CN112501248A

CN112501248A - 一种可视化核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN112501248A
Application number: CN202011644377.2A
Authority: CN
Inventors: 邓锐杰; 林锋; 张婷
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112501248B; CN111471743A

Abstract

本发明公开了一种可视化核酸检测试剂盒，属于分子检测领域。所述试剂盒包括分子识别试剂和信号转换试剂；所述分子识别试剂是嵌有金属离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个或多个C或者T碱基，在金属离子的作用下相互配对；所述信号转换试剂由脲酶、尿素和pH指示剂组成。当样品中存在靶标核酸时，靶标核酸序列与错配链竞争性结合底物链，置换出错配链，金属离子游离出来，抑制脲酶活性，进而抑制尿素分解；若无靶标核酸，脲酶会催化尿素分解产生氨，溶液pH增加，可通过pH指示剂表征。本发明的试剂盒不依赖核酸扩增反应，具有操作简便性和可视化结果呈现的功能。

Description

一种可视化核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测领域。

背景技术

随着科技发展，核酸检测技术目前已经广泛应用于疾病检测、刑侦、品种鉴别等诸多领域。核酸检测的手段很多，主要包括测序、PCR、等温扩增、核酸印迹等类型，每个类型又有多种具体的检测技术。不同的应用场景中，适用的检测技术各不相同。

目前已经应用于疾病检测的技术主要有实时荧光定量RT-PCR、定量即时聚合酶链锁反应qRT-PCR、Northern印迹分析和微阵列芯片技术，以及滚环扩增(RCA)、环介导恒温扩增(LAMP)和指数扩增反应(EXPAR)等恒温扩增技术。

实时荧光定量RT-PCR、定量即时聚合酶链锁反应qRT-PCR、Northern印迹分析和微阵列芯片技术所需的仪器设备价格昂贵、实验室条件要求严格，检测过程操作复杂、检测时间长，操作技术要求高，难以在一般条件的科研机构或者临床单位开展。近年来，恒温核酸扩增技术在microRNA检测领域逐渐发展起来。滚环扩增(RCA)、环介导恒温扩增(LAMP)以及指数扩增反应(EXPAR)等恒温扩增技术的发展使得microRNA的检测达到了较高的灵敏度，检测成本也降低了，但大多数恒温扩增技术反应时间较长，反应机理较为复杂，难以满足临床检测的需求。因此，开发操作简单、便携，能对样品进行实时现场分析，适用于临床应用和个体医疗的microRNA检测的研究热点。

DNA碱基与重金属离子间存在配合反应，其基本原理是：原本不配对的碱基X与X，在加入离子M后，会形成X-M-X的结构而形成化学键，互补配对。比较常见的配对方式包括Hg²⁺作用下的T-T配对(T-Hg²⁺-T)，以及Ag⁺作用下C-C配对(C-Ag⁺-C)。该原理经常用于检测重金属离子，例如：文献【A simple“molecular beacon”-based fluorescent sensingstrategy for sensitive and selective detection of mercury(ii).ChemicalCommunications,2011,47(44):12158.】公开了一种汞离子检测方法，用到两种分子：茎环结构DNA分子甲和单链DNA分子乙；分子甲的茎部分2个末端分别修饰荧光基团和淬灭基团，正常情况下不会发出荧光。但当汞离子存在时，对前述两种分子的混合溶液进行加热变性，再降温复性，即可得到T-T碱基对，部分分子甲无法恢复成原来的发夹结构，其荧光基团和淬灭基团相互远离，荧光基团即可释放荧光。

目前，DNA碱基与重金属离子间的错配反应原理尚未见用于核酸分子的可视化检测。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种全新的可视化核酸检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种基于脲酶的核酸检测试剂盒，它包括分子识别试剂和信号转换试剂；

所述分子识别试剂是一类嵌有金属离子的DNA双链分子，所述DNA双链分子由底物链和错配链碱基互补配对而成，其中底物链与错配链各有一个或多个错配碱基，在金属离子的作用下相互配对；

