CN114144530A - 用于核酸检测的多价核酸纳米结构和使用其的高度灵敏的核酸探针 - Google Patents
用于核酸检测的多价核酸纳米结构和使用其的高度灵敏的核酸探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于提高核酸生物标志物的检测效率的核酸探针系统，并且通过用于将单链探针序列整合到核酸纳米结构中的方法改进了生物标志物的检测效率和检测灵敏度。本发明的为此开发的核酸纳米结构通过探针序列的局部聚集将根据简单扩散的分子之间的一些碰撞/反应步骤转化为所述结构内部的快速反应，通过结构柔性激活所述结构中的快速信号放大机制，以便改进检测能力，从而具有改进检测能力和有效降低检测限的作用。
Description
技术领域
本发明涉及用于提高核酸生物标志物的检测效率的核酸探针系统，具体地涉及通过将单链探针序列整合到核酸纳米结构中的方法而实现的对生物标志物的检测效率和检测灵敏度的改进。
背景技术
检测特定核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方法是科学研究领域的至关重要的技术。由于能够检测和鉴定特定的核酸或蛋白质，研究人员已经能够确定哪些遗传或生物标志物指示人的健康状况。检测核酸和蛋白质的方法使得能够检测样品中存在的致病基因的修饰或特定基因的表达。这种分子诊断用于诊断疾病的根本原因，如DNA或RNA，并且应用于各种领域，如与感染性疾病、癌症诊断、遗传疾病和个性化诊断有关的领域。分子诊断技术通常以在短时间内扩增DNA的PCR技术为范例(Saiki R.等人,Science 239:487-91.,1998)。然而，一般的PCR技术必须使用电泳方法以便鉴定扩增的DNA。在这里，使用电泳鉴定DNA很麻烦，因为必须制作琼脂糖凝胶，DNA必须用EtBr染色等等。另外，最近使用的实时PCR方法不需要电泳，因为它使用荧光，但是存在必须使用昂贵的仪器和昂贵的荧光试剂的问题(HiguchiR.等人,Nature Biotechnology 11:1026-1030,1993)。最近，已经开发和销售作为用于即时使用的PCR产品的Cepheid的GeneXpert系统和试剂，但是其在一般测试中的使用很难，因为系统和试剂非常昂贵(Helb D.等人,J.Clin.Microbiol.48:229-237,2010)。另一种鉴定方法是核酸侧流测定，其在PCR后使用膜代替凝胶电泳(Aveyard J.等人,Chem.Commun.,41:4251-4253,2007)。然而，此方法与凝胶电泳技术相比要复杂，所以其在实验室中的制造和使用变得不可能，并且由于必须使用附着到膜上的探针的序列以便与PCR扩增产物特异性结合的技术限制，其一般使用受到限制。特别地，基于PCR的此测序方法极易出现特定错误，并且存在与数据解释相关的问题，限制了核酸和蛋白质检测的精确度和灵敏度。
从细胞、组织或血液中分离和纯化的用于临床诊断目的的核酸生物标志物以低浓度存在，所以检测过程中的信号放大是不可避免的。应用于核酸生物传感器的信号放大技术包括诸如HCR(杂交链式反应)和RCA(滚环扩增)等典型方法，并且这种常规的放大方法聚焦于放大在探针识别靶标后产生的信号。然而，使用此技术的生物传感器本质上经历在探针在早期识别靶标后引发反应的过程，并且此过程受到探针与靶分子的扩散和碰撞的影响。特别地，当靶分子的浓度低时，碰撞频率急剧降低，从而阻碍反应或在信号放大步骤中产生噪音。在这种情况下，尽管有后续扩增过程，但存在靶标检测效率降低的问题。
例如，在现有文献中已经提出了具有优异检测效率的探针系统，如HPA(杂交保护测定)、SDA(链置换扩增)、TMA(转录介导的扩增)和DKA(双动力学测定)，并且这些探针系统开发的主要焦点是提高在靶标识别后产生的信号的放大效率。然而，即使在具有优异信号放大效率的系统中，当生物标志物的浓度非常低时，用于靶标检测和信号放大的分子间碰撞/反应频率也会降低，这不利地决定了探针系统的反应性和检测灵敏度的极限，并且尚未为此提出解决方案。
因此，诸位发明人做出了巨大的努力以从根本上改进探针系统的反应性和生物标志物的检测灵敏度极限，开发了整合有多价形式的单链探针序列的新型核酸纳米结构，并且确定基于纳米结构的柔性和由于纳米结构的形成而导致的探针的整合，通过提高探针之间的碰撞频率来改进生物标志物的检测效率，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供包含与靶核酸互补的探针对的核酸纳米结构。
本发明的另一个目的是提供用于检测核酸的组合物，其包含本发明的核酸纳米结构。
本发明的仍另一个目的是提供制备本发明的核酸纳米结构的方法。
本发明的又另一个目的是提供使用本发明的核酸纳米结构检测核酸的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸纳米结构，其中探针-结构链通过结构核酸之间的互补结合而彼此杂交，其中每条探针结构链通过将探针对与所述结构核酸连接而形成，所述探针对具有发夹环并包含与靶核酸特异性结合的核苷酸序列，所述结构核酸包含彼此互补的序列。
本发明提供了一种用于检测靶核酸的组合物，其包含所述核酸纳米结构。
另外，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含用于核酸检测的所述组合物。
另外，本发明提供了一种制备核酸纳米结构的方法，所述方法包括：
(a)构建探针-结构链，其中具有发夹环并包含与靶核酸特异性结合的核苷酸序列的探针对分别与包含彼此互补的序列的结构核酸连接，以及
(b)使所述探针-结构链退火以获得核酸纳米结构。
另外，本发明提供了一种使用所述核酸纳米结构检测靶核酸的方法。
附图说明
图1示出了(a)miR-21扩增检测探针系统的反应过程的示意图，(b)整合到DNA纳米结构中的探针系统的反应过程的示意图，和(c)DNA纳米结构探针系统的碰撞频率和反应性；
图2示出了包含H1和H2基序的DNA纳米结构的合成结果的电泳分析结果，
(a)示出了D-DNA的1x TBE 12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，
(b)示出了T-DNA的1x TBE 5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，
(c)示出了Y-DNA的1x TBE 12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，并且
(d)示出了H-DNA的1x TBE 5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；
图3示出了(a)分离的H1和H2、D-DNA、T-DNA和H-DNA与各种浓度的miR-21的反应的电泳分析结果，其中H1和H2基序的浓度相同(100nM)，(b)示意图(随与miR-21的分子间和分子内反应变化的结构变化)，(c)反应后24小时随miR-21浓度变化的反应程度，和(d)随反应时间变化的检测限，
(e)示出了分离的H1和H2与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应，
(f)示出了D-DNA与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应，
(g)示出了T-DNA与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应，
(h)示出了H-DNA与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应，
α指示通过双重退火合成DNA纳米结构并且H1和H2不是双链的状态，并且
β指示H1和H2通过一般退火而为双链的DNA纳米结构状态；
