CN108642162A - 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108642162A
CN108642162A CN201810291290.8A CN201810291290A CN108642162A CN 108642162 A CN108642162 A CN 108642162A CN 201810291290 A CN201810291290 A CN 201810291290A CN 108642162 A CN108642162 A CN 108642162A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
polyhedron
nucleic acid
seq
extracellular vesica
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810291290.8A
Other languages
English (en)
Inventor
罗阳
刘炼华
贾玫
陈晓辉
张洪
邱晓沛
卿光超
刘春姣
王睿璇
周旋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing University
Original Assignee
Chongqing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing University filed Critical Chongqing University
Priority to CN201810291290.8A priority Critical patent/CN108642162A/zh
Publication of CN108642162A publication Critical patent/CN108642162A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针及其制备方法和应用，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团；该探针可快速、灵敏、特异检测胞外囊泡内多种核酸分子，可根据临床或研究检测需要对特定的靶标核酸分子进行设计应用。

Description

一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于医疗检测领域，涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸小分子的多面体探针，可快速、灵敏、特异检测已知序列的多种胞外囊泡核酸小分子；本发明还涉及多面体探针的制备方法和应用。
背景技术
胞外囊泡(EVs)是由肿瘤细胞等多种细胞分泌的、大小为50～1000nm的膜性囊泡小体，常存在于血液、尿液、脑脊液等大多数体液中。EVs可以携带多种胞内物质，如不同来源EVs可包含超过9700种蛋白质、3400种mRNA和2800种microRNA，在细胞间信号传递、肿瘤的发生与预后监测、免疫系统干预等生理病理活动中扮演了十分重要的角色。现有研究表明，受胞体体积的限制，特定来源的外泌体内miRNA浓度远高于其母体细胞内浓度，浓度富集效率甚至可高达166倍，导致少量miRNA可在外泌体内被检出而在循环系统中未能检出。同时，与循环系统中的游离miRNA相比，外泌体内的miRNA由于受囊泡脂质双层膜的保护因而具有更高的酶耐受性，可以在体液中长时间稳定存在，便于到达靶细胞进行稳定的信号转导从而发挥生物学效能。与循环miRNA相比，外泌体内miRNA水平变化更能反映机体内生理病理状态，因此可以作为一种新型的生物标志物，用以评进行疾病的早期诊断、治疗监控和预后评估。
EVs的纳米级结构和miRNA极短的核苷酸序列长度(～22nt)使得EVs内miRNA多重检测极为困难。常规检测组织细胞中miRNA的方法以RT-qPCR为金标准，其灵敏度高，但其cDNA合成、qPCR等步骤耗时耗力且相对昂贵，不适合大规模EVs内miRNA筛查；尽管NorthernBlotting和微阵列检测技术各有其优点，但其灵敏度均欠佳且无法原位检测。原位杂交(FISH)尽管可以实现细胞内miRNA在体检测，然而其较低的灵敏度亦限制了其对于低浓度靶分子的检出。电化学传感器技术结合锁核酸(LNA)技术可有效提升检测特异性，然而其灵敏度和重复性仍有待提高，且上述技术均无法实现EVs的在体直接检测。目前大量的检测方法都集中在miRNA提取后进行检测，而不同提取方法的miRNA提取效率差异极大，即便用数字PCR也无法反映出EVs内miRNA的真实丰度。
若能够实现EVs原位在体检测将能极大克服上述不一致问题，从而真实反映EVs内各种靶分子的丰度。为此，人们进行了如下探索：
Rhee et al曾尝试着利用溶血素O蛋白(Streptolysin O)对EVs胞膜打孔，导入分子信标探针(Molecular Beacon，MB)并进行EVs在体检测，研究发现溶血素O蛋白处理后的探针穿透效率较无处理样本提高了175％。但在胞膜上打孔的方法会潜在破坏EVs外膜，存在EVs内容物外漏的风险，从而导致最终的检测结果偏低。上述方法均缺乏对胞外囊泡完整性的保护，存在EVs内容物外漏的风险，从而可能导致最终的检测结果偏低，仍不能准确检测EVs miRNA。
因此，亟需一种不破坏胞外囊泡完整性的检测方法，能够准确检测EVs内如miRNA等小分子。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针；本发明的目的之二在于提供用于检测胞外囊泡miRNA的多面体探针的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述多面体探针在制备检测胞外囊泡内核酸分子的试剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。
该探针具有穿膜性能优，检测灵敏度更高的探针，该探针是结合了DNA多面体和分子信标的特点，组成了一个通过多面体穿膜后利用分子信标的特点实现特异性检测核酸的探针。