所述金属离子是银离子时，错配碱基为胞嘧啶碱基C；所述金属离子为汞离子时，错配碱基为胸腺嘧啶碱基T；

所述信号转换试剂包括：a)脲酶；b)尿素和pH指示剂的混合溶液；

脲酶和尿素的摩尔浓度比例为1:(10⁷～2×10⁷)；pH指示剂和尿素的摩尔浓度比为：1：(5×10²～3×10³)。

进一步地，所述试剂盒的靶标核酸为let-7a；

所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，或在SEQ ID NO.1基础上向5’端延伸2～8个碱基；所述错配链序列如SEQ ID NO.6所示，或在SEQ ID NO.6基础上向3’端延伸2～8个碱基；错配链延伸的长度与底物链延伸的长度一致；优选地，所述pH指示剂是苯酚红。

进一步地，所述嵌有金属离子的DNA双链分子中，金属离子、底物链和错配链的终浓度物质的量之比为1：1：1；

和/或，脲酶浓度为100mM；

和/或，每50μL尿素和苯酚红的混合溶液的配置方法为：取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

进一步地，所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，错配链序列如SEQ ID NO.6所示；

或，所述底物链序列如SEQ ID NO.2所示，错配链序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述底物链序列如SEQ ID NO.3所示，错配链序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步地，所述底物链序列如SEQ ID NO.4所示，错配链序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，所述底物链序列如SEQ ID NO.5所示，错配链序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步地，所述试剂盒中的试剂被固定到试纸上，试纸分为不同区域，尿素和pH指示剂、分子识别试剂、脲酶分别位于3个不同区域；

所述试纸为滤纸，优选的，为水性微孔滤纸。

优选的，试纸以普鲁兰多糖为保护剂，以隔绝氧气。

一种非诊断目的的核酸的检测方法，其特征在于：它是使用前述试剂盒检测核酸的方法。

进一步地，所述包括如下步骤：

1)分子识别试剂与样本在室温接触30～90min；

2)脲酶与步骤1)中分子识别试剂在室温接触40min；

3)尿素和苯酚红溶液与步骤2)中脲酶接触30min；

4)肉眼观察颜色变化，或测定560nm波长下的紫外吸收强度值；

步骤2)中，脲酶和金属离子的摩尔浓度比例为1:(10～50)。

以检测let-7a的试剂盒为例，简要说明本发明的试剂盒的工作原理如下：

分子识别试剂中，底物链和错配链通过Ag⁺错配形成C-C碱基对(或通过Hg²⁺错配形成T-T碱基对)，分子识别试剂与let-7a接触后，let-7a会与错配链竞争性结合底物链(无需加热变性再降温复性)，置换出错配链，打开C-C碱基对(或T-T碱基对)，释放Ag⁺(或Hg²⁺)。Ag⁺(或Hg²⁺)会使脲酶活性降低，此时尿素得不到有效降解，pH呈中性，含有尿素、苯酚红的混合溶液保持原有的黄色；当环境中没有let-7a，Ag⁺(或Hg²⁺)无法得到释放，脲酶活性正常，尿素降解，pH上升，原含有尿素、苯酚红的混合溶液的颜色会转为红色。苯酚红可以替代成其他pH指示剂。

本发明的试剂盒是对DNA碱基与重金属离子间的错配反应原理的创新运用。其与现有技术的区别主要在于：现有技术中检测信号的产生依赖错配碱基从无到有；而本发明借助逆向思维，其检测信号的产生依赖错配碱基从有到无。

本发明的试剂盒具有如下有益效果：

1)灵敏度高。可检测浓度低至2.808pM的核酸分子，比如miRNA let-7a。

2)特异性好。可特异性识别错配2个碱基以上的目标分子。

3)检测方便。检测过程不需要加热，检测结果肉眼可见，且能将试剂固定到试纸上，进一步简化操作。

需要指出的是，本发明中“置换”、“置换反应”指由正确配对的碱基置换出错配碱基(以C-Ag⁺-C或T-Hg²⁺-T的形式配对)的过程，并非化学领域通常定义的“置换反应是单质与化合物反应生成另外的单质和化合物的化学反应”。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是采用本发明提供的比色感器检测靶标序列let-7a的原理示意图。

