和诊断应用，可用于人、动物、植物病原微生物、癌症等相关疾病的核酸诊断。

1.2单链靶核酸检测

先将4μL 10μM的靶ssDNA加入91μL缓冲液A(1.1中制备)中，在42-45℃条件下杂交10分钟，无需变性；杂交结束后，加入5μL新鲜配制的缓冲液B(1.1中制备)，并在室温下等待显色5分钟。显色结果拍照保存。

1.3检测催化反应

在100μL透明96孔板内的反应孔中监测催化反应：使用Epoch^TM微型板分光光度计(美国，Bio-Tek)在414nm波长处测量产物ABTS·^-的吸收光谱，其可准确测量的吸光度范围为0-4.0OD。所有数据均减去背景吸收。背景反应包含相同的样品探针成分减去过氧化氢。产物的形成表示为目标ssDNA存在时获得的吸光度比(减去背景吸收)与不存在目标ssDNA时的吸光度(减去背景吸收)。所有反应分三次进行，以确保重复性。

实施例2DNAzyme浓度、pH值、温度、底物和H₂O₂浓度对DNAzyme催化作用的影响

将EB病毒EBN2基因一段保守的核酸序列作为测试目标，使用体外合成的ssDNA探针和互补靶ssDNA，并设计了两种探针进行比较。其中一种探针能与两段不同的靶ssDNA互补配对(即两对探针)，靶ssDNA是同一条DNA链上连续移位的区域(图2A)，另一种探针为上述两对探针种的其中一对(图6A)。实验使用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、血红素(0-1000nM)和一组探针(0-1000nM)和靶ssDNA(0-1000nM)进行。在42-45℃条件下杂交10分钟，然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后，拍照并使用414nm的波长测量绿色产物ABTS·^-和背景信号(无目标基因时产生的信号)的光学吸收率(OD₄₁₄)。结果显示，两个实验组的OD₄₁₄和背景信号随着血红素或探针浓度的增加而增加。血红素浓度在500nM处达到最大信号背景比(图2B，E；图6B，E)。同样，使用双探针时探针的最佳浓度为400nM(图2C，E)，而使用单探针时探针的最佳浓度为800nM(图6C，E)。单探针和双探针的最佳靶ssDNA量分别不小于800nM和400nM(图6D，E和图2D，E)。由于光吸收与靶ssDNA浓度呈线性关系(数据未显示)，遵循3σ标准，单探针和双探针的检测限(LOD)分别为2.38nM和1.16nM。数据表明，使用双探针可以检测更低浓度的目标核酸，即增加了其应用价值。这种策略可以用来提高DNA酶比色传感器的检测灵敏度，方法是在同一条链上增加额外的探针。

DNA酶的活性也受到环境因素的影响。最佳pH值为8.0(图7A)。同样，与ABTS^2-和H₂O₂底物孵育的最佳温度不超过25℃(图7B)。

实验用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两对探针(每对探针400nM)、靶ssDNA(400nM)和血红素(500nM)进行。杂交在42-45℃下进行10分钟，然后在室温下添加ABTS^2-(1-10mM)和H₂O₂(2mM)或ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(0.5-5mM)。结果显示，酶催化效率和背景信号随着底物浓度的增加而增加(图8A)。ABTS^2-的最佳浓度为6mM(图8A)。我们还注意到H₂O₂浓度对显色产物的保留率有很大的影响。随着H₂O₂浓度的增加(0.5-2mM)，DNAzyme活性提高。然而，绿色产物在高H₂O₂浓度(>2mm)下迅速衰变为无色产物。我们推测高浓度的H₂O₂可能会迅速清除绿色产物。相反，较低浓度的过氧化氢(0.5mM，1mM)清除绿色产物的速度要慢得多。因此，低浓度H₂O₂不能尽快去除无靶ssDNA对照组中的绿色产物，从而导致在早期颜色形成过程中产生更高的背景信号(5分钟至3小时；图8B、C、D)。因此，H₂O₂的最佳检测浓度为2mM。该浓度不仅能够快速显色，即在5分钟内产生较低的背景信号，而且允许颜色保持超过三天(图8B、C、D)。