图4示出了(a)D-DNA、Y-DNA和双臂T-DNA随与miR-21的分子内反应变化的结构变化和用于实时反应测量的荧光染料和猝灭剂的位置信息的结果，(b)在各种miR-21浓度下每种探针系统的初始反应速率，(c)每种探针系统的随反应时间变化的检测限，以及D-DNA(d)、Y-DNA(e)和双臂T-DNA(f)与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应；
图5示出了用于形成DNA纳米结构和分析结构中配对碱基之间的距离的oxDNA核酸模拟程序的参数；
图6示出了通过oxDNA模拟分析得到的D-DNA(a)、T-DNA(b)和H-DNA(c)中的分子H1与H2基序之间的距离；
图7示出了D-DNA、T-DNA和H-DNA中H1与H2基序之间的距离达到特定距离的次数；并且
图8示出了使用斯莫鲁霍夫斯基方程计算的每个DNA纳米结构的H1和H2基序的分子间反应的碰撞频率和通过oxDNA模拟分析推断的每个DNA纳米结构的H1和H2基序的分子内反应的碰撞频率。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域熟知的，并且是典型的。
除非另外指示，否则核酸从左到右在5'→3'方向上阐述。说明书内列举的数值范围包括定义范围的数字，包括所定义范围内的每个整数或任何非整数分数。
尽管在用于测试本发明的实践中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述了优选的材料和方法。
本发明旨在开发用于检测靶核酸的高度灵敏的探针系统，并且当构建包含多价单链探针序列的新型核酸纳米结构并将其用于检测靶核酸时，可以确认基于纳米结构的柔性，通过提高探针之间的碰撞频率来改进生物标志物的检测效率。
本发明的一个方面涉及核酸纳米结构，其中探针-结构链通过结构核酸之间的互补结合而彼此杂交，其中每条探针结构链通过将探针对与所述结构核酸连接而形成，所述探针对具有发夹环并包含与靶核酸特异性结合的核苷酸序列，所述结构核酸包含彼此互补的序列。
如本文所用，术语“核酸纳米结构”包括包含含有与靶核酸互补的序列的探针对、结构核酸、荧光团和猝灭剂的结构。在本发明中，核酸纳米结构可以属于二聚体型(D型)、Y型、四聚体型(T型)或六聚体型(H型)，但是不限于此。
如本文所用，术语“探针”是指这样的核酸片段，如RNA或DNA，其长度对应于数个碱基至数百个碱基，能够与包含特定序列的核酸(例如生物标志物)特异性结合，并且标记探针，使得可以鉴定特定核酸的存在或不存在。可以以寡核苷酸探针、单链DNA探针、RNA探针等形式构建探针。
在本发明中，探针对是一对具有发夹环的单链探针，并且在本说明书中，这些探针被称为“第一探针”和“第二探针”，以区分它们。在本说明书的一部分中，为了便于描述，与靶核酸特异性结合的探针被称为“第一探针”，并且通过即刻分子内反应与第一探针结合的探针被称为“第二探针”，可以通过改变序数的顺序来使用它们。使用诸如“第一”和“第二”等序数来区分构成探针对的探针，不限制权利范围，并且以相同的方式使用以区分“结构核酸”。
在本发明中，探针对的至少一个探针可以包含与互补靶核酸特异性结合的核苷酸序列。
在本发明中，探针对的探针可以包含彼此互补的序列。优选地，对于探针之间的即刻反应，除了一个探针的发夹环之外的部分序列与剩余探针的部分序列互补，并且更优选地，当一个探针的发夹环解开时作为单链暴露的部分序列与剩余探针的部分序列互补(图1和图3)。
如本文所用，术语“结构核酸”是指通过整合探针诱导多价核酸纳米结构的形成的寡核酸。
在本发明中，由于结构核酸包含在其部分中彼此互补的序列，因此可以通过它们之间的杂交形成核酸纳米结构。
在本发明中，当存在三种或更多种结构核酸时，每种结构核酸可以包含与一种或多种其他结构核酸的部分序列互补的序列，所以可以通过它们之间的杂交形成核酸纳米结构。
在本发明中，结构核酸可以原样使用，或者可以通过与探针连接以探针-结构链的形式使用。结构核酸可以包含与全部或部分的两种或更多种其他结构核酸互补的序列，并且核酸纳米结构的形式可以根据其组合而改变。在本发明的一个实施方案中，使用具有SEQID NO:1至SEQ ID NO:9的序列的结构核酸，但是本发明不限于此。
如本文所用，在连接“探针”和“结构核酸”或连接“探针或结构核酸”和“猝灭剂或荧光团”的背景下，术语“连接”意指探针、结构、猝灭剂和荧光团以可以通过本领域普通技术人员容易地掌握的方式连接。“连接”可以使用例如氢键、共价键、电键、范德华键等直接连接，或者可以使用接头等间接连接。在本发明的一个实施方案中，探针和结构核酸以这样的方式连接，其中探针的5'端和结构核酸的3'端使用磷酸二酯键彼此连接，并且探针或结构核酸使用共价键与猝灭剂或荧光团连接，但是本发明不限于此。
如本文所用，使用术语“互补”来描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，在DNA的沃森-克里克碱基配对中，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括由于是基本上相似的核酸序列而“互补”的序列，以及本文公开或使用的完全互补的序列。
在本发明中，“探针”中使用的“彼此互补的序列”独立于“结构核酸”中使用的“彼此互补的序列”。
在本发明中，当构成探针对的两个单链探针中的任一个与靶核酸结合时，其发夹环可以解开。
在本发明中，在与靶核酸结合的探针的发夹环解开后，它可以通过即刻分子内反应与探针对中剩余的探针互补地结合。
在本发明中，当与靶核酸结合的探针通过即刻分子内反应与探针对的剩余探针互补地结合时，剩余探针的发夹环可以解开。
如本文所用，术语“即刻分子内反应”是指当第一探针和第二探针通过互补序列形成键时能够发生的反应，并且由于本发明的核酸纳米结构的形成，即刻分子内反应可以表现出比单个探针分子的反应高得多的反应性。根据每个实施方案，此反应在图1b、图3b和图4a中详细说明。
在本发明中，当构成探针对的两个探针彼此互补地结合时，靶核酸可以分离，并且可以与其他核酸纳米结构反应。
在本发明中，即使当靶核酸由于第一探针和第二探针的结合而分离时，发夹环的形成也被抑制，从而持续维持线性探针的形状并产生检测信号(例如荧光)。
根据本发明的核酸纳米结构在一个结构中包含多价探针序列，所以能够与靶核酸结合的探针在空间上是整合的，并且其分支的数量和柔性高，凭此探针之间的可及性和碰撞频率高，因此提高了对靶核酸的灵敏度并且降低了检测限。
如本文所用，术语“靶核酸”是指作为待检测的靶标的核酸。靶核酸优选地是单链的，并且可以是例如诸如miRNA、siRNA、piwiRNA、snoRNA等短RNA片段，但是不限于此。在本发明中，“靶核酸”优选地是10至40bp的核苷酸序列，但是不限于此。
在一个实施方案中，核酸纳米结构可以包含这样的结构核酸，其中探针与其3'端连接。
在一个实施方案中，核酸纳米结构可以在一个纳米结构中包含一对、两对或三对探针。包含一对探针的结构的例子可以包括在直线的两端包含探针对的各个单链探针的二聚体结构、在三个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的Y型结构和在形成十字形的四个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的双臂四聚体结构；并且在一个结构中包含两对探针的核酸纳米结构可以是在四个双链分支的末端包含探针的四聚体结构；并且在一个结构中包含三对探针的核酸纳米结构可以是包含在六个双链分支的末端交替的每个探针对的单链探针的六聚体结构(图3b和图4a)。
对于本发明的探针对，相同的探针对优选地以一对、两对或三对使用，但是本发明不限于此，并且与相同或不同靶核酸特异性结合的不同探针对可以组合使用。
在本发明中，包含一对探针的核酸纳米结构可以是在直线的两端包含探针对的各个核酸结构模型探针的二聚体型(D型)结构。
在本发明中，二聚体型(D型)结构可以由第一探针-第一结构链和第二探针-第二结构链组成，并且其中包含互补序列的第一结构链和第二结构链可以彼此互补地结合。
在本发明中，包含一对探针的核酸纳米结构可以是在三个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的Y型结构。
