CN114199816B - 基于近红外光激发检测生物标志物的光热传感器及其制备方法、在标志物检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于近红外光激发检测生物标志物的光热传感器，它包括N条通道以及分别位于通道两端的试样垫和吸水垫；所述通道为线条状基底；所述试样垫负载有至少一种光热试剂；试样垫用于滴加待测液；吸水垫用于提供待测液沿通道向吸水垫流动的毛细作用力；光热试剂为包含检测探针的硫化铜纳米线；所述线条状基底中修饰有捕获探针的区域为目标物检测区域；所述光热传感器检测的目标物是能与线条状基底中的捕获探针以及硫化铜纳米线中的检测探针发生结合反应形成三明治结构的生物标志物。本发明提出的光热传感器具有操作简单、分析时间短、检测成本低、便携、灵敏度高、可同时定量检测多种目标物等优点，在生物检测中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物传感与生物化学分析领域，具体涉及一种近红外光激发的光热传感器的构建及其在一种或多种生物标志物同时检测中的应用。
背景技术
随着经济能力与生活水平的提高，健康已成为人们追求高质量生活最关心的问题。一些生物标志物如细胞、分子、基因、酶、激素等的变化往往能反应身体健康状况，因此，通过对特定生物标志物的检测有助于疾病的早期诊断。然而，一种疾病的发生往往伴随着多种生物标志物含量的变化。因此，通过分析单一生物标志物难以实现疾病的准确诊断，急需发展能同时检测多种生物标志物的分析方法。
目前，已经建立了许多疾病标志物的检测方法，如病理组织活检、核磁共振成像、电子计算机断层扫描、酶联免疫吸附试验以及质谱技术等。这些检测方法虽然具有较高的灵敏度和准确性，然而，这些检测方法大多需要复杂的处理步骤、昂贵的仪器以及专业的技术人员，限制了其在即时检测领域中的应用。因此，发展新的简单、便携、灵敏、经济的分析方法在疾病诊断领域具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种近红外光激发的光热传感器的构建及其在多种生物标志物同时检测中的应用。本发明以生物标志物miRNA为例，以棉线基底为例，构建以温度信号作为输出信号检测生物标志物的光热传感器，可以实现多种miRNA的即时定量检测，检测结果准确可靠。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种基于近红外光激发检测生物标志物的光热传感器，包括N条通道以及分别位于通道两端的试样垫和吸水垫，N为大于等于1的整数；
所述试样垫负载有光热试剂，设置于通道的一端；吸水垫设置于通道的另一端；试样垫用于滴加待测液；吸水垫用于提供待测液沿通道向吸水垫流动的毛细作用力；
所述光热试剂为连接有检测探针(detection DNA)的硫化铜纳米线；所述通道为修饰有捕获探针(capture DNA)的线条状基底；所述光热传感器检测的目标物是能与线条状基底中的capture DNA以及硫化铜纳米线中的detection DNA发生结合反应形成三明治结构的生物标志物。
按上述方案，所述试样垫采用玻璃纤维等低吸附性的材料；吸水垫采用吸水纸等吸水材料；线条状基底采用丝光棉线等具有亲水性的材料。
按上述方案，检测目标物不限于miRNA，其他目标物如蛋白、小分子等，能与线条状基底中的capture DNA以及硫化铜纳米线中的detection DNA发生结合反应形成三明治结构的生物标志物，均在本发明检测目标物的范围内。
本发明还提供一种基于光热传感器快速检测生物标志物的方法，主要包括如下步骤：
(1)利用酰胺化反应，将报告探针(report DNA)连接到巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒上，得到硫化铜-report DNA复合物；
(2)通过detection DNA引发H1、H2发生杂交链式反应形成DNA纳米线，然后通过碱基互补配对将步骤(1)所得硫化铜-report DNA复合物固定在DNA纳米线上，从而得到包含检测探针的硫化铜纳米线，即为光热试剂；所述光热试剂滴加到试剂垫中，干燥备用；
(3)将修饰有生物素的capture DNA与链霉亲和素在缓冲溶液中反应，得到链霉亲和素-capture DNA复合物的溶液，所得溶液浸润线条状基底(可选择基底的中间部位如1/3～2/3处浸润，后续该浸润部位就是检测区域)，干燥后得到修饰有capture DNA的线条状基底；其中，线条状基底的浸润区域即为检测区域；
