JP2022534623A - 核酸検出用多価核酸ナノ構造体及びこれを用いた高感度核酸探針 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ-構造体鎖を作製する段階;及び
(b)前記プローブ-構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖及び第2プローブ-第3構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖、第3構造体鎖及び第2プローブ-第4構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖及び第2プローブ-第4構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第6構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第5構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第5構造体核酸は、第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第6構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第6構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第5構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖、第2プローブ-第4構造体鎖、第1プローブ-第5構造体鎖、及び第2プローブ-第6構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とし得る。
(a)ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を有するプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ-構造体鎖を作製する段階;及び
(b)前記プローブ-構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。
1-1.分離状態H1及びH2の合成
目的核酸であるmiR-21の探知のためのヘアピン(hairpin)構造を有するプローブ対であるH1及びH2を等温鎖置換(isothermal strand displacement)反応によって蛍光信号増幅を誘導した。具体的に、ヘアピン構造の解け(unwinding)を蛍光信号増加から確認できるように、H1配列の3’末端にBHQ2(black hole quencher 2)、5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用し、H1配列の濃度が300nM、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液を100μL作り、熱循環器(thermal cycler)で95℃を5分間維持後に、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。H2配列も同じ方法で準備した。
目的核酸であるmiR-21の探知のためのヘアピン(hairpin)構造を有するプローブ対であるH1及びH2をダイマ-構造(2個の二本鎖腕を有する(1対のH1及びH2含む)。)で有するナノ構造体を合成した。具体的に、ヘアピン構造の解けを蛍光信号増加から確認できるように、S1H1配列の3’末端にBHQ2(black hole quencher 2)、S8H2配列の5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用し、S1H1又はS8H2配列の濃度が600nM、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液をそれぞれ50μL作り、熱循環器で95℃を5分間維持した後、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。その後、NaCl(aq)濃度が200mMで、配列の濃度がそれぞれ600nMであるS1H1及びS8H2溶液を50μLずつ混ぜた後、43.5℃で5分間維持した熱循環器で4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。これにより、最終的に、構造体の濃度が300nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである100μLのD-DNA溶液を完成した。
目的核酸であるmiR-21の探知のためのヘアピン(hairpin)構造を有するプローブ対であるH1及びH2を、テトラマー構造(4個の二本鎖腕を有する(2対のH1及びH2含む)。)で有するナノ構造体を合成した。具体的に、S1H1配列及びS3H1配列の各3’末端にBHQ2が、S2H2配列及びS4H2配列の各5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用し、S2H2、S3H1、S4H2又はS1H1配列の濃度が1200nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液をそれぞれ25μL作り、熱循環器で95℃を5分間維持後に95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。その後、NaCl(aq)濃度が200mMで、配列の濃度が各1200nMであるS1H1、S2H2、S3H1及びS4H2溶液を25μLずつ混ぜた後、43.5℃で5分間維持した熱循環器で43.5℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールし、最終的に、構造体の濃度が300nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである100μLのT-DNA溶液を完成した。