在本发明中，Y型结构可以由第一探针-第一结构链、第二结构链和第二探针-第三结构链组成，
其中第一结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸的部分序列互补的序列，第二结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸的部分序列互补的序列，并且第三结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第二结构核酸的部分序列互补的序列。
因此，第一探针-第一结构链、第二结构链和第二探针-第三结构链可以彼此互补地结合。
在本发明中，包含一对探针的核酸纳米结构可以是在形成十字形的四个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的双臂四聚体结构。
在本发明中，双臂四聚体结构可以由第一探针-第一结构链、第二结构链、第三结构链和第二探针-第四结构链组成，并且
其中第一结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第四结构核酸的部分序列互补的序列，第二结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸的部分序列互补的序列，第三结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第四结构核酸的部分序列互补的序列，并且第四结构核酸可以包含与第三结构核酸的部分序列互补的序列和与第一结构核酸的部分序列互补的序列。
因此，第一探针-第一结构链、第二结构链、第三结构链和第二探针-第四结构链可以彼此互补地结合。
在本发明中，包含两对探针的核酸纳米结构可以是在四个双链分支的末端包含两个探针对中的每一个的单链探针的四聚体型(T型)结构。
在本发明中，四聚体型(T型)结构可以由第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链和第二探针-第四结构链组成，并且
其中第一结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第四结构核酸的部分序列互补的序列，第二结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸互补的序列，第三结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第四结构核酸互补的序列，并且第四结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸的部分序列互补的序列。
因此，第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链和第二探针-第四结构链可以彼此互补地结合。
在本发明中，包含三对探针的核酸纳米结构可以是包含在六个双链分支的末端交替的每个探针对的单链探针的六聚体型(H型)结构。
在本发明中，六聚体型(H型)结构可以由第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链、第二探针-第四结构链、第一探针-第五结构链和第二探针-第六结构链组成，并且
其中第一结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第六结构核酸的部分序列互补的序列，第二结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第三结构核酸的部分序列互补的序列，第三结构核酸可以包含与第二结构核酸的部分序列互补的序列和与第四结构核酸的部分序列互补的序列，第四结构核酸可以包含与第三结构核酸的部分序列互补的序列和与第五结构核酸的部分序列互补的序列，第五结构核酸可以包含与第四结构核酸的部分序列互补的序列和与第六结构核酸的部分序列互补的序列，并且第六结构核酸可以包含与第一结构核酸的部分序列互补的序列和与第五结构核酸的部分序列互补的序列。
因此，第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链、第二探针-第四结构链、第一探针-第五结构链和第二探针-第六结构链可以彼此互补地结合。
在一个实施方案中，可以包含与每个探针连接的具有互补构型的结构核酸，与具有发夹环的每个探针连接的结构核酸可以包含互补序列，并且荧光团或猝灭剂可以与探针和结构单链核酸中的每一者的末端连接。
在本发明的一个实施方案中，对于D结构，猝灭剂附着到第一探针的末端，并且荧光团附着到第二结构单链核酸的末端，所以第一探针和第一结构单链核酸与第二探针和第二结构单链核酸互补地结合。当第一探针具有发夹环时，没有检测到显著的荧光信号(图3b中的αD-DNA)。在这里，处于第一结构单链核酸和第二结构单链核酸彼此互补地结合的状态下的第一探针经历与靶核酸序列的分子内反应，从而改变构型，凭此猝灭剂和荧光团变得更远，从而发射荧光信号(图3b的βD-DNA)。
在一个实施方案中，在一个结构中包含一对探针的核酸纳米结构(二聚体结构)可以包含含有第一结构核酸的单链核酸，所述第一结构核酸与探针对的第一探针连接；以及含有第二结构核酸的单链核酸，所述第二结构核酸与探针对的第二探针连接，其中第一结构核酸和第二结构核酸可以彼此互补。
在一个实施方案中，在一个结构中包含一对探针的核酸纳米结构(Y型结构)可以包含含有第一结构核酸的单链核酸，所述第一结构核酸与探针对的第一探针连接；含有第二结构核酸的单链核酸；以及与探针对的第二探针连接的第三结构核酸，其中第一结构核酸可以与第二结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补，第二结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补，并且第三结构核酸可以与第一结构核酸和第二结构核酸的部分序列互补。
在一个实施方案中，在一个结构中包含一对探针的核酸纳米结构(双臂T结构)可以包含含有第一结构核酸的单链核酸，所述第一结构核酸与探针对的第一探针连接；含有第二结构核酸的单链核酸；第三结构核酸；以及与探针对的第二探针连接的第四结构核酸，其中第一结构核酸可以与第二结构核酸和第四结构核酸的部分序列互补，第二结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补，第三结构核酸可以与第二结构核酸和第四结构核酸的部分序列互补，并且第四结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补。
在一个实施方案中，在一个结构中包含两对探针的核酸纳米结构(T结构)可以包含含有第一结构核酸的单链核酸，所述第一结构核酸与探针对的第一探针连接；含有第二结构核酸的单链核酸，所述第二结构核酸与探针对的第二探针连接；与另一个探针对的第一探针连接的第三结构核酸；以及与探针对的第二探针连接的第四结构核酸，其中第一结构核酸可以与第二结构核酸和第四结构核酸的部分序列互补，第二结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补，第三结构核酸可以与第二结构核酸和第四结构核酸的部分序列互补，并且第四结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补。
在一个实施方案中，在一个结构中包含三对探针的核酸纳米结构(H结构)可以包含含有第一结构核酸的单链核酸，所述第一结构核酸与探针对的第一探针连接；含有第二结构核酸的单链核酸，所述第二结构核酸与探针对的第二探针连接；与另一个探针对的第一探针连接的第三结构核酸；与探针对的第二探针连接的第四结构核酸；与再一个探针对的第一探针连接的第五结构核酸；以及与探针对的第二探针连接的第六结构核酸，其中第一结构核酸可以与第二结构核酸和第六结构核酸的部分序列互补，第二结构核酸可以与第一结构核酸和第三结构核酸的部分序列互补，第三结构核酸可以与第二结构核酸和第四结构核酸的部分序列互补，第四结构核酸可以与第三结构核酸和第五结构核酸的部分序列互补，第五结构核酸可以与第四结构核酸和第六结构核酸的部分序列互补，并且第六结构核酸可以与第一结构核酸和第五结构核酸的部分序列互补。