图2是实施例2绘制的标准曲线。

图3是实施例3中检测病人肺癌组织和癌旁组织中let-7a的结果。

图4是实施例4中比色传感器对不同的C-C错配数量的测试结果。

图5是实施例5中该比色传感器对靶标序列let-7a的特异性选择性测试结果。

图6是试纸检测原理示意图。

图7是实施例6中检测病人肺癌组织和癌旁组织中let-7a的结果。

图8胸腺嘧啶T与汞离子作用测试。

具体实施方式

实施例1制备双链DNA溶液

本实施例中，制备双链DNA溶液，该双链DNA在检测靶标序列microRNA,let-7a过程中起到分子识别的作用。

首先合成底物链和错配链，其序列如表1所示。

toehold结构，指双链DNA末端无法配对的单链部分。表1中，底物链/错配链序列的划线部分为toehold结构，链的序号均以toehold长度定义。具有相同序号的底物链和错配链各自成对，相互配合使用，例如序号3nt的底物链(sSub-3nt)与序号3nt的错配链(mSub-3nt)配合使用。

toehold紧靠未划线序列的碱基都是C，C与C无法互补配对，因此整个每对sSub和mSub的toehold区域无法进行碱基互补配对，除非加入了银离子。

表1底物链(sSub)和错配链(mSub)的序列

合成双链DNA(分子识别试剂)的具体方法如下：

将5μL浓度为2μM的Ag⁺,5μL浓度为1μM的DNA底物链(sSub-5nt)，5μL浓度为1μM的DNA错配链(mSub-5nt)加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，置于PCR管中，保持总体积30μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，形成C-C结构(银离子作用下胞嘧啶配对)，底物链和错配链互补形成双链结构，该过程如图1中第一个箭头所示。

重复前述操作，制备得到若干份双链DNA溶液，每份30μL。

实施例2绘制标准曲线

本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下：

①取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液30μL，向其中加入10μL浓度为0nM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

②取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

③将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值；

④依次使用let-7a浓度分别为100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、200nM、500nM、1000nM的乙let-7a溶液代替步骤①中的使用的let-7a溶液,重复步骤①,②,③的操作,测定紫外吸收值，以let-7a溶液浓度为横坐标，以该let-7a溶液浓度下的紫外吸收为为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为y＝-0.064x+0.4907，LOD(最低检测限)＝2.808pM其中，y代表紫外吸收度，x代表let-7a浓度，标准曲线如图2所示。

小结：本实施例一方面得到了标准曲线；另一方面验证了本发明试剂盒灵敏度高，LOD为2.808pM。

实施例3临床检测

本实施例中，检测来自5位肺癌病人癌症组织和癌旁组织中靶标序列let-7a的浓度，并分析其显著性差异，步骤如下：

(1)取5位的肺癌病人癌症组织和癌旁组织的，依次记作1#～5#，癌症组织记为C，癌旁组织记为A，提取1#～5#组织的总RNA，制成RNA水溶液。

(2)RNA水溶液的let-7a检测

①取实施例1中制备的含有C-C结构的双链DNA溶液两份(30μL)，依次向其中加入1#A和1#C样品溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

③将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该肺癌病人1#A和1#C组织let-7a的紫外吸收强度值；

④依次使用2#～5#肺癌病人的癌症组织和癌旁组织代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①,②,③的操作，得到2#～12#肺癌病人样品的紫外吸收光度值并记录；

⑤将1#～5#肺癌病人的癌症和癌旁组织总RNA溶液的紫外吸收光度值分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各病人癌症组织和癌旁组织中let-7a的浓度。

结果：如图3所示，其中有十个病人的癌症组织和癌旁组织中let-7a的含量具有显著性差异。由图中误差条(error bar)还可知晓，每次重复检测的结果差别很小，表明检测可重复性良好。

结论：本发明的方法或者其衍生的试剂盒可用于临床检测，得到可靠的检测结果。

实施例4双链DNAC-C错配数量对结果的影响

本实施例中，检测不同的C-C错配数量的紫外吸光度值

①将5μL浓度为2μM的Ag⁺,5μL浓度为1μM的DNA底物链，5μL浓度为1μM的DNA错配链加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，置于PCR管中，保持总体积30μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，底物链和错配链互补形成双链结构形成含有一个C-C结构的双链DNA溶液，底物链和错配链的序列如表1中sSub-5nt,mSub-5nt。