优选的，所述多面体为四面体、六面体或八面体；所述探针结构为茎环结构、三叶草结构、别针结构或者哑铃状结构。
优选的，所述多面体骨架合成原料为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸或锁核酸的一种或多种。
优选的，所述发光基团可为Cy3、Cy5、Cy5.5、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、量子点或碳量子点的任意一种；所述淬灭基团可为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、IOWA、Dabcyl中的任意一种，且其发光基团的发射光谱应该与淬灭基团的吸收光谱部分或者全部重叠。
优选的，所述多面体骨架由多条相互互补的双链及未配对单碱基构成。
优选的，待检胞外囊泡内的核酸分子在胞浆内游离存在，为游离cell-free DNA、RNA、microRNA或环状RNA。
优选的，所述探针结构与多面体骨架相对位置可旋转变化或者探针部分脱离多面体骨架。
2、所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针的制备方法，将修饰淬灭基团或淬灭基团的核酸单链加入单链自组装的离子缓冲液中，然后变性后进行退火使其自组装，形成多面体探针。
优选的，所述多面体为四面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.4所示，SEQ ID NO.1的5'端修饰淬灭基团；所述SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4的5'端修饰有荧光基团；
所述多面体为六面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.10所示，所述SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8的5'端修饰荧光基团，所述SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10的5'端修饰淬灭基团。
3、所述多面体探针在制备原位检测胞外囊泡核酸分子的试剂中的应用。
利用所述多面体探针检测胞外囊泡核酸分子的方法，包括如下步骤：将含有胞外囊泡的待测样品与该多面体探针共同孵育5-360分钟，然后在20-40℃环境下检测荧光强度。
检测时经过充分温育后，多面体探针通过穿膜作用进入样本中的胞外囊泡，在未与胞外囊泡内miRNA结合时多面体探针不会或只会有微弱的荧光被检测到，当多面体探针和胞外囊泡内miRNA结合时，多面体探针的茎环部分打开，茎环序列部分可完全或者部分与miRNA靶标序列互补，淬灭基团原理荧光基团，多面体探针会被检测到增强的荧光，从而实现特异性检测。
本发明的有益效果在于：本发明公开的多面体探针，使用核酸骨架的多面体，茎环探针，荧光基团，淬灭基团等，结构明确，易获得；制备方法简单，通过简单的加热和降温过程即可完成自组装；可以用于胞外囊泡核酸分子，特别是miRNA检测，且检测方法简单只需将样品与该多面体探针在反应孔中共同温育后，采用常规的荧光光谱仪即可得出结果，操作使用方便；还具有如下优点：(1)检测所需血量少，节约样本量，检测流程简单，检测时间缩短，有利于提高检测及筛查效率；(2)探针的茎环状部分序列可根据待测核酸分子(如：miRNA)序列进行设计改变，从而可用于所有已知核酸序列(如：miRNA)的特异性检测，该探针可以作为核酸分子(如：miRNA)检测模板应用于各类检测当中；(3)通过采取不同荧光探针和淬灭基团修饰及不同序列设计的茎环结构探针条可用于多种胞外囊泡核酸分子(如：miRNA)多重检测，这样可以同时针对同一样品中特定的核酸分子(如：miRNA)组合进行分析，通过不同激发波长分别检测不同核酸分子(如：miRNA)的荧光强度值，简化操作流程，实现一次加样，多个核酸分子(如：miRNA)同步检测；(4)检测条件温和，所检测的环境温度可为20-40℃，可以直接放于荧光光谱仪中进行温育检测，简化操作流程，缩短检测时间；(5)荧光强度检测结果通常通过常规光谱检测进行读数，后续可通过标准曲线自行转化为核酸分子(如：miRNA)浓度，实现核酸分子(如：miRNA)浓度自动化判读，以满足大量标本检测需求。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为四面体探针结构示意图。
图2为四面体组装和检测原理图。
图3为四面体探针荧光扫描检测检测不同浓度miR-21结果。
图4为探针检测靶标特异性判断示意图。
图5为六面体探针结构示意图。
图6为八面体探针结构示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、四面体探针的制备
合成4条单链核苷酸序列，具体如下：
第一链：(SEQ ID NO.1)；
第二链：(SEQ ID NO.2)；
第三链：(SEQ ID NO.3)；
第四链：(SEQ ID NO.4)；
上述序列中每条链相互互补的部分使用相同标注，互补序列长度为13bp，不互补的碱基为黑色标记，互补序列间间隔2nt，链前为1nt，并且第一链中黑体加粗无互补序列，形成茎环探针。
为了在检测时能够通过荧光检测，在第二链、第三链和第四链的5'端修饰荧光基团，并在第一条链的5'端修饰淬灭基团。
将合成的单链溶解于单链自组装的离子缓冲液，单链自组装的离子缓冲液配制方法如下：六水合氯化镁干粉2.033g，tris干粉0.121g，加纯水至总体积为200ml，调节pH值为8.0，用量优选为100μl。
四面体探针自组装条件：取等摩尔浓度配置好的四条单链自组装的离子缓冲液，将其在1.5ml EP管内震荡混匀通过金属浴锅95℃加热2min，随后放置在冰上冷却使其自组装，组装后直接使用或放于-20℃备用，组装后探针结构如图1所示，其组装原理如图2所示。