在一个实施方案中，结构核酸可以包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的S1、含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的S2、含有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的S3、含有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的S4、含有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的S5、含有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的S6、含有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的S7、含有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的S8、含有SEQ IDNO:9的核苷酸序列的S9或其组合。在本发明的一个实施方案中，D结构包含S1和S8，T结构包含S1、S2、S3和S4，H结构包含S1、S2、S3、S5、S6和S7，Y结构包含S1、S2和S9，并且双臂T结构包含S1、S2、S3和S4。
在本发明中，核酸纳米结构可以包含猝灭剂和荧光团。
在一个实施方案中，纳米结构可以在其5'端或3'端包含猝灭剂，并且可以在其3'端或5'端包含荧光团。
在一个实施方案中，荧光团可以选自FAM、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、Texas red、Cy5、Cy 5.5、JOE、VIC、NED、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、Quasar 570、Oyster 556、Oyster 645、LC red 640、LC red 670、LC red 705和量子点。
在一个实施方案中，猝灭剂可以选自DDQ-I、DDQ-II、DABCYL、Eclipse、Iowa blackFQ、Iowa black RQ、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、QSY-21、QSY-7、金纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯、FAM、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、Texas red、Cy5、Cy 5.5、JOE、VIC、NED、CAL Fluor Orange560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、Quasar 570、Oyster 556、Oyster 645、LCred 640、LC red 670、LC red 705和量子点。
在一个实施方案中，在本发明的在一个结构中包含与靶核酸互补的探针对的核酸纳米结构中，由于发夹环而不彼此反应的探针对由于靶核酸的催化作用而依次反应，因此发夹环解开并且通过互补结合形成双链，凭此使用每种猝灭剂猝灭的荧光团能够发光。
在一个实施方案中，核酸可以是DNA、RNA或DNA和RNA。
在一个实施方案中，本发明的探针可以使用亚磷酰胺固相支持法或其他熟知的方法化学合成。还可以使用本领域已知的任何手段修饰核酸序列。这种修饰的非限制性例子包括甲基化、包囊化、将一个或多个天然核苷酸用其类似物取代和核苷酸间修饰，例如对不带电荷的缀合物(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的缀合物(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰。
本发明的核酸纳米结构使得反应过程能够通过将作为检测过程的反应物的核酸探针整合到核酸纳米结构中而作为分子内反应而非分子间反应发生。因此，将在溶液中分散的反应物整合到一种分子中，所以使用有限量的催化剂诱导快速且有效的反应，并且不进行反应物的抑制反应的一些扩散过程，导致核酸结构内探针之间的高碰撞频率，最终改进反应性、诊断灵敏度和检测速度。
在一个实施方案中，本发明的核酸纳米结构可以是这样的核酸纳米结构，其包含H1(SEQ ID NO:20)和H2(SEQ ID NO:21)作为靶核酸miR-21(SEQ ID NO:19)的探针对，并且包含S1(SEQ ID NO:1)、S2(SEQ ID NO:2)、S3(SEQ ID NO:3)、S4(SEQ ID NO:4)、S5(SEQ IDNO:5)、S6(SEQ ID NO:6)、S7(SEQ ID NO:7)、S8(SEQ ID NO:8)、S9(SEQ ID NO:9)、S1H1(SEQ ID NO:10)、S2H2(SEQ ID NO:11)、S3H1(SEQ ID NO:12)、S4H2(SEQ ID NO:13)、S5H2(SEQ ID NO:14)、S6H1(SEQ ID NO:15)、S7H2(SEQ ID NO:16)、S8H2(SEQ ID NO:17)、S9H2(SEQ ID NO:18)或其组合作为结构核酸。
本发明的另一个方面涉及用于检测核酸的组合物，其包含所述核酸纳米结构。
如本文所用，术语“样品”包括从受试者或患者获得的组织、细胞、血液、血清、尿液、唾液、血浆或体液，并且组织或细胞样品的来源是来自活组织检查或抽出物的新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或实体组织；血液或任何血液成分；以及在受试者的发育或妊娠的任何点的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。
如本文所用，术语“检测”或“测量”意指量化检测或测量的靶标的浓度。
如本文所用，术语“靶核酸”是指作为待检测的靶标的核酸。靶核酸优选地是单链的，例如诸如miRNA、siRNA、piwiRNA、snoRNA等短RNA片段，但是不限于此。在本发明中，“靶核酸”优选地是10至40bp的核苷酸序列，但是不限于此。
本发明的仍另一个方面涉及诊断试剂盒，其包含本发明的用于检测靶核酸的组合物。
本发明的又另一个方面涉及制备核酸纳米结构的方法，所述方法包括：
(a)构建探针-结构链，其中具有发夹环并具有与靶核酸特异性结合的核苷酸序列的探针对分别与包含彼此互补的序列的结构核酸连接，以及
(b)使所述探针-结构链退火以获得核酸纳米结构。
在一个实施方案中，探针-结构链可以通过以下方式来构建：通过以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃来连接探针和结构核酸。
在一个实施方案中，每条探针-结构链可以设置为500至700nM的浓度，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃，从而构建D结构。
在一个实施方案中，每条探针-结构链可以设置为800至1000nM的浓度，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃，从而构建Y结构。
在一个实施方案中，每条探针-结构链可以设置为1100至1300nM的浓度，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃，从而构建双臂T结构或T结构。
在一个实施方案中，与探针连接的每种结构核酸可以设置为1700至1900nM的浓度，在50℃至60℃下维持3至10分钟，然后以-0.1℃/144秒的速率退火至4℃，从而构建H结构。
