CN113201582A - 一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件由磁颗粒表面修饰的DNA锚定链及DNA识别链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和DNA燃料链；所述信号转换元件包括DNA酶链、ABTS和过氧化氢。在有目标核酸存在时，目标核酸和DNA燃料链共同启动循环链置换反应，释放出大量具有催化性能的DNA酶链。磁分离后，上清液中的DNA酶链可以结合血红素形成具有类过氧化物酶催化活性的结构，在过氧化氢的存在下，可催化近无色的ABTS氧化为绿色的氧化产物，通过裸眼观察或比色光谱可实现对目标核酸的现场原位快速检测。

Description

一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于比色生物传感及核酸检测技术领域，具体涉及一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用。
背景技术
传染病的传播和爆发是当今世界关注的重要问题之一。传染病通常由细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物引起，对人类健康和经济发展造成了巨大威胁。准确及时发现感染和病原鉴定是疾病预防、治疗和监测的关键。针对病原体的核酸检测在医学诊断和疫情防控中具有重要的意义，并受到高度关注。目前检测病原体核酸的主要方法为聚合酶链式反应(PCR)。该方法需要特定的专业仪器和专业的实验人员，针对目标核酸设计引物并进行核酸扩增，存在耗时长、成本高及操作繁琐的问题，无法满足在短时间内对病原体核酸进行现场即时检测需求。因此，发展快速、灵敏、现场的核酸检测传感器对于实现核酸即时检测意义重大。相比于PCR方法，无酶催化的等温核酸扩增反应无需对温度进行严格控制，并可以作为反应信号扩增元件提高检测灵敏度，在化学和医学诊断的传感和检测应用方面受到了广泛关注。常见的等温核酸扩增反应包括链置换扩增(Strand DisplacementAmplification，SDA)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)、杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)、催化发卡循环反应(Catalytic HairpinAmplification，CHA)等。其中，链置换扩增由于操作简单、扩增效率高，易设计等特点备受关注，在生物传感中得到了广泛应用。
比色检测由于成本低、分析时间短、读数直观，不依赖昂贵的实验室设备或复杂的程序，一直是现场检测方法的研究热点。通过传感体系中有色试剂或纳米颗粒的颜色变化，可以直接实现目标分子的检测。DNA酶链是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)得到的一种功能核酸序列，如G-四链体DNA酶是一类具备HRP辣根过氧化物酶催化活性的DNA酶，与氯化血红素(Hemin)结合后可形成G-四链体/Hemin复合体，能催化无色的反应物(如ABTS)变为有色的氧化产物，可作为比色传感器中的信号输出元件。DNA酶成本低廉、易于保存且稳定性好，将其与核酸等温扩增策略结合可以降低检测成本，改善生物传感器的检测性能，为现场即时核酸检测方法提供新思路。此外，磁颗粒(Magnetic Beads，MB)具有优异的高比表面积、良好的分子富集特性及快速的磁分离特性，在即时传感器的构建中独具优势。
发明内容
针对当前检测病原体核酸方法单一、耗时长、受大型仪器限制等缺点，本发明提供了一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用，可用于多种核酸分子的检测，实现传染性病毒核酸的快速、灵敏、即时检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件；
所述分子识别元件由磁颗粒表面修饰的DNA锚定链及DNA识别链组成；
所述DNA锚定链具有如SEQ ID No.1所示的序列；
所述DNA识别链具有如SEQ ID No.2或SEQ ID No.11所示的序列；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和DNA燃料链；
所述DNA燃料链具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.13所示的序列；
所述信号转换元件包括DNA酶链、ABTS和过氧化氢；
所述DNA酶链具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.12所示的序列。
一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)将DNA锚定链通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面；通过磁分离去除多余的DNA锚定链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
所述DNA锚定链具有如SEQ ID No.1所示的序列；
步骤2)向步骤1)得到的磁颗粒中加入一条DNA识别链及一条DNA酶链，在磁颗粒表面形成“三明治”结构；通过磁分离去除多余的DNA识别链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
所述DNA识别链具有如SEQ ID No.2或SEQ ID No.11所示的序列；
所述DNA酶链具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.12所示的序列；
步骤3)向步骤2)得到的磁颗粒中加入DNA燃料链，即组装成所述比色传感器；
所述DNA燃料链具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.13所示的序列。
优选地，步骤1)所述磁颗粒是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为100nm～2μm。
优选地，步骤1)与步骤2)所述清洗的次数为3～5次。
优选地，步骤1)所述将DNA锚定链通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面，包括以下两种方式：
步骤a)将生物素化的DNA锚定链和链霉亲和素修饰的磁颗粒混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在pH＝7.4的Tris缓冲液中储存；
所述Tris缓冲液为：50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2；