利用合成的四面体探针荧光扫描检测检测梯度稀释miR-21(10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、20nM、50nM、100nM)。检测条件如下：将四面体探针加入检测样本中检测样本中，使检测样本体积为20-200μl，优选为50μl，检测中四面体探针浓度为50～150nM，优选为100nM；然后在温度为20-40℃条件下反应25-60min，优选为在温度为37℃条件下反应30min，然后通过荧光光谱仪，酶标仪或者其他可以发出特定波长荧光并可以接受特定波长荧光的装置检测，选择激发波长635nm，发射波长670nm，在扣除背景荧光之后，分析mi RNA浓度与荧光强度值的关系(图3)。结果显示：各样品检测荧光强度与miRNA浓度呈正相关，同时对峰值荧光强度做线性分析，发现探针对1pM-10nM浓度范围内有良好的线性关系，计算得到的线性方程为：y＝1752.4+324.4x，其中y为荧光强度值，x为lgC，R2＝0.9956。经计算得到最低检测限(Limit of Detection,LOD)为45.4fM。
按照上述方法利用该探针检测同浓度miR-21、miR-27a、miR-375、let-7a和miR-122，结果显示：该探针对于miR-21检测具有较高的荧光强度值；其他miRNA检测样品则较低，与空白对照(NC)荧光强度值相近(P＞0.05)，说明该探针具有良好的特异性。
本实施例中，核苷酸链骨架以脱氧核糖核苷酸为原料，还可以为核糖核苷酸、肽核酸或锁核酸。本实施例中，探针荧光基团可以为Cy3、Cy5、Cy5.5、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素，优选为Cy5；探针淬灭基团可以为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、IOWA、Dabcyl，优选为BHQ-2；荧光基团与探针各单链通过化学法进行合成，通过羧基-氨基反应修饰在核苷酸链顶端修饰荧光基团和淬灭基团。
本实施例检测原理为：将待检测血样或者其它样品在反应孔中与多面体探针共同温育，经过充分温育后，多面体探针通过穿膜作用进入样本中的胞外囊泡，在未与胞外囊泡内miRNA结合时多面体探针不会或只会有微弱的荧光被检测到，当多面体探针和胞外囊泡内miRNA结合时，多面体探针的茎环部分打开，淬灭基团原理荧光基团，多面体探针会被检测到增强的荧光。
上述四面体探针也可以设计用于mRNA检测，以肿瘤相关的TK1mRNA为例，检测靶标部分序列为：5’-gggccatcct gaacctggtg ccgctggccg agagcgtggt-3’(SEQ ID NO.11)；
利用该四面体探针检测合成mRNA。结果显示：各样品检测荧光强度与miRNA浓度呈正相关，在1pM-50nM浓度范围内有良好的线性关系。经计算得到最低检测限(Limit ofDetection,LOD)为1.3pM。利用该探针检测同浓度mRNA和对照组，结果显示：该探针对于mRNA检测具有较高的荧光强度值，对照组检测样品则较低，说明该探针具有良好的特异性(图4)。
实施例2、六面体探针的制备
合成组装六面体探针的核苷酸序列，具体如下：
第一链1:(SEQ ID NO.5)；
第二链2:(SEQ ID NO.6)
第三链3:(SEQ ID NO.7)
第四链4:(SEQ ID NO.8)
第五链5:SEQID NO.9)
第六链6:SEQID NO.10)
六条链中每条链相互互补的部分使用相同标注，六面体的互补长度为20bp，不互补的碱基为黑色标记，为1nt；荧光基团修饰在第1、2、3、4链的5'端，每条链上修饰一个荧光基团；淬灭基团修饰在第5、6链的5'端，每条链上修饰一个淬灭基团。
然后将合成的单链按实施例1的方法自组装形成六面体探针，结构如图5所示。
利用该六面体探针荧光扫描检测检测梯度稀释miR-21。结果显示：各样品检测荧光强度与miRNA浓度呈正相关，同时对峰值荧光强度做线性分析，发现探针对1fM-10nM浓度范围内有良好的线性关系。经计算得到最低检测限(Limit of Detection,LOD)为20.4fM。利用该探针检测同浓度miR-21、miR-27a、miR-375、let-7a和miR-122，结果显示：该探针对于miR-21检测具有较高的荧光强度值；其他miRNA检测样品则较低，与空白对照(NC)荧光强度值相近(P＞0.05)，说明该探针具有良好的特异性。
按照相同的方法合成八面体探针，结构如图6所示。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagctttcaa catcagtctg ataagctaac cagtcaattg acagtgtagc aagctgagta 60
gtgtctaata g 71
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatgtg tgaaaccagc ttgctacacg agtcgagcag agtt 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcaattgac tggtcacact acgtgagtat gaactctgct cgac 44
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcacacat acgagctact cacgtagtgg actattagac acta 44
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcagttga gacgaacatt cctaagtctg aaatttatca cccgccatag tagacgtatc 60
acc 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgctacac gattcagact taggaatgtt cgacatgcga gggtccaata ccgacgatta 60
cag 63
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgataaaa cgtgtagcaa gctgtaatcg acgggaagag catgcccatc cactactatg 60