②取①中制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，依次向其中加入溶液10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL超纯水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

③取10μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

④将①，②制得的溶液混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录let-7a的紫外吸收强度值；

⑤依次使用sSub-C₂、sSub-C₃代替①中的mSub-5nt,mSub-C₂、mSub-C₃代替①中mSub-5nt,重复步骤①,②,③,④的操作，得到紫外吸收光度值并记录。sSub-C₂、sSub-C₃、mSub-C₂、mSub-C₃的序列如表2所示。

表2 C-C错配数为2或2的序列

名称	SEQ ID NO.	序列
			sSub-C<sub>2</sub>	11	<u>TGCAC</u>AACTATACAACCTACTACCTCA
sSub-C<sub>3</sub>	12	<u>CGCAC</u>AACTATACAACCTACTACCTCA
			mSub-C<sub>2</sub>	13	TAGGTTGTATAGTT<u>CTCCA</u>
mSub-C<sub>3</sub>	14	TAGGTTGTATAGTT<u>CTCCC</u>

注：划线部分为toehold。

结果：实验结果如图4所示，C-C错配数量越高，阳性对照和阴性对照之间的信号差别就越小。

结论：C-C错配数越低，检测信噪比越高。

实施例5对靶分子的选择特异性

本实施例中，检测本发明方法对靶标序列let-7a的选择特异性。

(1)用超纯水分别配制2μM的sSub-1nt、sSub-3nt、sSub-5nt、sSub-7nt、sSub-9nt、mSub-1nt、mSub-3nt、mSub-5nt、mSub-7nt、mSub-9nt的DNA溶液和2μM的let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g核酸溶液；并使用实施例1的方法将所有的sSub和mSub成对制备成双链DNA溶液。

③取10μL浓度为2.5mM苯酚红的溶液，10μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到30μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。

⑤依次使用let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和超纯水代替②中的let-7a,重复步骤②,③,④的操作，得到紫外吸收光度值并记录。

let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g的序列如表3所示。

表3被检microRNA的序列

名称	SEQ ID NO.	序列
			let-7a	15	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
let-7b	16	UGAGGUAGUAGGUUGUgUgGUU
			let-7c	17	UGAGGUAGUAGGUUGUAUgGUU
let-7d	18	aGAGGUAGUAGGUUGcAUAGU
			let-7e	19	UGAGGUAGgAGGUUGUAUAGU
let-7f	20	UGAGGUAGUAGaUUGUAUAGUU
			let-7g	21	UGAGGUAGUAGuUUGUAcAGU

注：序列中小写字母为相对于let-7a突变的碱基。

结果：

如图5所示，在检测正确的microRNA样本(let-7a)时，随着toehold长度的增加，检测信号强度逐渐降低；其中，toehold长度在1～7nt时，检测信号强度都处于高位。对于不同toehold长度的双链DNA，均能够有效区分水和microRNA样本。

当用于辨别正确的microRNA样本(let-7a)与双碱基突变的错误microRNA样本(let-7b，let-7g)时，本发明仍具有较好的特异性。

当用于辨别正确的microRNA样本(let-7a)与单碱基突变的错误microRNA样本(let-7c，d，e，f)时，本发明的特异性明显降低，仅能区分let-7a与某些特定单碱基突变的microRNA，例如let-7d。

结论：

本发明对2碱基以上突变的microRNA样本能有效辨别，具有良好的特异性。

实施例6试纸的制备与检测

本实施例中，使用试纸检测取自12个肺癌病人癌症组织和癌旁组织中靶标序列let-7a的浓度。

1.试纸的制备

(1)在滤纸上打孔，制作如图6所示的折纸。

(2)制备反应液。

①制备50μL浓度为400nM的Ag⁺溶液。

②将5μL浓度为4μM的Ag⁺,5μL浓度为4μM的DNA底物链，5μL浓度为4μM的DNA错配链加入到15μL缓冲液(1M NaNO₃，pH＝6.9)中，加水20μL置于PCR管中，保持总体积50μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，形成C-C结构，底物链和错配链互补形成双链结构。