步骤b)将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入氨基修饰的DNA锚定链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液中；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH 6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH 6.0；
所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH 6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH 7.2。
优选地，步骤1)所述DNA锚定链是由生物素或氨基修饰的，其浓度为100～1000nM；步骤2)所述DNA识别链与目标核酸部分互补，其浓度为100～1000nM；步骤2)所述DNA酶链具有类似过氧化物酶的催化活性，其浓度为100～1000nM；步骤3)所述DNA燃料链可催化等温核酸扩增反应的进行，其浓度为100～1000nM。
一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器或上述制备方法制得的比色传感器在核酸检测中的应用。
优选地，检测方法包括以下步骤：
步骤A)向步骤3)制得的比色传感器中加入目标核酸，进行等温核酸扩增反应，在25～45℃下反应20～90min后，通过磁分离，收集上清液；
步骤B)向上清液中加入血红素反应30～90min后，加入ABTS/H2O2溶液进行反应5～20min；观察溶液颜色变化，并通过紫外分光光度计测量溶液的吸光度的变化，即可。
优选地，步骤3)所述DNA燃料链的浓度为750nM；步骤A)所述等温核酸扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为45min。
优选地，步骤B)所述血红素的终浓度为0.25～1μM；所述ABTS的终浓度为2～6mM；所述H2O2的终浓度为0.5～5mM。
本发明的有益效果如下：
(1)磁颗粒具有大的比表面积、良好的分子富集特性及快速的磁分离特性，能够提高反应效率。
(2)本发明无需酶催化，操作简单，成本低廉，不受场地和仪器的控制，不要求受过良好培训的操作者，通过裸眼观察和紫外可见光谱即可实现对病原体核酸的现场即时检测。
(3)等温核酸扩增方法条件温和、无需蛋白酶参与反应，提高了传感器的灵敏度和稳健性。
(4)根据目标核酸的基因序列调整DNA识别链，可以对多种传染性病毒核酸进行检测，具有强大的可编程性。
附图说明
图1为本发明制备基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其核酸检测应用原理的示意图；
图2为实施例2中比色传感器在目标核酸(Ebola核酸)存在/不存在时的紫外-可见吸收光谱图；
图3为实施例3中在制备比色传感器的过程中燃料DNA链的浓度优化效果图；
图4为实施例3中在制备比色传感器的过程中等温核酸扩增反应的温度优化效果图；
图5为实施例3中在制备比色传感器的过程中等温核酸扩增反应的反应时间优化效果图；
图6中：(A)为实施例4中比色传感器随目标核酸(Ebola核酸)浓度变化的颜色变化及其对应的紫外-可见吸收光谱图；(B)为实施例4中上清液在421nm处的吸光度随着目标核酸(Ebola核酸)浓度的变化情况及线性关系；
图7为实施例5中比色传感器对于目标核酸(Ebola核酸)检测的特异性测试；
图8中：(A)为实施例6制得的比色传感器随目标核酸(H7N9核酸)浓度变化的颜色变化及其对应的紫外-可见吸收光谱图；(B)为实施例6中上清液在421nm处的吸光度随着目标核酸(H7N9核酸)浓度的变化情况及线性关系。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做进一步详细说明，以下实施例中所有原料和试剂如无特殊说明，均市售可得。
一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其中：
所述分子识别元件由磁颗粒表面修饰的DNA锚定链及DNA识别链组成；
所述DNA锚定链具有如SEQ ID No.1所示的序列；
所述DNA识别链具有如SEQ ID No.2或SEQ ID No.11所示的序列；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和DNA燃料链；
所述DNA燃料链具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.13所示的序列；
所述信号转换元件包括DNA酶链、ABTS和过氧化氢；
所述DNA酶链具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.12所示的序列。
本发明是以链霉亲和素或生物素化的DNA锚定链组装到磁性纳米颗粒的表面，并通过DNA碱基互补配对原理使DNA酶链和DNA识别链与生物素化的DNA锚定链(浓度比为1:1)在磁颗粒表面形成“三明治”结构。比色传感器在识别目标核酸链后形成远端平齐的DNA双链结构，随后加入DNA燃料链启动等温核酸扩增反应，使大量具有DNA酶链脱落至溶液中。通过磁分离将上清液分离后，向上清液中加入血红素形成具有类过氧化物酶性质的DNA酶复合体，能够在过氧化氢的存在下催化氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)生成绿色的反应产物，从而将目标核酸的存在与否转化为颜色信号，通过溶液颜色的深浅或吸光度测定即可判断待测目标核酸的浓度，实现现场原位可视化检测。
本发明的基本原理如图1所示：将磁颗粒作为传感器的组成元件，利用其易修饰性、快速磁分离特性实现DNA反应探针的富集和快速分离，提高反应效率。将能够识别目标核酸的DNA识别链、具有类过氧化物酶性质的DNA酶链通过杂交作用固定在磁颗粒表面，在目标核酸和DNA燃料链的共同作用下启动等温扩增循环反应。当有目标核酸存在时，目标核酸和DNA燃料链共同促进循环链置换反应的发生，可以释放大量具有催化性能的DNA酶链，利用其类过氧化物酶性质催化溶液产生有色的氧化产物，从而实现目标核酸的比色灵敏检测。
实施例1
一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)将10μL 10mg/mL的链霉亲和素修饰的磁颗粒分散于Tris缓冲液(5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,1M NaCl,pH＝7.4)中，清洗3次去除磁颗粒表面的保护剂。将DNA锚定链加入到链霉亲和素修饰的磁颗粒中，使DNA锚定链的终浓度为0.5μM，37℃下孵育1h后，磁分离清洗3次去除上清液，清洗后的磁颗粒分散于反应液(50mM Tris-HCl,140mM NaCl,1mMMgCl2,pH＝7.4)中。