gcg 63
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgcgcggat gactcaactg cctggtgata cgatctagtc tctacgtcaa gtaagaacct 60
tag 63
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctcgcatga catccgcgca gctaaggttc aaagttcctg ccgcttcacg gacggtattg 60
gac 63
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcttcccga ccgtgaagcg gcaggaactt atacttgacg tagagactag aaggatgggc 60
atg 63
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggccatcct gaacctggtg ccgctggccg agagcgtggt 40

Claims (10)

1.一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。
2.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体为四面体、六面体或八面体；所述探针结构为茎环结构、三叶草结构、别针结构或者哑铃状结构。
3.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体骨架合成原料为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸或锁核酸的一种或多种。
4.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述发光基团为Cy3、Cy5、Cy5.5、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、量子点或碳量子点的任意一种；所述淬灭基团可为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、IOWA、Dabcyl中的任意一种，且其发光基团的发射光谱应该与淬灭基团的吸收光谱部分或者全部重叠。
5.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体骨架由多条相互互补的双链及未配对单碱基构成。
6.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：待检胞外囊泡内的核酸分子在胞浆内游离存在，为游离cell-free DNA、RNA、microRNA或环状RNA。
7.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述探针结构与多面体骨架相对位置可旋转变化或者探针部分脱离多面体骨架。
8.权利要求1～7任一项所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针的制备方法，其特征在于：将修饰淬灭基团或淬灭基团的核酸单链加入单链自组装的离子缓冲液中，然后变性后进行退火使其自组装形成多面体探针。
9.权利要求1～7任一项所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针的制备方法，其特征在于：所述多面体为四面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQID NO.4所示，SEQ ID NO.1的5'端修饰淬灭基团；所述SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4的5'端修饰有荧光基团；
所述多面体为六面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.10所示，所述SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8的5'端修饰荧光基团，所述SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的5'端修饰淬灭基团。
10.权利要求1～7任一项所述多面体探针在制备原位无损检测胞外囊泡核酸分子的试剂中的应用。
CN201810291290.8A 2018-03-30 2018-03-30 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用 Pending CN108642162A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810291290.8A CN108642162A (zh) 2018-03-30 2018-03-30 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810291290.8A CN108642162A (zh) 2018-03-30 2018-03-30 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108642162A true CN108642162A (zh) 2018-10-12

Family

ID=63745134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810291290.8A Pending CN108642162A (zh) 2018-03-30 2018-03-30 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108642162A (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109295205A (zh) * 2018-10-17 2019-02-01 南京宁贝欣医疗科技有限公司 一种可以快速同时检测多种miR的方法