目的核酸であるmiR-21の探知のためのヘアピン(hairpin)構造を有するプローブ対であるH1及びH2をヘキサマー構造(6個の二本鎖腕を有する(3対のH1及びH2含む)。)で有するナノ構造体を合成した。具体的に、S1H1配列、S3H1配列及びS6H1配列の3’末端にBHQ2が、S2H2配列、S5H2配列及びS7H2配列の5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用したし、S2H2、S3H1、S5H2、S6H1、S7H2又はS1H1配列の濃度が1800nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液を16.7μLずつ作り、熱循環器で95℃を5分間維持した後、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。上記で準備した、NaCl(aq)濃度が200mMで、各配列の濃度が各1800nMであるS1H1、S2H2、S3H1、S5H2、S6H1及びS7H2溶液を16.7μLずつ混ぜ、熱循環器で55℃を5分間維持した後、55℃から4℃まで-0.1℃/144秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が300nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである100μLのH-DNA溶液を完成した。
DNAナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のH1及びH2モチーフを含むDNAナノ構造体として、Y-DNA構造体(総3個の二本鎖腕のうち2個の腕にのみH1及びH2モチーフを含む。)を合成した。具体的に、S1H1配列の3’末端にBHQ2が、S9H2配列の5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用し、S2、S9H2又はS1H1配列の濃度が900nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液を33.3μLずつ作り、熱循環器で95℃を5分間維持した後、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。上記のように準備した、NaCl(aq)濃度が200mMで、配列の濃度が各900nMであるS1H1及びS9H2溶液を33.3μLずつ混ぜ、熱循環器で43.5℃を5分間維持した後、43.5℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールすることにより、最終的に、構造体の濃度が300nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである100μLのY-DNA溶液を完成した。
DNAナノ構造体の柔軟性比較のために、一対のH1及びH2モチーフを含むDNAナノ構造体として、T-DNA構造体(総4個の二本鎖腕のうち2個の腕にのみH1及びH2モチーフを含む。)を合成した。具体的に、S1H1配列の3’末端にBHQ2が、S2配列の5’末端にCy5蛍光団が置換された配列を使用し、S2、S3、S4H2又はS1H1配列の濃度が1200nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである溶液をそれぞれ25μL作り、熱循環器で95℃を5分間維持した後、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。このように製造したNaCl(aq)濃度が200mMで、各配列の濃度が各1200nMであるH1S1、S2、S3及びS4H2溶液を25μLずつ混ぜ、熱循環器で43.5℃を5分間維持した後、43.5℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールした。最終的に、構造体の濃度が300nMで、NaCl(aq)の濃度が200mMである100μLの2腕T-DNA溶液を完成した。
前記実施例1で作製したD-DNA、T-DNA、H-DNA及びY-DNA構造体の合成されたか否かを確認するために、1x TBE 5%又は12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(1xトリス/ボレート/EDTAポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行った。
3-1.分離状態H1及びH2
NaCl(aq)の濃度が50mMで、miR-21配列の濃度が各0nM、30nM、60nM、90nM、120nM、150nM、180nM、210nM、240nM、300nM、450nM又は600nMである溶液16.7μLと、前記実施例1で合成した300nMの分離状態のH1及びH2溶液をそれぞれ16.7μLずつ混合し、最終的にH1及びH2の濃度が各100nMで、miR-21の濃度が0nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、100nM、150nM又は200nMであり、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。Cy5蛍光団及び消光剤からmiR-21による反応を示すH1のヘアピン構造の解けを測定可能であるので、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激(excitation)して670nmの放出(emission)波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図3(e))、miR-21濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析(図3(a))、反応24時間後のmiR-21濃度別の反応程度(図3(c))、及び反応時間別検出限界(図3(d))を確認した(図3)。
200mM NaCl(aq)溶液16.7μL、miR-21配列の濃度がそれぞれ0nM、30nM、60nM、90nM、120nM、150nM、180nM、210nM、240nM、300nM、450nM又は600nMである溶液16.7μL、及び前記実施例1で合成した300nMのD-DNA構造体溶液16.7μLを混合し、最終的に、構造体の濃度が100nMで、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。その後、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激して670nmの放出波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図3(f))、miR-21濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析(図3(a))、反応24時間後のmiR-21濃度別の反応程度(図3(c))、及び反応時間別検出限界(図3d)を確認した(図3)。