DNA锚定链是由生物素或氨基修饰的，其序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-biotin-TTTTTTTTTTTCTCACTAACTGCATA-3’。
DNA锚定链是通过生物素-链霉亲和素或氨羧缩合作用组装到磁颗粒表面的。具体步骤可以为以下两种方案：
(a)将生物素化的DNA锚定链和链霉亲和素修饰的磁颗粒按照一定比例混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在pH＝7.4的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl,140mM NaCl,1mM MgCl2)中储存。
(b)或将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液(100mM MES,pH 6.0)中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液(100mM MES,200mM EDC,pH 6.0)和NHS缓冲液(100mM MES,100mMNHS,pH 6.0)，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液(10mM PBS,pH 7.2)洗涤三次，加入氨基修饰的DNA锚定链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液(10mMPBS,pH 7.2)中。
本实施例采用的是(a)方案。
(2)向步骤(1)得到的磁颗粒中加入DNA识别链和DNA酶链(DNA识别链和DNA酶的终浓度均为0.5μM)，37℃反应1h。磁分离清洗3次去除上清液，清洗后的磁颗粒分散于50μL反应液(50mM Tris-HCl,140mM NaCl,1mM MgCl2,pH＝7.4)中。
DNA识别链与目标核酸部分互补，其序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-GCCGATAGTTGAGGGAAAAGACCCACCTATGCAGTTAGTGAGA-3’。
DNA酶链具有类似过氧化物酶的催化活性，其序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGTCTTTTCCCTCAAC-3’。
(3)向步骤(2)得到的磁颗粒中加入0.75μM的DNA燃料链，即组装成所述比色传感器。
DNA燃料链可催化等温核酸扩增反应的进行，其序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-CTAACTGCATAGGTGGGTCTTTTCCCTCAAC-3’。
实施例2
将实施例1制得的比色传感器用于核酸检测，具体步骤如下：
(1)取实施例1制得的比色传感器，加入终浓度为100nM的目标核酸(Ebola核酸)，在37℃下等温核酸扩增反应45min，反应完后通过磁分离收集上清液50μL。
Ebola核酸的序列如SEQ ID No.5所示，具体为：
5’-GTCTTTTCCCTCAACTATCGGC-3’。
(2)向步骤(1)得到的上清液中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mMKCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，在室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化。
基于磁颗粒的等温扩增方法组装的比色传感器检测目标核酸的紫外-可见吸收光谱如图2所示。图2中，曲线a为不存在目标核酸的上清液反应后吸收光谱图，而曲线b为存在目标核酸上清液反应后吸收光谱图，通过加入目标核酸后，吸光值大幅增加，成功验证了该比色传感器能够检测目标核酸。
实施例3
分别对实施例1所述比色传感器的制备方法中DNA燃料链浓度、等温核酸扩增反应温度、等温核酸扩增反应时间进行优化。
(1)DNA燃料链浓度的优化：
实施例1的步骤(3)中分别加入终浓度分别为0nM、250μM、500nM、750nM、1000nM的DNA燃料链组装好比色传感器，随后各取50μL比色传感器，分别向其中加入终浓度为100nM目标核酸(Ebola核酸)。37℃下等温核酸扩增反应45min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mM KCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化。
如图3所示，当燃料链浓度为750nM时，得到了最高的检测信噪比。因此，DNA燃料链的浓度优选为750nM。
(2)等温核酸扩增反应温度的优化：
各取50μL实施例1制得的比色传感器，分别向其中加入终浓度为100nM目标核酸(Ebola核酸)。在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃下分别进行等温核酸扩增反应45min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液中加入14μL反应液(50mMHEPES,0.4M NaCl,40mM KCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，在室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化。
如图4所示，当等温核酸扩增反应温度为37℃时，得到了最高的检测信噪比。因此，等温核酸扩增反应的温度优选为37℃。
(3)等温核酸扩增反应时间的优化：
各取50μL实施例1制得的比色传感器，分别向其中加入终浓度为100nM目标核酸(Ebola核酸)。在37℃下反应5min、15min、30min、45min、60min、90min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mMKCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化。
如图5所示，当等温核酸扩增反应时间至45min时，溶液吸光值趋于平缓。因此，等温核酸扩增反应的时间优选为45min。
实施例4
将实施例1制得的比色传感器加入不同浓度目标核酸(Ebola核酸)后，测试上清液颜色紫外可见吸收光谱图随目标核酸浓度的变化实验，具体步骤如下：
各取50μL实施例1制得的比色传感器，向其中加入终浓度分别为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、125nM、150nM、200nM的目标核酸。在37℃下等温扩增反应45min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mM KCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，在室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化，每组实验各重复3次。