CN110128543A (zh) * 2019-04-01 2019-08-16 上海交通大学 一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途
CN111443211A (zh) * 2020-03-04 2020-07-24 重庆大学 一种多血型系统自动检测卡及检测方法
US20200347360A1 (en) * 2018-01-17 2020-11-05 Tokyo Institute Of Technology Method for producing exosomes and exosomes obtained thereby
CN111909932A (zh) * 2020-07-17 2020-11-10 南方医科大学 一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用
CN112680504A (zh) * 2020-12-04 2021-04-20 南京大学 一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法
CN113088558A (zh) * 2021-04-15 2021-07-09 重庆医科大学 一种检测dna甲基化转移酶的荧光生物传感器及其制备与应用
CN114144530A (zh) * 2019-05-28 2022-03-04 蛋白科技先锋 用于核酸检测的多价核酸纳米结构和使用其的高度灵敏的核酸探针
CN114574553A (zh) * 2021-12-31 2022-06-03 南京医科大学第二附属医院 一种碳点-纳米金球形核酸及其制备方法和应用
CN116121399A (zh) * 2022-12-05 2023-05-16 南京理工大学 一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007045890A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Primerdesign Ltd Probe
CN102154276A (zh) * 2011-02-28 2011-08-17 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种断端对接式发夹型dna探针
CN103243154A (zh) * 2011-02-28 2013-08-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种断端对接式发夹型dna探针构建方法
CN104651491A (zh) * 2014-12-23 2015-05-27 中国科学院上海高等研究院 一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用
CN107267657A (zh) * 2017-08-15 2017-10-20 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 检测靶核酸序列的引物、荧光探针及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007045890A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Primerdesign Ltd Probe
CN102154276A (zh) * 2011-02-28 2011-08-17 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种断端对接式发夹型dna探针
CN103243154A (zh) * 2011-02-28 2013-08-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种断端对接式发夹型dna探针构建方法
CN104651491A (zh) * 2014-12-23 2015-05-27 中国科学院上海高等研究院 一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用
CN107267657A (zh) * 2017-08-15 2017-10-20 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 检测靶核酸序列的引物、荧光探针及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨立敏等: "纳米荧光探针用于核酸分子的检测及成像研究", 《化学学报》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11773377B2 (en) * 2018-01-17 2023-10-03 Tokyo Institute Of Technology Method for producing exosomes and exosomes obtained thereby
US20200347360A1 (en) * 2018-01-17 2020-11-05 Tokyo Institute Of Technology Method for producing exosomes and exosomes obtained thereby
CN109295205A (zh) * 2018-10-17 2019-02-01 南京宁贝欣医疗科技有限公司 一种可以快速同时检测多种miR的方法
CN110128543A (zh) * 2019-04-01 2019-08-16 上海交通大学 一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途