在一个实施方案中，可以进行两次退火，以便形成结构的双链分支，同时维持作为核酸纳米结构的一部分的探针对的每条探针单链的发夹环没有解开或没有偶然与其他序列结合的状态。构成结构的单链(对于D结构为两条链，对于T结构为四条链，对于H结构为六条链，对于Y结构为三条链，并且对于双臂T结构为四条链)可以单独退火，从而完成探针单链基序的发夹环，之后可以通过将初始温度设置为低温度使单链退火，使得发夹环没有解开。
本发明的仍又另一个方面涉及使用用于检测核酸的核酸纳米结构或组合物来检测核酸的方法。
实施例
通过以下实施例可以更好地理解本发明。阐述这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围，如对于本领域普通技术人员而言应清楚的。
实施例1.包含检测探针对的DNA纳米结构的合成
1-1.分离的H1和H2的合成
通过用于检测靶核酸miR-21的具有发夹环的探针对H1和H2的等温链置换反应来诱导荧光信号放大。具体地，使用在H1序列的3'端被BHQ2(黑洞猝灭剂2)取代并且在其5'端被Cy5荧光团取代的序列，使得可以基于荧光信号的增加确认发夹环的解开。制备100μL的溶液，其中H1序列的浓度为300nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。也以与上述相同的方式制备H2序列。
1-2.二聚体-DNA(D-DNA)结构的合成
使用用于检测靶核酸miR-21的具有发夹环的探针对H1和H2合成了呈二聚体形式的纳米结构(具有两个双链分支并包含一对H1和H2)。具体地，使用在S1H1序列的3'端被BHQ2(黑洞猝灭剂2)取代和在S8H2序列的5'端被Cy5荧光团取代的序列，使得可以基于荧光信号的增加确认发夹环的解开。制备50μL的每种溶液，其中S1H1或S8H2序列的浓度为600nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。此后，将NaCl(水性)浓度为200mM且序列浓度为600nM的S1H1和S8H2溶液各50μL混合，在热循环仪中在43.5℃下维持5分钟，并且以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃。因此，完成100μL的D-DNA溶液，其中结构的最终浓度为300nM并且NaCl(水性)的最终浓度为200mM。
1-3.四聚体-DNA(T-DNA)结构的合成
使用用于检测靶核酸miR-21的具有发夹环的探针对H1和H2合成了呈四聚体形式的纳米结构(具有四个双链分支并包含两对H1和H2)。具体地，使用在S1H1序列和S3H1序列中的每一个的3'端被BHQ2取代以及在S2H2和S4H2序列中的每一个的5'端被Cy5荧光团取代的序列，并且制备25μL的每种溶液，其中S2H2、S3H1、S4H2或S1H1序列的浓度为1200nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。此后，将NaCl(水性)浓度为200mM且序列浓度为1200nM的S1H1、S2H2、S3H1和S4H2溶液各25μL混合，在热循环仪中在43.5℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从43.5℃退火至4℃，从而完成100μL的T-DNA溶液，其中结构的最终浓度为300nM并且NaCl(水性)的最终浓度为200mM。
1-4.六聚体-DNA(H-DNA)结构的合成
使用用于检测靶核酸miR-21的具有发夹环的探针对H1和H2合成了呈六聚体形式的纳米结构(具有六个双链分支并包含三对H1和H2)。具体地，使用在S1H1序列、S3H1序列和S6H1序列中的每一个的3'端被BHQ2取代以及在S2H2序列、S5H2序列和S7H2序列中的每一个的5'端被Cy5荧光团取代的序列。制备16.7μL的每种溶液，其中S2H2、S3H1、S5H2、S6H1、S7H2或S1H1序列的浓度为1800nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。将NaCl(水性)浓度为200mM且序列浓度为1800nM的如上所述制备的S1H1、S2H2、S3H1、S5H2、S6H1和S7H2溶液各16.7μL混合，在热循环仪中在55℃下维持5分钟，然后以-0.1℃/144秒的速率从55℃退火至4℃。因此，完成100μL的H-DNA溶液，其中结构的最终浓度为300nM并且NaCl(水性)的最终浓度为200mM。
1-5.Y型DNA(Y-DNA)结构的合成
作为包含一对H1和H2基序的DNA纳米结构以用于比较DNA纳米结构的柔性，合成了Y-DNA结构(仅在三个双链分支中的两个分支处包含H1和H2基序)。具体地，使用在S1H1序列的3'端被BHQ2取代和在S9H2序列的5'端被Cy5荧光团取代的序列。制备33.3μL的每种溶液，其中S2、S9H2或S1H1序列的浓度为900nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。将NaCl(水性)浓度为200mM且序列浓度为900nM的如上所述制备的S1H1、S2和S9H2溶液各33.3μL混合，在热循环仪中在43.5℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从43.5℃退火至4℃，从而完成100μL的Y-DNA溶液，其中结构的最终浓度为300nM并且NaCl(水性)的最终浓度为200mM。
1-6.双臂T-DNA结构的合成
作为包含一对H1和H2基序的DNA纳米结构以用于比较DNA纳米结构的柔性，合成了T-DNA结构(仅在四个双链分支中的两个分支处包含H1和H2基序)。具体地，使用在S1H1序列的3'端被BHQ2取代和在S2序列的5'端被Cy5荧光团取代的序列。制备25μL的每种溶液，其中S2、S3、S4H2或S1H1序列的浓度为1200nM并且NaCl(水性)的浓度为200mM，将其在热循环仪中在95℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃。将NaCl(水性)浓度为200mM且序列浓度为1200nM的如上所述制备的H1S1、S2、S3和S4H2溶液各25μL混合，在热循环仪中在43.5℃下维持5分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率从43.5℃退火至4℃。因此，完成100μL的双臂T-DNA溶液，其中结构的最终浓度为300nM并且NaCl(水性)的最终浓度为200mM。
在实施例1中制备和使用的探针对、结构核酸和靶核酸的核苷酸序列示于下表中。
*探针通过以粗体指示的序列的杂交而提供有发夹环。
实施例2.纳米结构合成的确认
为了确认是否合成了在实施例1中构建的D-DNA、T-DNA、H-DNA和Y-DNA结构，进行了1x TBE 5％或12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(1x tris/硼酸盐/EDTA聚丙烯酰胺凝胶电泳)。
基于其结果，如图2所示，发现成功合成了所有的D-DNA、T-DNA、H-DNA和Y-DNA结构(图2)。
实施例3.分离的探针系统和整合到DNA纳米结构中的探针系统与靶材料的反应性的比较
3-1.分离的H1和H2
将16.7μL的溶液(其中NaCl(水性)的浓度为50mM并且miR-21序列的浓度为0nM、30nM、60nM、90nM、120nM、150nM、180nM、210nM、240nM、300nM、450nM或600nM)与在实施例1中合成的分离的300nM H1和H2溶液各16.7μL混合，使得H1和H2各自的最终浓度为100nM，miR-21的最终浓度为0nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、100nM、150nM或200nM，并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。由于可以使用Cy5荧光团和猝灭剂测量H1的发夹环的解开，它代表与miR-21的反应，因此使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图3e)，并且此外，确认了随miR-21浓度变化的探针反应前后的电泳分析(图3a)、反应后24小时随miR-21浓度变化的反应程度(图3c)和随反应时间变化的检测限(图3d)(图3)。