测试结果如图6(A)所示，随着目标核酸浓度的增加，分离后的上清液吸光度也随之增加，颜色从无色透明逐渐变为深绿色。说明本发明可以实现对目标核酸的定量检测。图6(B)展示了上清液吸光度与一定浓度的目标核酸存在良好的线性关系(R2＝0.9924)。按照3倍标准偏差法计算出检测限为314.1pM，证明该方法能够对目标核酸(Ebola核酸)核酸实现灵敏检测。
实施例5
实施例1制得的比色传感器对于目标核酸检测的特异性实验，具体步骤如下：
各取50μL实施例1制得的比色传感器，分别向其中加入终浓度为100nM五种不同的核酸，其中包括目标核酸(Ebola核酸)、单碱基错配Ebola(SM-Ebola)、非特异性HBV核酸、HIV核酸、Mal核酸和随机核酸序列。
目标核酸(Ebola核酸)序列如SEQ ID No.5所示，具体为：
5’-GTCTTTTCCCTCAACTATCGGC-3’。
SM-Ebola核酸序列如SEQ ID No.6所示，具体为：
5’-GTCTTTTCCCCCAACTATCGGC-3’。
HBV核酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：
5’-AAATTCGCAGTCCCCAACCTCC-3’。
HIV核酸序列如SEQ ID No.8所示，具体为：
5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’。
Mal核酸序列如SEQ ID No.9所示，具体为：
5’-AAAATTAAGTGTTCATAACAGA-3’。
随机核酸序列如SEQ ID No.10所示，具体为：
5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’。
在37℃下等温扩增反应45min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液加中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mM KCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，在室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化，每组实验各重复3次。
测试结果如图7所示，只有在加入目标病原体核酸的上清液呈绿色，单碱基错配的上清液样品管呈现淡绿色，其余上清液样品管呈无色透明，因此证明，该发明对检测目标核酸(Ebola核酸)具有良好的选择性。
实施例6
将比色传感器加入不同浓度目标核酸(H7N9核酸)后，测试上清液颜色紫外可见吸收光谱图随目标核酸浓度的变化实验，具体步骤如下：
实施例6中使用的比色传感器的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：
DNA识别链(改)序列如SEQ ID No.11所示，具体为：
5’-AATTCCTGCTTGTTCTCTCTTCCACCTATGCAGTTAGTGAGA-3’；
DNA酶链(改)序列如SEQ ID No.12所示，具体为：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGAAGAGAGAACAAGC-3’；
DNA燃料链(改)序列如SEQ ID No.13所示，具体为：
5’-CTAACTGCATAGGTGGAAGAGAGAACAAGC-3’。
各取50μL制备好的传感器，分别向其中分别加入终浓度分别为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、125nM、150nM、200nM的目标核酸(H7N9核酸)。
H7N9核酸序列如SEQ ID No.14所示，具体为：
5’-AAGAGAGAACAAGCAGGAATT-3’。
在37℃下等温扩增反应45min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。随后将得到的上清液中加入14μL反应液(50mM HEPES,0.4M NaCl,40mM KCl,2％dimethylsulfoxide(DMSO),0.1％Triton X-100,pH 8.0)和血红素(终浓度为1μM)，在室温下反应1h，形成DNA酶/血红素复合物。最后，依次加入终浓度为6mM的ABTS稀释液和终浓度为1mM的H2O2溶液，室温下孵育10min，肉眼观察溶液颜色变化。取适量反应液置于微量石英比色皿中，通过紫外-可见分光光度计记录上清液吸光值的变化，每组实验各重复3次。
测试结果如图8(A)所示，随着目标核酸浓度的增加，分离后的上清液吸光度也随之增加，颜色从无色透明逐渐变为深绿色。说明本发明可以实现对目标核酸的定量检测。图8(B)展示了上清液吸光度与一定浓度的目标核酸存在良好的线性关系(R2＝0.9824)。证明本发明可以对多种目标核酸进行检测，具有强大的可编程性。
表1实施例1-6中出现的人工引物的序列表
Figure BDA0003003261620000121
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt tctcactaac tgcata 26
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgatagtt gagggaaaag acccacctat gcagttagtg aga 43
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgggtct tttccctcaa c 41
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaactgcat aggtgggtct tttccctcaa c 31
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcttttccc tcaactatcg gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcttttccc ccaactatcg gc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaattcgcag tccccaacct cc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actgctagag attttccaca t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaattaagt gttcataaca ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aattcctgct tgttctctct tccacctatg cagttagtga ga 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggaaga gagaacaagc 40