(4)将线条状基底的两端分别放置并固定连接试样垫和吸水垫，当目标物待测液滴加到试样垫，目标物与试样垫中硫化铜纳米线中的detection DNA发生杂交，并沿线条状基底朝吸水垫方向流动，当流经检测区时，目标物中未与detection DNA杂交部分进一步与线条状基底中的capture DNA杂交形成三明治结构，从而使硫化铜纳米线在检测区域富集；
(5)在近红外光激发下，富集在检测区域的硫化铜纳米线将光能转换为热能，检测区的温度升高，以待测液中目标物的对数浓度为横坐标，检测区域内的温度变化值为纵坐标，采用标准曲线法实现对目标物的定量分析。
按上述方案，巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒在近红外区(780～1200nm)有光谱吸收，形貌为球形，粒径为3～4nm，颗粒表面带有羧基。
按上述方案，报告探针report DNA与发夹探针H1，H2的DNA序列存着碱基互补配对关系，并且含有氨基。
按上述方案，步骤(1)中，report DNA的序列为：5’-TTGACAGATG/NH2-3’；每毫克巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒投加4～6nmol报告探针进行反应，反应温度为25～40℃，反应时间为2～5小时，反应溶液为PBS缓冲溶液。
按上述方案，步骤(1)中所述巯基乙酸稳定的硫化铜表面羧基用EDC及NHS在缓冲液(pH 5～7)中激活。激活反应体系中，EDC与NHS的质量浓度比为2:1，EDC、巯基乙酸稳定的硫化铜在激活反应体系中的浓度范围分别为8～15mg/mL、0.2～0.3mg/mL，反应时间20～40min。
按上述方案，步骤(2)中，detection DNA、H1、H2以摩尔比0.5：1：1在杂交缓冲液(10mM tris-HCl,0.5M NaCl,1mM MgCl2)中混合，在25～40℃，反应2～4h；H1和H2的核酸序列分别为：5’-CATCTGTCAACCATCACCTGCTTTTTTCAGGTGATTAGCGTT-3’和5’-CATCTGTCAACCAAAAAAGCAGGTGATAACGCTAATCACCTG-3’。
按上述方案，步骤(2)中，步骤(1)所得硫化铜-report DNA复合物与DNA纳米线在杂交缓冲液(10mM tris-HCl,0.5M NaCl,1mM MgCl2)中，在25～40℃，反应0.5～2h；每纳摩尔DNA纳米线投加0.4～0.8mg硫化铜-report DNA复合物。
按上述方案，步骤(3)中，修饰有生物素的capture DNA与链霉亲和素在PBS溶液环境中，25～40℃，反应30min～2h；每毫克链霉亲和素加入60～150nmol捕获探针。
按上述方案，步骤(4)中，待测液中目标物的含量是不确定的，而且杂交效率一般不能达到百分之百，所以capture DNA及detection DNA的用量相对目标物要过量一些，以保证目标物反应完全。
按上述方案，所述线条状基底为N个，N为大于等于1的整数；所述不同线条状基底上修饰的捕获探针相同或者不同，每个线条状基底上修饰一种capture DNA(每个线条状基底上一般修饰一种capture DNA，修饰多个capture DNA理论上是可行的。但考虑到实际应用中线条状基底的长度有限，不同链霉亲和素-capture DNA复合物的溶液浸润基底时可能存在界线不清晰的情况，所以，一般每个线条状基底上滴加一种链霉亲和素-capture DNA复合物的溶液，然后采用多个线条状基底修饰不同的capture DNA来构建多个检测通道)。其中，capture DNA的序列为：5’-Biotin/TTTTCACAAATTCGG-3’时，detection DNA的序列为：5’-TCTACAGGGTAAACGCTAATCACCTG-3’；或者，capture DNA的序列为：5’-Biotin/TTTTGCGGAACTTA-3’，detection DNA的序列为：5’-CCACTGTGAAAACGCTAATCACCTG-3’；或者，capture DNA的序列为：5’-Biotin/TTTTAACTATACAAC-3’，detection DNA的序列为：5’-CTACTACCTCAAACGCTAATCACCTG-3’。
按上述方案，步骤(5)中，激发所用的近红外光波长范围为780～1200nm，功率为1～2W/cm2，对检测区的照射时间为5～60s。