③制备50μL浓度为12nM的脲酶溶液。

④取20μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，20μL浓度为5M的尿素水溶液，5g普鲁兰多糖室温下加入到10μL超纯水中，得到尿素-苯酚红混合溶液50μL。当尿素-苯酚红混合溶液加入到试纸中时，普鲁兰多糖起到隔绝氧气，减缓氧化，延长试纸有效期限的作用。

(3)将反应液加到相应的孔中，制作检测试纸。

在②面相应的孔中分别加入4μL超纯水，4μL步骤①制得的Ag⁺溶液，剩余两个孔中分别加入4μL步骤②制得的含有C-C结构的DNA双链。在③面的四个孔中分别加入4μL步骤③制得的脲酶溶液。在④面的四个孔中分别加入4μL步骤④制得的尿素-苯酚红混合溶液，制成检测试纸。

制备过程如图6左栏所示。

2.检测(如图6右栏所示)

1)加水到试纸的①面和②面的孔里；

2)折叠试纸，使②面和③面上面的孔成对贴紧，室温静置30min；此步骤目的是混合DNA双链和脲酶；

3)加样到①面的其中两个孔里，将①面折叠到②③面上，室温静置30min；此步骤目的是将样本与DNA双链混合，如有let-7a存在，let-7a会将DNA双链中的错配链置换掉，C-C中嵌合的银离子会逃离双链结构，进而抑制脲酶活性；

4)折叠①②③面到④面，室温静置20min；此步骤引入尿素-苯酚红混合溶液，使其与脲酶接触；

5)观察颜色，黄色表示检测到let-7a，红色表示未检测到let-7a。

3.结果

实验结果如图7所示，3～5#病人癌旁组织检测到let-7a，其癌组织未检测到let-7a；1～2#病人癌旁组织和癌组织均未检测到let-7a。

4.结论

本发明方法中的试剂集成到试纸后，操作简便，结果可读性强。

实施例7置换反应条件测试

本实施例中，对比本专利靶标序列let-7a置换条件与其他置换条件的置换效果。

A组：

①取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

②取30μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，30μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到90μL分子水中，得到尿素-苯酚红混合溶液150μL。

③取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与①混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值为0.108±0.002。

B组：

④取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置15min(本专利置换时间为30～90min)进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

⑤取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与④混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值0.638±0.011。

C组：

⑥取实施例1制备的含有C-C结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL超纯水，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育40min，得到反应混合液。

⑦取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与④混合，室温下反应30min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录不加let-7a时反应混合液的紫外吸收强度值0.742±0.012。

对比A、C组的紫外吸收强度值，发现在本发明的置换条件(置换时间为30～90min)下，置换效果明显；而对比B、C组，在本发明的置换条件外，置换效果很差，几乎不发生置换；结合A、B、C三组，发现，在本发明探索出的置换条件可以得到理想的置换效果。

实施例8胸腺嘧啶T与汞离子Hg²⁺作用及let-7a对其置换效果测试

本实施例中，探究胸腺嘧啶T与汞离子Hg²⁺的作用。

首先合成底物链和错配链，其序列如表4所示。

表4中，底物链/错配链序列的划线部分为toehold结构，toehold长度为5nt。

toehold紧靠未划线序列的碱基都是T，T与T无法互补配对，因此整个每对sSub和mSub的toehold区域无法进行碱基互补配对，除非加入了汞离子。

表4胸腺嘧啶T与汞离子Hg²⁺作用底物链(sSub)和错配链(mSub)的序列

首先合成双链含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)的DNA(分子识别试剂)的具体方法与实施例1相似：

①将5μL浓度为2μM的Hg²⁺,5μL浓度为1μM的DNA底物链(sSub(T))，5μL浓度为1μM的DNA错配链(mSub(T))加入到15μL缓冲液(1M NaNO3，pH＝6.9)中，置于PCR管中，保持总体积30μL。在90℃下孵育5min，室温下孵育30min，使银离子参与反应，形成T-T结构(汞离子作用下胸腺嘧啶配对)，底物链和错配链互补形成双链结构，重复实验制备若干份双链DNA溶液。

②取含有T-T结构的双链DNA溶液一份(30μL)，向其中加入10μL浓度为2μM的let-7a溶液，在室温放置30min进行置换反应。然后加入6μL浓度为100nM的脲酶，4μL分子水混匀，保持总体积50μL，后在室温下孵育30min，得到反应混合液。