CN114144530A (zh) * 2019-05-28 2022-03-04 蛋白科技先锋 用于核酸检测的多价核酸纳米结构和使用其的高度灵敏的核酸探针
CN111443211A (zh) * 2020-03-04 2020-07-24 重庆大学 一种多血型系统自动检测卡及检测方法
CN111443211B (zh) * 2020-03-04 2024-01-26 重庆大学 一种多血型系统自动检测卡及检测方法
CN111909932A (zh) * 2020-07-17 2020-11-10 南方医科大学 一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用
CN112680504A (zh) * 2020-12-04 2021-04-20 南京大学 一种外泌体内多种miRNA特异性检测方法
CN113088558A (zh) * 2021-04-15 2021-07-09 重庆医科大学 一种检测dna甲基化转移酶的荧光生物传感器及其制备与应用
CN113088558B (zh) * 2021-04-15 2023-10-13 重庆医科大学 一种检测dna甲基化转移酶的荧光生物传感器及其制备与应用
CN114574553A (zh) * 2021-12-31 2022-06-03 南京医科大学第二附属医院 一种碳点-纳米金球形核酸及其制备方法和应用
CN116121399A (zh) * 2022-12-05 2023-05-16 南京理工大学 一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108642162A (zh) 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用
CN109897887B (zh) 基于fret的端粒酶活性检测方法
CN105525010B (zh) 一种茎环结构组合探针及其应用
CN107868815A (zh) 减少由数字聚合酶链式反应中的反应体积偏差引起的定量误差的方法
CN110218818B (zh) 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法
CN113481286B (zh) 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒
CN108192948A (zh) 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法
US20020051981A1 (en) Methods for assay and detection on a microarray
CN107513568A (zh) 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
CN110225919A (zh) 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸
Zhang et al. Resettable and enzyme-free molecular logic devices for the intelligent amplification detection of multiple miRNAs via catalyzed hairpin assembly
CN107858358A (zh) 一种能够识别并结合溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体及其应用
CN109913565A (zh) 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法
KR20210040791A (ko) 핵산 검출 시스템
CN114350670B (zh) 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用
CN101603077A (zh) 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法
Ma et al. Rapid detection of Aeromonas hydrophila with a DNAzyme-based sensor
CN101434993A (zh) 角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法
CN110229872A (zh) 一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法
CN107299129A (zh) 循环核酸作为乳腺癌生物标志物的应用
Lan et al. A photoluminescent biosensor based on long-range self-assembled DNA cascades and upconversion nanoparticles for the detection of breast cancer-associated circulating microRNA in serum samples
CN107937404A (zh) 一种核酸适配体及其在识别、检测溶藻弧菌中的应用
CN108646014B (zh) 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法
CN106841156A (zh) 一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法
CN111876470A (zh) 一种脂质体-dna复合体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181012

RJ01 Rejection of invention patent application after publication