本发明以棉线基底为例构建多通道光热传感器，以温度作为输出信号，实现多种目标物比如miRNA的同时、定量、灵敏、即时检测。如图1所示，本发明通过detection DNA引发H1、H2发生杂交链式反应形成DNA纳米线，随后通过碱基互补配对将修饰了report DNA的硫化铜纳米颗粒固定在DNA纳米线上形成硫化铜纳米线，并将硫化铜纳米线固定在试样垫中。随后，将修饰了不同捕获探针的多条棉线(实施例中为3条)的前端放置试样垫，末端放置吸水垫用于提供毛细作用力。当存在目标物如miRNA时，miRNA与相应的capture DNA，硫化铜纳米线中的detection DNA发生杂交形成三明治结构，从而使硫化铜纳米线在检测区域富集，然后在近红外光激发下，硫化铜纳米线能高效地将光能转换为热能，使检测区的温度升高，从而将目标物的浓度转化为温度信号，利用便携式红外热成像仪对检测区的温度进行监测即可实现目标物的定量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明构建了基于棉线等线状亲水性基底的多通道光热传感器，针对不同的目标物，设计相应的捕获探针及检测探针，将不同的捕获探针固定在不同的通道以及在试样垫负载相对应的包含检测探针的硫化铜纳米线，目标物通过与对应的检测探针及捕获探针在相应的通道发生结合反应形成三明治结构，可实现多种目标物的同时检测以及快速定量分析，简便快捷准确地为疾病的诊断提供更为充分、可信的信息；同时棉线等作为天然的流体通道克服了纸基等材料作为检测基底需要复杂的通道设计与构建等缺点。
2.本发明以温度作为输出信号，通过便携式红外热成像仪即可实现目标物的定量即时检测。该方法具有较高的灵敏度，且具有设备简单、便携、操作简单等优点，避免了大型仪器设备的使用和专业操作人员的需求，为疾病的即时定量检测提供了一种新方法。
附图说明
图1为基于棉线的多通道光热传感器同时检测多种miRNA的原理图。
图2为巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒的XRD图谱。
图3为硫化铜纳米线的光热效果图以及光热稳定性图。
图4为便携式红外热成像仪拍摄的不同浓度miRNA响应的热成像图及相应的标准曲线。
图5为选择性实验图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但是不能以此限制本发明的范围。
下述实施例中，试样垫为直径2厘米的玻璃纤维圆片；吸水垫为吸水纸，为边长1厘米的正方片；线条状基底采用丝光棉线，长度6厘米。
下述实施例中，以直径为12cm的聚乳酸圆盘作为衬底，该衬底中心是底面直径为2cm的圆柱，最外侧是宽度为1cm的圆环并与中心圆柱等高。中心圆柱用于放置并固定试样垫，多条棉线的前端与试样垫固定连接；多条棉线的末端分别以120°的夹角固定于圆环上，并且多条棉线的末端与吸水垫固定连接。
下述实施例中，近红外激光的波长为808nm，输出功率为1.3W/cm2，光照时间为5s。
下述实施例中，以miRNA作为待检测的生物标志物，即目标物。
下述实施例中，report DNA、detection DNA、H1、H2、链霉亲和素、生物素修饰的capture DNA都是以溶液形式加入的，均采用超纯水配制。
实施例
1、巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒的合成：
将15μL巯基乙酸加入到10mL 2mM Cu(NO3)2溶液中，用0.5M NaOH溶液将pH调至9.0。搅拌30min后，向混合物中滴加Na2S溶液(10mL 6.7mM)，继续搅拌直至溶液变为绿色。
反应完成后，将溶液转移至超滤管(Millipore-10KD)中离心洗涤，所得巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒用超纯水定量至2.5mL，浓度约2mg/mL，4℃下保存备用。
所制得巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒在近红外区(780～1200nm)有光谱吸收，形貌为球形，粒径为3～4nm，颗粒表面带有羧基。
所制得巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒的XRD图谱如图2所示。
2、硫化铜-report DNA复合物的制备：
