CN110129417B - 基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。本案通过结合变色银纳米簇的识别/信号输出及杂交链式反应的信号放大性能，实现了miRNA的高灵敏度、高特异性的荧光检测。

Description

基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法
技术领域
本发明涉及miRNA检测技术领域，特别涉及一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，miRNA普遍存在于真核细胞中。传统的检测方法包括Northern印迹杂交法，微阵列分析法和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如Northern印迹杂交法耗时费力，对待测样品都需求量大，不能用于低丰度miRNA的检测；微阵列分析法可以实现miRNA的多重检测，但是其灵敏度不足，特异性差，动态范围窄，此外芯片的制作和检测费用高；qRT-PCR的灵敏度高，但是miRNA序列短，限制了其逆转录步骤，此外，qRT-PCR通常需要复杂的引物设计和精确控温。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，以期通过对现有miRNA检测手段的改进，实现对miRNA的高灵敏度、高特异性荧光检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，其包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；
其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；
信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述捕获探针具有第一特定结构。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述信号探针具有第二特定结构。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述捕获探针被设置为当其捕获目标miRNA后，所述第一特定结构被改变，并游离出特定单链。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述信号探针被设置为所述第二特定结构能够与游离出的特定单链反应，并在辅助探针的存在下，触发杂交链式反应，导致信号探针的DNA结构被改变，使结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述第一特定结构为颈环结构。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，所述第二特定结构为颈环结构。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，当目标miRNA为miR-17-5p时，捕获探针的序列为：AATCCCAATCCCAATCCCCTACCTGCAC TGTAAGCACTTTGGGGATTGGGATT；辅助探针的序列为：GGGATTGG GATTGGGATTGTGATGAATCCCAATCCC。
优选的是，所述的miRNA检测方法，其中，当目标miRNA为miR-17-5p时，信号探针的序列为：CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTTAATCCCAAT CCCAATCCCGGGATTGGGATTCATCACAAAAAAACCCCCTAATTCCCCC。
本发明的有益效果是：本案通过结合变色银纳米簇的识别/信号输出及杂交链式反应的信号放大性能，实现了miRNA的高灵敏度、高特异性的荧光检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法的原理示意图。
图2(A)为A20NC模板化银纳米簇及T20NC模板化银纳米簇的紫外可见吸收光谱图；图2(B)为A20NC、T20NC、A20NC/T20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图。
图3(A)为信号探针模板化银纳米簇与不同浓度miRNA反应杂交后的荧光发射光谱图；图3(B)为荧光强度与miRNA对数浓度的关系曲线图；图3(C)为红色荧光/黄色荧光强度比值与miRNA对数浓度的关系图。
图4为错配miRNA分子与血清中加入目标miRNA分子后的荧光比值柱状图。