3-2.D-DNA
将16.7μL的200mM NaCl(水性)溶液、16.7μL的溶液(其中miR-21序列的浓度为0nM、30nM、60nM、90nM、120nM、150nM、180nM、210nM、240nM、300nM、450nM或600nM)和16.7μL的在实施例1中合成的300nM D-DNA结构溶液混合，使得结构的最终浓度为100nM并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。此后，使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图3f)，并且此外，确认了随miR-21浓度变化的探针反应前后的电泳分析(图3a)、反应后24小时随miR-21浓度变化的反应程度(图3c)和随反应时间变化的检测限(图3d)(图3)。
3-3.T-DNA
将8.3μL的在实施例1中合成的300nM T-DNA结构溶液与16.7μL的如在以上2-1中的各种浓度的miR-21溶液和25μL的200mM NaCl(水性)溶液混合，使得结构的最终浓度为50nM并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。此后，使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图3g)，并且此外，确认了随miR-21浓度变化的探针反应前后的电泳分析(图3a)、反应后24小时随miR-21浓度变化的反应程度(图3c)和随反应时间变化的检测限(基于临床和实验室标准协会(CLSI)的指南计算的)(图3d)(图3)。基于其结果，通过电泳确认了γ结构。
3-4.H-DNA
将5.5μL的在实施例1中合成的300nM H-DNA结构溶液与16.7μL的如在以上2-1中的各种浓度的miR-21溶液和27.8μL的200mM NaCl(水性)溶液混合，使得结构的最终浓度为33.3nM并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。此后，使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图3h)，并且此外，确认了随miR-21浓度变化的探针反应前后的电泳分析(图3a)、反应后24小时随miR-21浓度变化的反应程度(图3c)和随反应时间变化的检测限(图3d)(图3)。
3-5.分离的H1和H2、D-DNA、T-DNA和H-DNA的最终反应性的比较以及检测限的计算
基于图3的e、f、g和h的结果，其中在24小时内测量随附着到每个序列上的荧光团的荧光强度的变化而变化的H1的发夹环的解开程度(即，每种探针系统的反应程度)，当在假设使用200nM miR-21的每个结构的平衡荧光值为100％下比较已经达到平衡的程度时，在24小时测量的每个结构样品与各种浓度的miR-21的反应程度按H-DNA、T-DNA、D-DNA以及分离的H1和H2的顺序对低浓度miR-21表现出高反应性(图3c)。另外，基于在24小时内测量的随荧光强度的变化而变化的每种探针系统的反应程度，使用下面的公式1根据临床和实验室标准协会(CLSI)的指南计算随反应时间变化的检测限，并且表明与分离的H1和H2相比，发生分子内反应而非分子间反应的D-DNA、T-DNA和H-DNA的检测限显著降低，并且此外，在反应后12小时，显示H-DNA的检测限最低，其次是T-DNA和D-DNA(图3d)。此外，对于在相同浓度(100nM)的H1或H2基序条件下的H-DNA结构，单独的H-DNA结构的浓度低(33.3nM)，并且图1b所示的分子间碰撞频率相对较低，因此与其他探针系统相比，初始速率和反应性降低。
[公式1]
检测限的荧光值＝阴性对照的荧光值+1.645*(阴性对照的荧光值的标准差)+1.645*(低浓度样品的荧光值的标准差)
(阴性对照：miR-21的浓度为0nM的情况；并且低浓度样品：miR-21的浓度为10nM的情况)
3-6.Y-DNA
将16.7μL的在实施例1中合成的300nM Y-DNA结构溶液与16.7μL的如在以上2-1中的各种浓度的miR-21溶液和16.7μL的200mM NaCl(水性)溶液混合，使得结构的最终浓度为100nM并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。此后，使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图4e)，并且此外，确认了初始反应速率(图4b)和随反应时间变化的检测限(图4c)。
3-7.双臂T-DNA
将16.7μL的在实施例1中合成的300nM双臂T-DNA结构溶液与16.7μL的如在以上2-1中的各种浓度的miR-21溶液和16.7μL的200mM NaCl(水性)溶液混合，使得结构的最终浓度为100nM并且NaCl(水性)的最终浓度为150mM。此后，使用光谱仪在37℃下以640nm的波长激发Cy5荧光团，因此在24小时内以3分钟间隔测量670nm的发射波长的强度，凭此确认了与各种浓度的miR-21的时间依赖性反应(图4f)，并且此外，确认了初始反应速率(图4b)和随反应时间变化的检测限(图4c)。
3-8.检测限的计算以及初始反应速率的比较
基于图4的d、e和f的结果，其中在24小时内测量随附着到每个序列上的荧光团的荧光强度的变化而变化的H1的发夹环的解开程度(即，每种探针系统的反应程度)，通过将miR-21浓度下每个结构的图回归到最接近的S形威布尔模型来推导出随时间变化的反应程度的公式，并且使用所述公式计算反应开始后1小时图的斜率(即，反应速率)。结果，关于初始反应速度，其中比较随miR-21浓度变化的反应开始后1小时每种探针系统的反应速率，发现在0nM至40nM的miR-21浓度下，双臂T-DNA的反应速率最快，其次是Y-DNA和D-DNA，并且反应达到饱和，因此在50nM或更高的miR-21浓度下，反应速率按双臂T-DNA、Y-DNA和D-DNA的顺序开始降低(图4b)。另外，基于根据临床和实验室标准协会(CLSI)的指南测量每种探针系统的随反应时间变化的检测限的结果，发现双臂T-DNA的检测限最低，其次是Y-DNA和D-DNA，在H1与H2基序之间的连接位点处具有很大的柔性(图4c)。
实施例4.使用oxDNA模拟程序测量DNA纳米结构中探针之间的距离和计算碰撞频率
4-1.在结构形成过程中配对碱基之间的距离和碰撞频率的计算
为了形成DNA纳米结构和分析结构中配对碱基之间的距离，使用图5所示的参数通过DNA核酸模拟程序分析D-DNA、T-DNA和H-DNA的构型，其中每个结构的H1基序与miR-21结合。具体地，为了在程序上形成每个结构，每个结构中从彼此互补地结合的序列末端起的第二个碱基对通过“陷阱”功能而结合。此外，仅在相对复杂的H-DNA结构中，互陷(mutualtrap)功能被另外应用于从其末端起的第三个碱基对(互陷：能够根据坐标任意缩短两个不同碱基之间的距离，其通常用于在序列之间有效形成双键)。
4-2.结构中配对碱基之间的距离的分析
为了测量在分子内反应过程中整合到DNA纳米结构中的H1与H2基序之间的距离，通过基于序列的分子动力学(MD)模拟测量从与miR-21结合的H1基序的3'端起的第八个碱基(对应于以上4-1中的实际反应起始位点)与从H2基序的5'端起的第一个碱基(H1与H2之间的互补结合开始的碱基对)之间的距离，并且分别测量了D-DNA、T-DNA和H-DNA的一种、四种和九种组合中H1与H2基序之间的距离(图6)。