取100μL上述硫化铜溶液(2mg/mL)加入到500μL PBS(10mM，pH 6.8)中混合均匀。称取10mg EDC和5mg NHS，分别用200μL MES(10mM，pH 5.5)溶解，然后将其迅速加入上述溶液中，反应30min。将产物用PBS(10mM，pH 7.2)离心洗涤两次后，重新分散于1mL PBS(10mM，pH 7.2)中，加入10μL 100μM report DNA，混合均匀后反应4h。反应完成后将产物硫化铜-report DNA复合物离心去除上清，并将沉淀重新分散于100μL含0.6％Tween-20的缓冲溶液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，2mM MgCl2)中，使得最终浓度为2mg/mL，并置于4℃备用。
本步骤中，report DNA：5’-TTGACAGATG/NH2-3’。
3、包含检测探针的硫化铜纳米线的制备：
取1μL 100μM detection DNA，2μL 100μM H1和2μL 100μM H2于5μL缓冲溶液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，2mM MgCl2)中混合均匀，37℃反应4h形成DNA纳米线0.1nmol。反应完成后，往上述体系中继续加入60μL含0.2％Tween-20的缓冲溶液(20mM Tris-HCl，1MNaCl，2mM MgCl2)以及30μL的硫化铜-report DNA复合物溶液，混合均匀后，37℃反应1h，得到包含detection DNA的硫化铜纳米线。
本步骤制备的硫化铜纳米线具有良好的光热转化能力(图3A)。当用808nm激光，2W/cm2的激光分别对1mL水及硫化铜纳米线(0.6mg/mL)照射10min，硫化铜纳米链溶液温度可升至52.3℃，而水的温度只升高到35.2℃。
本步骤制备的硫化铜纳米线具有良好的光热稳定性(图3B)。当用808nm激光，2W/cm2的激光对1mL硫化铜纳米线(0.6mg/mL)照射10min，随后冷却至室温，该过程循环5次，在这5次循环中，可得到相似的结果。
本步骤中，detection DNA采用了detection DNA-10b、detection DNA-27a、detection DNA-miRNA-let-7a三种，分别制备了三种包含detection DNA的硫化铜纳米线，即三种包含不同detection DNA序列的光热试剂。后续混合滴加于试样垫中。
detection DNA-10b：5’-TCTACAGGGTAAACGCTAATCACCTG-3’；
detection DNA-27a：5’-CCACTGTGAAAACGCTAATCACCTG-3’；
detection DNA-miRNA-let-7a：5’-CTACTACCTCAAACGCTAATCACCTG-3’。
另外H1：5’-CATCTGTCAACCATCACCTGCTTTTTTCAGGTGATTAGCGTT-3’；H2：5’-CATCTGTCAACCAAAAAAGCAGGTGATAACGCTAATCACCTG-3’。
4、链霉亲和素-capture DNA复合物的制备及固定：
首先，将20μL 2.5mg/mL的链霉亲和素加入到50μL 100μM生物素修饰的captureDNA(分别采用capture DNA-10b、capture DNA-27a、capture DNA-miRNA-let-7a)中，并在37℃条件下反应1h。反应完成后，在该溶液中加入一定量10mM pH 7.4的PBS溶液，随即转移至超滤管(Millipore-30KD)中离心洗涤三次，除去未反应的捕获探针。最后收集超滤管中溶液并用PBS溶液定容为100μL，即为链霉亲和素-capture DNA复合物溶液。
将棉线用等离子清洗机处理5min，以去除棉线表面污渍，同时增加其亲水性，随后将上述制备好的链霉亲和素-capture DNA复合物溶液滴加于棉线约2/3处，每次滴加0.2μL，待其干燥后，再次滴加，该过程重复八次，最后一次滴加0.1μL，最终固定1.5μL的链霉亲和素-capture DNA复合物溶液于棉线上。
本步骤中，采用了三根棉线，每一根棉线作为一个通道，分别负载的捕获探针如下：
capture DNA-10b：5’-Biotin/TTTTCACAAATTCGG-3’；
capture DNA-27a：5’-Biotin/TTTTGCGGAACTTA-3’；
capture DNA-miRNA-let-7a：5’-Biotin/TTTTAACTATACAAC-3’。