③取30μL浓度为2.5mM的苯酚红溶液，30μL浓度为5M的尿素水溶液室温下加入到90μL分子水中，得到尿素-苯酚红混合溶液150μL。

④取50μL②制得的尿素-苯酚红溶液与①混合，室温下反应20min,在560nm的波长下测定反应混合液的紫外吸收，记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值为0.052±0.003。

⑤同时，取①制得的双链DNA溶液，用10μL分子水代替②中的10μL浓度为2μM的let-7a溶液，重复②③④记录该let-7a浓度下的紫外吸收强度值为0.832±0.002，实验结果如图8所示。

对比实例8中let-7a置换在汞离子作用的含有T-T结构的双链DNA和实施例7中银离子作用下let-7a置换含有C-C结构的双链DNA发现：

汞离子作用下形成含有T-T结构的双链DNA溶液的吸光度更强，DNA双链的形成几乎完全消除了汞离子对脲酶的抑制作用，且该作用甚至优于C-C结构形成造成的银离子对脲酶抑制作用的减弱；同时，let-7a对于置换T-T结构双链DNA释放汞离子的能力也明显优于置换C-C结构双链DNA释放银离子的能力(图8左侧)。整体上，使用T-T结构的背景吸光度值与信号吸光度值的比值可达16，相比C-C结构的6.86具有显著性差异(图8右侧)。

本实施例的结果说明：将实施例1的错配碱基替换成T，金属离子替换成Hg²⁺，同样能实现对靶标核酸的有效检测，检测效果甚至更好。

综上，本发明的核酸检测方法具有较高的灵敏度、特异性和稳定性；无需进行核酸扩增，无需借助可编程加热装置、荧光检测装置，检测过程方便快捷；可集成到试纸上，可进一步简化检测操作。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种可视化核酸检测试剂盒

<130> GYKH1630-2020P0111965CCZ

<150> 2020104167428

<151> 2020-05-15

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caactataca acctactacc tca 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaactata caacctacta cctca 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcacaacta tacaacctac tacctca 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgcacaac tatacaacct actacctca 29

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgatacaca actatacaac ctactacctc a 31

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgcacaacta tacaacctac tacctca 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcacaacta tacaacctac tacctca 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taggttgtat agttctcca 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taggttgtat agttctccc 19

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 15

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 16

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 17

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 18

agagguagua gguugcauag u 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 19

ugagguagga gguuguauag u 21

<210> 20

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 20

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 21

ugagguagua guuuguacag u 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgcataacta tacaacctac tacctca 27

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taggttgtat agttttgca 19

Claims

1.一种基于脲酶的核酸检测试剂盒，其特征在于：它包括分子识别试剂和信号转换试剂；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒的靶标核酸为let-7a；

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述嵌有金属离子的DNA双链分子中，金属离子、底物链和错配链的终浓度物质的量之比为1：1：1；

和/或，脲酶浓度为100mM；

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：

所述底物链序列如SEQ ID NO.1所示，错配链序列如SEQ ID NO.6所示；

5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.3所示，错配链序列如SEQ ID NO.8所示。

6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.4所示，错配链序列如SEQ ID NO.9所示。

7.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述底物链序列如SEQ ID NO.5所示，错配链序列如SEQ ID NO.10所示。

8.如权利要求1～7任一所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的试剂被固定到试纸上，试纸分为不同区域，尿素和pH指示剂、分子识别试剂、脲酶分别位于3个不同区域；

所述试纸为滤纸，优选的，为水性微孔滤纸；

优选的，试纸以普鲁兰多糖为保护剂，以隔绝氧气。

9.一种非诊断目的的核酸的检测方法，其特征在于：它是使用权利要求1～8任一所述试剂盒检测核酸的方法。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)分子识别试剂与样本在室温接触30～90min；

2)脲酶与步骤1)中分子识别试剂在室温接触40min；

3)尿素和苯酚红溶液与步骤2)中脲酶接触30min；

4)肉眼观察颜色变化，或测定560nm波长下的紫外吸收强度值；

步骤2)中，脲酶和金属离子的摩尔浓度比例为1:(10～50)。