实施例3活化剂和抑制剂对DNAzyme催化作用的影响

Tritonx-100是一种重要的分散剂，据报道其可以诱导hemin二聚体向单体移动，从而增强G-四聚体与hemin之间的相互作用。在我们优化的检测系统中，我们使用NH₄ ⁺和Tritonx-100作为hemin/DNAzyme的激活剂。

研究DNAzyme激活剂对DNA酶催化产物形成的影响，实验使用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两对探针(每对探针400nM)、靶ssDNA(400nM)、血红素(500nM)和其他额外成分进行，并在42-45℃下杂交10分钟。然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后拍照并测量吸光度。

有研究报道称，Mg²⁺、甲酰胺和ATP可提高G4-DNA酶的活性。经上述实验验证，Mg²⁺对DNA酶催化作用没有显著改善(图10A)。随着甲酰胺和ATP浓度的增加，背景信号明显增加，而试验组颜色只是稍加深，导致信号背景比降低(图10B，C)。即使降低DNAzyme浓度，背景信号仍然很高(数据未显示)。有研究报道称，G4核心序列3′端相邻腺嘌呤(EnEAA)产生的分子内增强效应显著增强了G4/DNA酶的活性，本发明使用不包含腺嘌呤的G4序列(这里称为WY-A6)与包含腺嘌呤的G4序列(CatG4和EAD2序列)进行比较(表1)，未发现显著差异(图10D)。

本发明试图确认PCR扩增溶液的主要成分对G4/DNA酶活性是否有显著影响，阴性结果将支持这样的论点，即在进行核酸分析之前，可以避免将PCR产物进一步纯化、减少处理步骤，从而提高G4/DNA酶用于核酸杂交的实用性。

本发明检测了核酸扩增反应系统中几种常见成分对G4/DNA酶活性的影响。实验使用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两对探针(每对探针400nM)、靶ssDNA(400nM)、血红素(500nM)和其他额外成分进行，并在42-45℃下杂交10分钟。然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后拍照并测量吸光度。我们发现低浓度的Mg²⁺(<6mM，图10A)、DMSO(<6％，图11A)和额外的钾离子(<20mM，图11B)对DNA酶催化活性无明显影响。然而，二硫苏糖醇(DTT)对DNA酶活性有明显的抑制作用(图11C)。由于DTT是hemin/DNAzyme系统的抑制剂，在进行杂交试验之前，任何核酸扩增都不引入DTT。我们使用不含DTT的溶液进行不对称PCR扩增ssDNA，不对称PCR扩增ssDNA：各种试剂在20μl反应体系中的最终浓度如下：10mM Tris(pH 8.0)、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、0.2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)、1U Taq DNA聚合酶(GenStar，中国)、0.01μM引物EB-F、1μM引物EB-R和1μl基因组DNA。使用Bio-Rad热循环仪(即普通PCR仪)扩增DNA。程序设置如下：94℃持续3分钟，随后40个循环，94℃持续20秒，58℃持续20秒，72℃持续20秒，最终在72℃延伸3分钟。将不对称PCR扩增的ssDNA结合改进的G4/DNA酶，成功地检测和鉴定了目标核酸，并显示出较好的敏感性，最低能检测到10³拷贝的EBV。

实验使用Tris(50mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两对探针(每对探针400nM)、血红素(500nM)和其他额外成分进行，将不对称PCR扩增的靶ssDNA取10-15μl直接投入(无须进一步纯化)到上述溶液中，使其终浓度＞400nM，并在42-45℃下杂交10分钟。然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后拍照并测量吸光度。结果如图9所示。

在本发明中，我们关注酶催化反应动力学的基本机制。在合适的温度和pH条件下，通过增加DNA酶浓度(包括探针、靶核酸和血红素)和底物浓度，并辅以适当的激活剂(Triton X-100和NH₄ ⁺，而不是传统的K⁺)，我们基本解决了G4/DNA酶催化活性低的问题(图2-3，图7-8)。