4-3.H1和H2的有效碰撞频率的计算
在以上4-2中测量的DNA纳米结构中H1与H2基序之间的互补结合开始的配对碱基之间的距离分布中，通过测量oxDNA程序距离单位达到1(在常用的配对碱基之间足以发生有效反应的距离)的时间和次数来计算碰撞频率(图7)。为此，基于图6中测量的基序之间的距离，计算随H1与H2基序之间的距离为1的次数变化的分子内碰撞频率。
实施例5分离的H1和H2的碰撞频率的理论计算
基于水性溶液中的扩散反应，使用斯莫鲁霍夫斯基方程在理论上计算与现有的单链诊断系统相对应的分离的H1与H2探针之间的碰撞频率。具体地，使用液相中的溶质的斯莫鲁霍夫斯基凝聚模型的一部分计算分离的H1和H2的碰撞频率，考虑了通过布朗运动向任何一个粒子分散的粒子数，并且根据菲克定律，一个粒子穿过半径为r的中心粒子周围的所有粒子并最终到达中心粒子的通量(即与中心粒子的碰撞频率)可以通过下面的公式2表示。
[公式2]
F＝4πRDυ0
(F：通量；D：扩散系数(扩散率)；R：两个粒子中心之间的距离；并且υ0：体积浓度)
在这里，假设碰撞粒子具有相同的半径，扩散系数可以使用斯托克斯-爱因斯坦方程通过下面的公式3表示。
[公式3]
D＝2KBT/3πηR
(kB：玻尔兹曼常数；并且η：溶液的粘度)
将公式3代入公式2中，并且根据实验条件假设溶液的粘度为759.873μPa·s，计算出分离的H1和H2的碰撞频率为2710s-1。当将此值与通过实施例4的oxDNA模拟分析推断的每个DNA纳米结构的H1和H2基序的分子内反应中的碰撞频率进行比较时，对于一个miR-21，分离的H1和H2的分子间碰撞频率发生了两次，如图1a所示，但是发现在D-DNA、T-DNA和H-DNA反应过程中发生一次的分子内反应的碰撞频率最少为至少5次，并且最多为至少500次，与分离的H1和H2的分子间反应的碰撞频率一样大。因此，与分离的H1和H2相比，确认了本发明的将H1和H2基序整合到DNA纳米结构中的结构探针系统的反应性高(图8)。可以发现提高的诊断灵敏度是由于整合到结构中的探针序列。
作为两个具有发夹环的基序的H1和H2能够通过等温链置换反应检测miR-21，并且这两个基序参与从检测探针中分离miR-21及其循环利用，这使得能够实现检测信号的放大。在此程序中，分子间反应在探针与miR-21之间发生了两次(图1a)。通过将两个基序H1和H2整合成双链结构，将分离的H1和H2的分子间反应2转化为更即刻且更快的分子内反应(图1b)。由于分离的H1和H2整合到DNA纳米结构中，因此基序之间的碰撞频率增加，从而提高了探针系统的反应性(图1c)。
工业实用性
本发明的核酸纳米结构使得通过探针序列的局部整合能够将一些由于简单扩散而导致的分子间碰撞/反应步骤转化为核酸结构内部的快速反应，所以可以通过结构柔性快速激活核酸结构中的信号放大机制，从而提高检测靶核酸的能力并改进检测效率，最终有效降低靶核酸的最终检测限。
尽管已经如上所述详细公开了本发明的具体实施方案，但对于本领域普通技术人员应清楚的是，描述仅为优选的示例性实施方案的描述，而不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应由所附权利要求及其等同物限定。
[支持本发明的国家研发项目]
[项目标识号]1711090207
[项目编号]2019R1A2C2002390
[部门名称]科学与信息通信技术部
[项目管理(专业)机构名称]韩国国家研究基金会
[研究项目名称](1-2型)中级研究(年均研究费用在1亿至2亿韩元以内)1/3
[研究名称]使用新型拓扑修改的纳米条形码技术的遗传修饰的测序方法的研究与开发(Research and development of genetically modified sequencing methodusing nanobarcoding technology of novel topological modification)
[贡献率]50/100
[项目实施机构名称]成均馆大学(自然科学校区)
[研究期间]2019.03.01～2020.02.29
[支持本发明的国家研发项目]
[项目标识号]465027898
[项目编号]HI16C1984
[部门名称]保健福祉部
[项目管理(专业)机构名称]韩国健康产业振兴院
[研究项目名称]后基因组多部委基因组计划4/4
[研究名称]人源性肺癌全循环基因生物标志物的超高速实时多诊断技术的研究与开发(Research and development of ultrahigh-speed real-time multi-diagnosistechnology for human-derived lung cancer full-cycle gene biomarkers)
[贡献率]30/100
[项目实施机构名称]成均馆大学
[研究期间]2019.01.01～2019.05.23
[支持本发明的国家研发项目]
[项目标识号]1345277212
[项目编号]2017R1D1A1B03027897
[部门名称]教育部
[项目管理(专业)机构名称]韩国国家研究基金会
[研究项目名称]基础研究(1-3年)3/4
[研究名称]能够识别癌细胞特异性微小RNA网络的人工细胞器的制备和人工诱导细胞凋亡的研究(Research on production of artificial organelles capable ofrecognizing cancer cell-specific MicroRNA networks and artificial inductionof apoptosis)
[贡献率]10/100
[项目实施机构名称]成均馆大学
[研究期间]2018.09.01～2019.06.30
[支持本发明的国家研发项目]
[项目标识号]1345286025
[项目编号]2016R1D1A1B03931270
[部门名称]教育部
[项目管理(专业)机构名称]韩国国家研究基金会
[研究项目名称]2016年下半年度基础科学与工程(基础研究)(1～3年)3/4
[研究名称]能够识别癌细胞特异性微小RNA网络的人工细胞器的制备和自发光光热链反应驱动的新型纳米复合药物设计及其前列腺癌治疗研究(Production ofartificial organelles capable of recognizing cancer-cell-specific MicroRNAnetworks and new nanocomposite drug design driven by self-luminous light-heatchain reaction and prostate cancer treatment research thereof)
[贡献率]10/100
[项目实施机构名称]成均馆大学
[研究期间]2018.09.01～2019.06.30
序列表文本文本
附有电子文件。
<110> 蛋白科技先锋
<120> 用于核酸检测的多价核酸纳米结构和使用其的高度灵敏的核酸探针
<130> PP-B2393
<150> KR 2019-0062639
<151> 2019-05-28
<160> 21
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<212> DNA
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<220>
<223> H2
<400> 21
taagctatct acacatggta gcttatcaga ctccatgtgt aga 43
Claims (20)
1.一种核酸纳米结构，其中探针-结构链通过结构核酸之间的互补结合而彼此杂交，其中每条探针结构链通过将探针对与所述结构核酸连接而形成，所述探针对具有发夹环并包含与靶核酸特异性结合的核苷酸序列，所述结构核酸包含彼此互补的序列。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其中所述探针对的探针包含彼此互补的序列。