5、检测装置的制备和光热传感器的构建：
该检测装置的衬底是直径为12cm的圆盘，其中心是底面直径为2cm的圆柱，最外侧是宽度为1cm的圆环并与中心圆柱等高。三根固定了链霉亲和素-capture DNA复合物的棉线的前端固定在中心圆柱上，棉线末端则分别以120°的夹角固定在圆环上。试样垫(直径为2cm的圆)在使用之前用缓冲溶液(含150mM NaCl和0.25％Triton X-100的Tris-HCl溶液(20mM，pH＝8.0))浸泡十分钟并干燥后使用。将步骤3中的硫化铜纳米线(即三种包含不同detection DNA的光热试剂)滴加于处理后的试样垫上，每种硫化铜纳米线分别滴加30μL，待其干燥后，将其放置于中心圆柱，在棉线的末端放置吸水垫(10mm×10mm)作为动力装置。
上述三根固定了链霉亲和素-capture DNA复合物的棉线和分别位于这三根棉线两端的试样垫和吸水垫，共同构成本发明所述基于近红外光激发检测生物标记物的光热传感器。
6、标准曲线的构建：
将90μL含一定量目标miRNA-10b、miRNA-27a和miRNA-let-7a的试样溶液(浓度分别为0nM，0.05nM，0.1nM，0.5nM，5nM，10nM，50nM)滴加于试样垫，反应一段时间后，在试样垫上滴加150μL含0.3％Tween-20的缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM MgCl2)，对棉线进行冲洗，该过程重复两遍。待棉线干燥后，用808nm激光照射棉线检测区，并用便携式红外热成像仪记录温度变化，根据升高的温度值与目标miRNA对数浓度的关系作图得到标准曲线(图4)，并根据标准曲线计算miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-let-7a的线性回归方程分别为△T＝4.90lgC+11.12；△T＝5.08lgC+11.79；△T＝4.76lgC+10.84；(△T为与初始温度相比升高的温度值，C为目标miRNA的浓度)，线性相关系数分别为R2＝0.9995；R2＝0.9969；R2＝0.9958。
7、选择性实验：
使用空白组、miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-let-7a以及这三种目标物的混合溶液来验证该光热传感器的选择性，其浓度均为50nM。检测条件与建立标准曲线的条件相同。
如图5所示，对于miRNA-10b通道，只有当miRNA-10b存在时，温度才显著升高，而非互补的miRNA信号与空白组相似。对于miRNA-27a和miRNA-let-7a通道，具有相同结果。
此外，还对miRNA-10b、miRNA-27a和miRNA-let-7a的单碱基错配、双碱基错配、三碱基错配的miRNA进行了研究，如图5所示，只有在目标miRNA存在的情况下，温度才会有显著的升高。这些结果表明，该光热传感器对目标的检测具有良好的选择性。
其中所涉及序列如下：
miRNA-10b：5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’；
miRNA-10b单碱基错配：5’-UACCCUGUAGAACCGAAUGUGUG-3’；
miRNA-10b双碱基错配：5’-UACCUUGUAGAACCGAAUGUGUG-3’；
miRNA-10b三碱基错配：5’-UACCUUGUCGAACCGAAUGUGUG-3’；
miRNA-27a：5’-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3’；
miRNA-27a单碱基错配：5’-UUCACAGUGGCUAAGUGCCGC-3’；
miRNA-27a双碱基错配：5’-UUCAUAGUGGCUAAGUGCCGC-3’；
miRNA-27a三碱基错配：5’-UUCAUAGUAGCUAAGUGCCGC-3’；
miRNA-let-7a：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；
miRNA-let-7a单碱基错配：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAGAGUU-3’；
miRNA-let-7a双碱基错配：5’-UGAGUUAGUAGGUUGUAGAGUU-3’；