实施例4缓冲液对DNA酶催化作用的影响

G4/hemin DNAzyme催化底物ABTS^2-的颜色保留时间较短的问题。本发明在DNAzyme系统中使用了不同的缓冲液，不同缓冲液的对G4/hemin-DNAzyme催化ABTS^2-后的显色时间有显著差异。实验在Tris或Hepes缓冲液(0-150mM)、NH₄Cl(150mM)、Triton X-100(0.0003％)、两组探针(每对探针400nM)、靶ssDNA(400nM)和血红素(500nM)中进行，并在42-45℃下杂交10分钟。然后在室温下添加ABTS^2-(6mM)和H₂O₂(2mM)。5分钟后拍照并测量吸光度。

在本领域研究中，Tris只是制备生物分子溶液的缓冲溶液，上述实验结果显示，用Tris缓冲液代替传统的Hepes缓冲液可以解决ABTS^2-的颜色保留时间较短的问题。使用Tris缓冲液时，最佳浓度为50mM(图12)，三天后最大吸光度仍保持在2.0以上(图4A，B)。当使用Hepes缓冲液时，最佳浓度为25mM(图12)，但产物的颜色在1小时后逐渐褪色，6小时后变为无色(图4A，B)。此外，在反应早期(<1h)，Hepes缓冲液中的背景信号高于Tris缓冲液。总之，与Hepes缓冲液相比，Tris缓冲液是进行DNAzyme分析的更好缓冲液。

实施例5在Tris和Hepes缓冲条件下，DNAzyme催化底物ABTS²-后显色持续时间不同的机制研究

为了了解实施例4中的ABTS^2-底物被催化后在Tris和Hepes缓冲液中显色持续时间不同的机制，本发明首先研究了G4-DNA酶浓度及其化学拓扑结构。

用琼脂糖凝胶电泳分析G4/hemin复合物与H₂O₂在不同时间点的反应，没有观察到明显的DNA条带变化，表明大部分G4DNA浓度无明显变化(图5A)。为确定G4的构象是否被H₂O₂破坏，我们在添加H₂O₂后的不同时间点对G4/hemin复合物进行圆二色谱(CD)检测。所有组均显示相同的CD光谱(220-320nm)，240nm处为负峰，265nm处为正峰(图5B)，表明在不同条件下，所有样品均为相同且平行的G4构象。因此，添加额外的H₂O₂不会显著改变Tris或Hepes缓冲液中G4DNA的浓度或构象特性。

排除上述G4的结构变化后，我们检测了不同实验条件下血红素的浓度。如图5C所示，随着H₂O₂的加入，G4/hemin复合物中hemin的浓度降低，但Tris和Hepes缓冲液之间没有差异。为了进一步研究血红素浓度的影响，我们用生物素化的单链靶DNA与G4探针杂交，在其他条件不变的情况下进行实验。添加ABTS^2-和H₂O₂六小时后，Hepes缓冲液样品几乎无色(图4A，B)。随后，通过引入链霉亲和素标记的磁珠将DNA酶(仅包含探针、靶ssDNA和血红素)从溶液中分离出来，加入到Tris-NH₄Cl或Hepes-NH₄Cl缓冲液中，随后加入ABTS^2-底物和H₂O₂开始显色反应。本发明实验发现，即使不额外补充hemin，纯化后的DNA酶仍会产生ABTS·^-自由基。虽然颜色比额外补充hemin后的颜色浅(图5D)，但G4/hemin复合物仍然保持了较强的催化活性。颜色强度降低的结果表明，血红素浓度在6小时后下降。然而，该现象不能解释G4/hemin复合物在Hepes缓冲液中6小时后为何几乎无色，而Tris缓冲液种仍保持较深的颜色。因此，Hepes反应液中氯化hemin浓度的降低可能不是G4/hemin复合物颜色猝灭的原因。G4/hemin-DNAzyme在与H₂O₂的反应过程中由于hemin的降解而完全失活，才因此迅速褪色。