3.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其中探针与所述结构核酸的3'端连接。
4.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其选自：
(i)包含一对探针的核酸纳米结构；
(ii)包含两对探针的核酸纳米结构；以及
(iii)包含三对探针的核酸纳米结构。
5.根据权利要求4所述的核酸纳米结构，其中包含一对探针的所述核酸纳米结构是在直线的两端包含探针对的各个单链探针的二聚体型(D型)结构，
其中所述二聚体型结构由第一探针-第一结构链和第二探针-第二结构链组成，并且
其中包含互补序列的所述第一结构链和所述第二结构链彼此互补地结合。
6.根据权利要求4所述的核酸纳米结构，其中包含一对探针的所述核酸纳米结构是在三个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的Y型结构，
其中所述Y型结构由第一探针-第一结构链、第二结构链和第二探针-第三结构链组成，其中所述第一结构核酸包含与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，所述第二结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，并且所述第三结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列，并且
其中所述第一探针-第一结构链、所述第二结构链和所述第二探针-第三结构链彼此互补地结合。
7.根据权利要求4所述的核酸纳米结构，其中包含一对探针的所述核酸纳米结构是在形成十字形的四个双链分支中的两个分支的末端包含探针对的各个单链探针的双臂四聚体结构，
其中所述双臂四聚体结构由第一探针-第一结构链、第二结构链、第三结构链和第二探针-第四结构链组成，
其中所述第一结构核酸包含与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列，所述第二结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，所述第三结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列，并且所述第四结构核酸包含与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列，并且
其中所述第一探针-第一结构链、所述第二结构链、所述第三结构链和所述第二探针-第四结构链彼此互补地结合。
8.根据权利要求4所述的核酸纳米结构，其中包含两对探针的所述核酸纳米结构是在四个双链分支的末端包含两个探针对中的每一个的单链探针的四聚体型(T型)结构，其中所述四聚体型结构由第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链和第二探针-第四结构链组成，
其中所述第一结构核酸包含与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列，所述第二结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，所述第三结构核酸包含与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列，并且所述第四结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，并且
其中所述第一探针-第一结构链、所述第二探针-第二结构链、所述第一探针-第三结构链和所述第二探针-第四结构链彼此互补地结合。
9.根据权利要求3所述的核酸纳米结构，其中包含三对探针的所述核酸纳米结构是包含在六个双链分支的末端交替的每个探针对的单链探针的六聚体型(H型)结构，根据权利要求4所述的核酸纳米结构，其中包含三对探针的所述核酸纳米结构是包含在六个双链分支的末端交替的每个探针对的单链探针的六聚体型(H型)结构，
其中所述六聚体型(H型)结构由第一探针-第一结构链、第二探针-第二结构链、第一探针-第三结构链、第二探针-第四结构链、第一探针-第五结构链和第二探针-第六结构链组成，
其中所述第一结构核酸包含与所述第二结构核酸互补的序列和与所述第六结构核酸的部分序列互补的序列，所述第二结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列，所述第三结构核酸包含与所述第二结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列，所述第四结构核酸包含与所述第三结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第五结构核酸的部分序列互补的序列，所述第五结构核酸包含与所述第四结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第六结构核酸的部分序列互补的序列，并且所述第六结构核酸包含与所述第一结构核酸的部分序列互补的序列和与所述第五结构核酸的部分序列互补的序列，并且
其中所述第一探针-第一结构链、所述第二探针-第二结构链、所述第一探针-第三结构链、所述第二探针-第四结构链、所述第一探针-第五结构链和所述第二探针-第六结构链彼此互补地结合。
10.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其中核酸是DNA、RNA或DNA和RNA。
11.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其在其5'端或3'端包含猝灭剂，并且在其3'端或5'端包含荧光团。
12.一种用于检测靶核酸的组合物，其包含根据权利要求1所述的核酸纳米结构。
13.一种诊断试剂盒，其包含根据权利要求12所述的用于检测核酸的组合物。
14.一种制备核酸纳米结构的方法，所述方法包括：
(a)构建探针-结构链，其中具有发夹环并包含与靶核酸特异性结合的核苷酸序列的探针对分别与包含彼此互补的序列的结构核酸连接；以及
(b)使所述探针-结构链退火以获得核酸纳米结构。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(a)中，其中所述探针-结构链通过以下方式来构建：通过以-5℃/30秒的速率从95℃退火至4℃来连接探针和所述结构核酸。
16.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)通过以下方式来进行：将每条探针-结构链的浓度设置为500至700nM，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃。
17.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)通过以下方式来进行：将每条探针-结构链的浓度设置为800至1000nM，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃。
18.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)通过以下方式来进行：将每条探针-结构链的浓度设置为1100至1300nM，在40℃至45℃下维持3至10分钟，然后以-0.5℃/30秒的速率退火至4℃。
19.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)通过以下方式来进行：将每条探针-结构链的浓度设置为1700至1900nM，在50℃至60℃下维持3至10分钟，然后以-0.1℃/144秒的速率退火至4℃。
20.一种使用根据权利要求1所述的纳米结构或根据权利要求12所述的用于检测核酸的组合物来检测靶核酸的方法。
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