miRNA-let-7a三碱基错配：5’-UGAGUUAGAAGGUUGUAGAGUU-3’。
8、血清中目标miRNA测定：将血清稀释十倍，并加入不同浓度的目标物miRNA(分别为miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-let-7a三种目标物)，包括0.5nM，5nM，10nM。检测条件与建立标准曲线的条件相同。根据检测区测得的温度变化及构建的标准曲线计算待测样本中目标物的含量。
如表1所示，对于含不同浓度的目标物miRNA的血清样品，本发明建立的检测方法在血清中的检测结果的准确率在93.2％-103.6％，多次检测结果间的相对标准偏差小于5.5％，表明本发明建立的传感方法具有良好的抗干扰能力、准确性及稳定性。
表1血清样品中miRNA加标回收试验
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。
＜110＞湖北大学
＜120＞一种基于近红外光激发检测生物标志物的光热传感器及其制备方法、在标志物检测中的应用
＜160＞9
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>1
ttgacagatg 10
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>2
catctgtcaa ccatcacctg cttttttcag gtgattagcg tt 42
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>3
catctgtcaa ccaaaaaagc aggtgataac gctaatcacc tg 42
<210>4
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>4
ttttcacaaa ttcgg 15
<210>5
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<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>5
ttttgcggaa ctta 14
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>6
ttttaactat acaac 15
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<212>DNA
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<400>7
tctacagggt aaacgctaat cacctg 26
<210>8
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<213>artificial sequence
<400>8
ccactgtgaa aacgctaatc acctg 25
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>9
ctactacctc aaacgctaat cacctg 26
Claims (10)
1.一种基于近红外光激发检测生物标志物的光热传感器，其特征在于，它包括N条通道以及分别位于通道两端的试样垫和吸水垫，N为大于等于1的整数；所述通道为线条状基底，修饰有捕获探针；
所述试样垫负载有至少一种光热试剂，与通道的一端相连接；吸水垫连接通道的另一端；试样垫用于滴加待测液；吸水垫用于提供待测液沿通道向吸水垫流动的毛细作用力；线条状基底采用具有亲水性能的线状材料；
光热试剂为包含检测探针的硫化铜纳米线，所述光热试剂通过检测探针引发发夹探针H1、H2发生杂交链式反应形成DNA纳米线，然后通过碱基互补配对将硫化铜-报告探针复合物固定在DNA纳米线上，从而得到包含检测探针的硫化铜纳米线，即为光热试剂；
所述线条状基底中修饰有捕获探针的区域为目标物检测区域；所述光热传感器检测的目标物是能与线条状基底中的捕获探针以及硫化铜纳米线中的检测探针发生结合反应形成三明治结构的生物标志物。
2.根据权利要求1所述的光热传感器，其特征在于试样垫采用玻璃纤维，吸水垫采用吸水纸。
3.一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