图5为HeLa细胞共聚焦成像图：(A)为只加入信号探针后；(B)为加入信号探针、捕获探针及辅助探针后。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本案的检测原理如图1所示，设计具有特定结构(例如可以是颈环结构)的信号探针(signal probe)，以其部分区域为模板，通过硼氢化钠还原硝酸银，首先合成出能够发射某一颜色荧光(例如是红光)的银纳米簇；设计具有特定结构(例如可以是颈环结构)的捕获探针(capture probe)，具有特定结构(例如是颈环结构)的捕获探针可以与目标miRNA结合，从而改变特定结构(例如打开颈环结构)，游离出的单链DNA可以改变信号探针的特定结构(例如打开颈环结构)，在辅助探针(auxiliary probe)的存在下，触发杂交链式反应，信号探针上的DNA结构进而发生改变，导致红色荧光银纳米簇变色为另一种颜色荧光(例如是黄色)银纳米簇。通过监测两种荧光的发射强度，可实现对目标miRNA的定量分析，也可以为细胞内荧光成像提供基础和材料。
实施例
以miR-17-5p作为目标miRNA为例，本实施例涉及的DNA与RNA序列如表1：
表1 DNA与RNA序列
操作具体为：
(1)DNA模板化银纳米簇的合成：将DNA序列(包括信号探针，以及用作对比的序列A20NC或T20NC或A20NC/T20NC)加热到95℃，保持5分钟，然后缓慢冷却到室温。将DNA与硝酸银在PBS(pH7.4)中进行混合，搅拌30秒，反应1小时后，加入硼氢化钠，剧烈搅拌1分钟。DNA、硝酸银与硼氢化钠的比例保持为1：10：10。随后，将反应后的产物置于黑暗中，然后保存待用。
(2)miRNA定量分析：将标准品的目标miRNA(miR-17-5p)溶于纯净水中，配置不同浓度的miR-17-5p。然后将其与15μM捕获探针、信号探针及辅助探针混合，放置于室温下反应4小时；接着进行荧光检测。作为对比试验，将上述操作中的信号探针分别替换为A20NC或T20NC或A20NC/T20NC。试验结果参见图2和图3。作为对比例，A20NC和T20NC也具有颈环结构。
(3)选择性研究：合成4段单碱基与双碱基错配的miRNA(mismatch 1、mismatch 2、mismatch 3和mismatch 4)，将它们配制为10nM浓度的溶液，并与捕获探针，信号探针及辅助探针混合，反应4小时后，记录荧光光谱，并与目标miRNA反应后体系的荧光进行比较。试验结果参见图4。
(4)细胞原位成像：HeLa细胞培养于DMEM培养基中，在生长指数期利用胰蛋白酶将细胞消化，收集后使用PBS进行清洗。将0.5mL的细胞(106)置于共聚焦板上培养24小时；将5μL DNA模板化的银纳米簇，5μL的捕获探针，5μL的辅助探针均加入孔中，细胞继续在37℃下反应4小时；随后使用共聚焦显微镜进行成像观察，结果参见图5。
图2(A)为A20NC模板化银纳米簇及T20NC模板化银纳米簇的紫外可见吸收光谱图；图2(B)中，曲线a为T20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图(500nm激发)，曲线b为A20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图(500nm激发)，曲线c为A20NC/T20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图(500nm激发)，曲线d为A20NC/T20NC模板化银纳米簇的荧光光谱图(565nm激发)。
图2(A)显示了A20NC模板化银纳米簇及T20NC模板化银纳米簇的紫外可见吸收光谱，由图2(A)可知，两者的紫外可见吸收光谱没有显著差异，说明其结构相似。图2(B)中显示，T20NC模板化银纳米簇在500nm激发下没有荧光发射，而A20NC模板化银纳米簇则可以在500nm激发下产生显著的黄色荧光发射；A20NC与T20NC杂交后，两类银纳米簇靠近后，黄色荧光信号降低，红色荧光信号增强(565nm激发)；这表明在T20NC和A20NC序列杂交后，两个AgNCs成核区域紧密靠近，这会极大地影响AgNCs的荧光发射波长，可以更清楚地观察到颜色转换。因此，在DNA杂交反应后可以实现变色AgNCs。但由于A20NC/T20NC没有靶向性，它不适合作为本案的信号探针。
图3(A)为信号探针模板化银纳米簇与不同浓度miRNA(0,0.01,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,3,5,10nM)反应杂交后的荧光发射光谱图。(曲线I：500nm激发；曲线II：565nm激发)；图3(B)为荧光强度与miRNA对数浓度的关系曲线图；图3(C)为红色荧光/黄色荧光强度比值与miRNA对数浓度的关系图。
在优化实验条件下，本案测试了不同浓度miRNA引发的荧光强度变化，如图3(A)所示，随着miRNA浓度的增加，630nm(红光)处的荧光发射强度逐渐降低，而570nm(黄光)处都荧光发射强度逐渐增加，这说明随着miRNA浓度的增加，有更多的信号探针颈环结构被打开，两个紧密靠近的AgNCs成核区域空间位置分离，实现了荧光信号从红色转化为黄色的过程。图3(B)为对应的荧光强度曲线图，曲线e为红光(630nm)的荧光强度曲线图，曲线f为黄光(570nm)的荧光强度曲线图，由图3(B)可以看出，红光(630nm)的荧光峰强度逐渐降低，黄光(570nm)的荧光峰强度逐渐升高。本案接着将两个荧光强度进行比值处理，如图3(C)所示，该比值(红光荧光强度Fr/黄光荧光强度Fy)与miRNA对数浓度呈线性相关，回归方程为y＝3.325–2.661x(n＝3,R2＝0.992)，检测线为2.8pM(信噪比为3)。这表明所提出的比率荧光检测方法检测miRNA具有优异的检测性能，如：较宽的检测范围和较高的灵敏度。