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctaactgcat aggtggaaga gagaacaagc 30
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagagagaac aagcaggaat t 21

Claims (10)

1.一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件由磁颗粒表面修饰的DNA锚定链及DNA识别链组成；
所述DNA锚定链具有如SEQ ID No.1所示的序列；
所述DNA识别链具有如SEQ ID No.2或SEQ ID No.11所示的序列；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和DNA燃料链；
所述DNA燃料链具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.13所示的序列；
所述信号转换元件包括DNA酶链、ABTS和过氧化氢；
所述DNA酶链具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.12所示的序列。
2.权利要求1所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)将DNA锚定链通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面；通过磁分离去除多余的DNA锚定链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
所述DNA锚定链具有如SEQ ID No.1所示的序列；
步骤2)向步骤1)得到的磁颗粒中加入一条DNA识别链及一条DNA酶链，在磁颗粒表面形成“三明治”结构；通过磁分离去除多余的DNA识别链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
所述DNA识别链具有如SEQ ID No.2或SEQ ID No.11所示的序列；
所述DNA酶链具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.12所示的序列；
步骤3)向步骤2)得到的磁颗粒中加入DNA燃料链，即组装成所述比色传感器；
所述DNA燃料链具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.13所示的序列。
3.根据权利要求2所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)所述磁颗粒是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为100nm～2μm。
4.根据权利要求2所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)与步骤2)所述清洗的次数为3～5次。
5.根据权利要求2所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)所述将DNA锚定链通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面，包括以下两种方式：
步骤a)将生物素化的DNA锚定链和链霉亲和素修饰的磁颗粒混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在pH＝7.4的Tris缓冲液中储存；
所述Tris缓冲液为：50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2；
步骤b)将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入氨基修饰的DNA锚定链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液中；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH 6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH 6.0；
所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH 6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH 7.2。
6.根据权利要求2所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)所述DNA锚定链是由生物素或氨基修饰的，其浓度为100～1000nM；步骤2)所述DNA识别链与目标核酸部分互补，其浓度为100～1000nM；步骤2)所述DNA酶链具有类似过氧化物酶的催化活性，其浓度为100～1000nM；步骤3)所述DNA燃料链可催化等温核酸扩增反应的进行，其浓度为100～1000nM。
7.权利要求1所述的一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器或权利要求2-6任一项所述制备方法制得的比色传感器在核酸检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
步骤A)向步骤3)制得的比色传感器中加入目标核酸，进行等温核酸扩增反应，在25～45℃下反应20～90min后，通过磁分离，收集上清液；
步骤B)向上清液中加入血红素反应30～90min后，加入ABTS/H2O2溶液进行反应5～20min；观察溶液颜色变化，并通过紫外分光光度计测量溶液的吸光度的变化，即可。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤3)所述DNA燃料链的浓度为750nM；步骤A)所述等温核酸扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为45min。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤B)所述血红素的终浓度为0.25～1μM；所述ABTS的终浓度为2～6mM；所述H2O2的终浓度为0.5～5mM。
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