（1）利用酰胺化反应，将报告探针连接到巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒上，得到硫化铜-报告探针复合物；
（2）通过检测探针引发发夹探针H1、H2发生杂交链式反应形成DNA纳米线，然后通过碱基互补配对将步骤（1）所得硫化铜-报告探针复合物固定在DNA纳米线上，从而得到包含检测探针的硫化铜纳米线，即为光热试剂；所述光热试剂滴加到试样垫中，干燥备用；
（3）将修饰有生物素的捕获探针与链霉亲和素反应后，得到链霉亲和素-捕获探针复合物溶液；然后用所述链霉亲和素-捕获探针复合物溶液浸润线条状基底，干燥后得到修饰有捕获探针的线条状基底；其中，线条状基底的浸润区域即为检测区域；
（4）将线条状基底的两端分别连接试样垫和吸水垫，当含目标物的待测液滴加到试样垫，目标物与试样垫中硫化铜纳米线上的检测探针发生杂交，并沿线条状基底朝吸水垫方向流动，当流经检测区时，目标物中未与检测探针杂交部分与线条状基底上的捕获探针杂交形成三明治结构，从而使硫化铜纳米线在检测区域富集；
（5）在近红外光激发下，将富集在检测区域的硫化铜纳米线的光能转换为热能，检测区的温度升高，以目标物待测液中目标物的对数浓度为横坐标，检测区的温度变化值为纵坐标，采用标准曲线法实现对待测液中目标物的定量分析。
4.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于所述报告探针与发夹探针H1，H2的DNA序列存着碱基互补配对关系，并且含有氨基。
5.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于步骤（1）中，报告探针的DNA序列为：5’-TTGACAGATG/NH2-3’；所述巯基乙酸稳定的硫化铜使用前表面羧基用EDC及NHS激活；每毫克巯基乙酸稳定的硫化铜纳米颗粒投加4～6 nmol报告探针，反应温度为25～40 oC，反应溶液为PBS缓冲溶液。
6.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于步骤（2）中，检测探针、发夹探针H1、H2以摩尔比0.5：1：1在杂交缓冲液中混合，在25～40 oC，反应2～4 h；H1和H2的核酸序列分别为：5’-CATCTGTCAACCATCACCTGCTTTTTTCAGGTGATTAGCGTT-3’和5’-CATCTGTCAACCAAAAAAGCAGGTGATAACGCTAATCACCTG-3’。
7.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于步骤（2）中，步骤（1）所得硫化铜-报告探针复合物与DNA纳米线在杂交缓冲液中，25～40 oC，反应0.5～2 h；每纳摩尔DNA纳米线投加0.4～0.8 mg硫化铜-报告探针复合物。
8.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于步骤（3）中，修饰有生物素的捕获探针与链霉亲和素在PBS溶液中25～40 oC反应30 min～2 h；每毫克链霉亲和素加入60～150 nmol捕获探针。
9.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于所述线条状基底为N个，N为大于等于1的整数；不同线条状基底上修饰的捕获探针相同或者不同，每个线条状基底上修饰至少一种捕获探针；通过改变检测探针的DNA序列，可以得到不同的光热试剂，一种光热试剂对应一种捕获探针。
10.根据权利要求3所述的一种基于光热传感器快速检测目标物的方法，其特征在于所述修饰有生物素的捕获探针的DNA序列为：5’-Biotin/TTTTCACAAATTCGG-3’、 5’-Biotin/TTTTGCGGAACTTA-3’、 5’-Biotin/TTTTAACTATACAAC-3’中的一种，检测探针的DNA序列对应为：5’-TCTACAGGGTAAACGCTAATCACCTG-3’、 5’-CCACTGTGAAAACGCTAATCACCTG-3’、5’-CTACTACCTCAAACGCTAATCACCTG-3’中的一种。
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| CN114199816A (zh) | 2022-03-18 |
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