我们开始考虑ABTS^2-底物、H₂O₂和有色产物ABTS·^-的浓度变化可能是导致颜色变化的因素。由于使用6mM的ABTS^2-时其浓度已经过饱和(图8A)，因此可以排除ABTS^2-系统中浓度过高的影响。图8B-D的结果表明，G4/hemin DNA酶对H₂O₂浓度极为敏感，因此Tris和Hepes缓冲液中的H₂O₂浓度值得详细监测。如图5E所示，在添加H₂O₂之前，G4DNA酶经不同的缓冲液处理。我们发现在Tris-NH₄Cl缓冲液中，H₂O₂浓度在1小时后迅速下降；在不含NH₄Cl的Tris缓冲液中，H₂O₂浓度也下降。而在Hepes-NH₄Cl缓冲液中，H₂O₂浓度变化不明显。在无G4DNA酶的系统中观察到类似的趋势(图5F)。据报道，血红素酶髓过氧化物酶利用H₂O₂和氯离子可以氧化几乎所有常见的氨基酸。因此，我们推测Tris上的还原氨基可能被H₂O₂氧化。本发明认为Tris中的氨基可以温和地分解H₂O₂，并且这种分解是通过过氧化物酶的催化作用来加速的。本发明认为Tris和Tris-NH₄Cl缓冲液可能是H₂O₂的清除剂。其中，Tris-NH₄Cl缓冲液是更有效的清除剂。

我们推测H₂O₂可能影响ABTS·^-自由基的稳定性。为了验证这一假设，我们在Tris-NH₄Cl缓冲液中使用生物素化的单链靶核酸，同时保持其他条件不变。添加ABTS^2-和H₂O₂ 72小时后，吸光度保持大于2.0(图4A，B)。通过引入链霉亲和素标记的磁珠，将DNA酶从溶液中分离出来。丢弃它们后，剩下的溶液主要含有有色产物ABTS·-。测量H₂O₂含量，发现几乎可以忽略不计(<50μM，图5E)。随后添加额外的H₂O₂。随着H₂O₂浓度的增加，颜色逐渐变淡。即使是相对较低浓度(0.5mM)的额外的H₂O₂也会导致进一步的褪色(图5G)。这些结果表明自由基产物ABTS·^-能够被H₂O₂清除。这也证实了我们先前的假设，即高浓度的H₂O₂可迅速清除绿色产物，而较低浓度的H₂O₂则慢得多(图8B、C、D)。

在我们的反应体系中，G4/hemin-DNAzyme在规定的条件下完全自组装，并使用H₂O₂将ABTS^2-底物转化为有色ABTS·^-自由基。然后G4DNA酶与Tris-NH₄Cl一起作用于消除没有有用后续价值的H₂O₂，从而避免H₂O₂歧化ABTS·-，确保ABTS·-稳定存在。这一发现使ABTS^2-成为观察过氧化物酶反应的理想底物，并大大扩展了G4/hemin DNAzymes的应用范围。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.Tris-NH₄Cl在延长探针G4/血红素DNA酶系统中催化产物显色时间的应用。

2.一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统，其特征在于，包括：缓冲液A；所述缓冲液A包括Tris和NH₄Cl。

3.根据权利要求2所述的基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统，其特征在于：所述缓冲液A的具体成分为Tris、探针、Triton X-100、氯化血红素和NH₄Cl；所述缓冲液B的具体成分为ABTS二铵盐和H₂O₂。

4.根据权利要求3所述的基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法，其特征在于：所述Tris的终浓度为50mM；所述NH₄Cl的终浓度为150mM；0.0003％Triton X-100；所述探针的终浓度为400nM；所述hemin的终浓度为500nM；所述ABTS²-的终浓度为6mM；所述H₂O₂的终浓度为2mM。

5.根据权利要求2所述的于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统，其特征在于：所述Tris的pH为7.5-9.0。

6.一种利用权利要求2-5任一项所述G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统进行核酸检测的方法，其特征在于，具体步骤包括：将靶ssDNA加入缓冲液A中，在42-45℃条件下杂交后，加入缓冲液B，室温下等待显色。

7.一种利用权利要求2-5任一项所述G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统在制备核酸诊断试剂盒中的应用。

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