图4为错配miRNA分子(mismatch 1、mismatch 2、mismatch 3、mismatch 4)与血清(serum 1、serum 2、serum 3)中加入目标miRNA分子(target)后的荧光比值柱状图。通过监测荧光强度比值来验证检测方法的选择性。目标miRNA浓度为0.4nM，错配miRNA浓度为10nM，由图4可知，错配miRNA的荧光比值远高于目标miRNA(target)的荧光比值，这说明了具有相对低浓度的目标miRNA可以有效地触发杂交链式反应，导致具有低荧光比值的颜色转变。然而，所有错配的miRNA的荧光比值非常大，表明即使它们具有显著较高的浓度也不能触发杂交链式反应产生颜色转变。因此错配miRNA可以很好地被区分开，显示了本案的方案具有高选择性。此外本案还在三个独立血清样本中加入目标miRNA，检测结果显示其荧光比值在较低区域，与纯品miRNA结果类似，证实了本案检测方法的特异性和潜在实际应用价值。
图5表明只有信号探针存在情况下，细胞内的miRNA无法与其作用，因此共聚焦图像显示出信号探针上原有的红色，而当体系中同时存在捕获探针、信号探针及辅助探针时，DNA结构发生变化，红色荧光转变为黄色荧光。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
发明名称：基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法
申请人名称：济南国科医工科技发展有限公司、苏州市中心血站
序列名称序列 (5’ to 3’)
miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
capture probe AATCCCAATCCCAATCCCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGGGGATTGGGATT
signal probe CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTTAATCCCAATCCCAATCCCGGGATTGGGATTCATCACAAAAAAACCCCCTAATTCCCCC
A20NC AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCCCTAATTCCCCC
T20NC CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
auxiliary probe GGGATTGGGATTGGGATTGTGATGAATCCCAATCCC
mismatch 1 CTAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
mismatch 2 CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUTG
mismatch 3 CAAAGUGCUUTCAGUGCAGGUAG
mismatch 4 CAAAGUGCAAACAGUGCAGGUAG

Claims (1)

1.一种用于非疾病诊断的基于变色银纳米簇和杂交链式反应的miRNA检测方法，其特征在于，包括：将捕获探针、结合有信号探针的银纳米簇及辅助探针加入到待测液中反应后，通过比较结合有信号探针的银纳米簇在反应前后的荧光强度，实现对目标miRNA的定量检测；
其中，捕获探针被设置为能够特异性捕获目标miRNA；
信号探针被设置为当捕获探针特异性捕获目标miRNA后，其DNA结构在辅助探针存在条件下被改变，从而使得结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色；
所述捕获探针具有第一特定结构；
所述信号探针具有第二特定结构；
所述捕获探针被设置为当其捕获目标miRNA后，所述第一特定结构被改变，并游离出特定单链；
所述信号探针被设置为所述第二特定结构能够与游离出的特定单链反应，并在辅助探针的存在下，触发杂交链式反应，导致信号探针的DNA结构被改变，使结合有信号探针的银纳米簇的荧光发生变色；
所述第一特定结构为颈环结构；
所述第二特定结构为颈环结构；
当目标miRNA为miR-17-5p时，捕获探针的序列为：AATCCCAATCCCAATCCCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGGGGATTGG GATT；辅助探针的序列为：GGGATTGGGATTGGGATTGTGATGAATCCCAATCCC；
当目标miRNA为miR-17-5p时，信号探针的序列为：CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTTAATCCCAATCCCAATCCCGGGATTGGGAT TCATCACAAAAAAACCCCCTAATTCCCCC。
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