前記実施例1で合成した300nMのT-DNA構造体溶液8.3μLを、前記2-1におけるように様々な濃度のmiR-21溶液16.7μL及び200mM NaCl(aq)溶液25μLを混合し、最終的に、構造体の濃度が50nMであり、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。その後、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激して670nmの放出波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図3(g))、miR-21濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析(図3(a))し、反応24時間後のmiR-21濃度別の反応程度(図3(c))、及び臨床及び実験標準機関(Clinical and Laboratory Standards Institution,CLSI)のガイドラインに基づいて計算した反応時間別検出限界(図3(d))を確認した(図3)。その結果、電気泳動でγ構造が確認された。
前記実施例1で合成した300nMのH-DNA構造体溶液5.5μLを、前記2-1におけるように様々な濃度のmiR-21溶液16.7μL及び200mM NaCl(aq)溶液27.8μLを混合し、最終的に、構造体の濃度が33.3nMであり、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。その後、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激して670nmの放出波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図3h)、miR-21濃度別プローブの反応前後の電気泳動分析(図3a)、反応24時間後のmiR-21濃度別の反応程度(図3c)、及び反応時間別検出限界(図3d)を確認した(図3)。
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてH1のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を24時間測定した図3の(e)、(f)、(g)及び(h)の結果に基づき、各構造体の様々なmiR-21濃度に対する反応程度測定24時間目の反応程度を、各サンプルの反応程度は各構造体が200nMのmiR-21を使用した場合に到達した平衡状態の蛍光値を100%と仮定し、平衡に到達した程度を用いて比較した結果、H-DNA、T-DNA、D-DNA、及び分離状態H1及びH2の順に低い濃度のmiR-21に対する高い反応程度を示した(図(3c))。また、24時間の間に蛍光強度の変化により測定された各プローブシステムの反応程度に基づき、臨床及び実験標準機関(Clinical and Laboratory Standards Institution,CLSI)のガイドラインに基づき、反応時間別検出限界を下記式1で計算した結果、分離状態のH1及びH2と比較したとき、分子間反応に代えて分子内反応が起きるD-DNA、T-DNA及びH-DNAの検出限界が大幅に減ったことが確認でき、反応12時間後からH-DNA、T-DNA、D-DNAの順に検出限界が低く現れた(図3(d))。なお、同一濃度のH1又はH2モチーフ条件(100nM)において、H-DNAの構造体では、H-DNAの構造体自体の濃度が低い(33.3nM)ため、図1(b)に示した分子間衝突頻度が比較的低く、初期速度及び反応性が他のプローブシステムに比べて低下したことが見られた。
検出限界の蛍光値=陰性対照群の蛍光値+1.645*(陰性対照群の蛍光値の標準偏差)+1.645*(低濃度サンプル蛍光値の標準偏差)
(陰性対照群:miR-21の濃度が0nMである場合;及び低濃度サンプル:miR-21の濃度が10nMである場合)
前記実施例1で合成した300nMのY-DNA構造体溶液16.7μLを、前記2-1におけるように様々な濃度のmiR-21溶液16.7μL及び200mM NaCl(aq)溶液16.7μLを混合し、最終的に、構造体の濃度が100nMで、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。その後、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激し、670nmの放出波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図4(e))、初期反応速度(図4(b))及び反応時間別検出限界(図4(c))を確認した。
前記実施例1で合成した300nMの2腕T-DNA構造体溶液16.7μLを、前記2-1におけるように様々な濃度のmiR-21溶液16.7μL及び200mM NaCl(aq)溶液16.7μLと混合し、最終的に、構造体の濃度が100nMであり、NaCl(aq)の濃度が150mMとなるようにした。その後、37℃で分光器を用いて640nmの波長でCy5蛍光団を刺激し、670nmの放出波長の強度を24時間の間に3分間隔で測定することにより、様々な濃度のmiR-21に対する時間による反応度を確認し(図4(f))、初期反応速度(図4(b))及び反応時間別検出限界(図4(c))を確認した。
各配列に付着した蛍光強度の変化を用いてH1のヘアピン構造の解けた程度、すなわち各プローブシステムの反応程度を24時間の間に測定した図4の(d)、(e)及び(f)の結果に基づき、各構造体の各miR-21濃度におけるグラフを最も近いS字形ウェイブル(weibull)モデルに合わせて回帰して時間による反応程度に対する式を導出し、これにより、グラフの反応開始1時間目の勾配、すなわち反応速度を計算した結果、反応開始から1時間目の各プローブシステム別反応速度をmiR-21濃度によって比較した初期反応速度において、0nMから40nMまでのmiR-21濃度条件では2腕T-DNA、Y-DNA及びD-DNAの順に反応速度が速く現れ、50nM以上のmiR-21濃度条件では2腕T-DNA、Y-DNA、D-DNAの順に反応が飽和状態に到達し、反応速度が減少し始めた(図(4b))。また、臨床及び実験標準機関(Clinical and Laboratory Standards Institution,CLSI)のガイドラインに基づいて各プローブシステムの反応時間別検出限界を導出した結果、H1及びH2モチーフ間の連結部品の柔軟性が大きい2腕T-DNA、Y-DNA及びD-DNAの順に検出限界が低く現れた(図4(c))。
4-1.構造体形成段階の塩基対間の距離及び衝突頻度の計算
DNAナノ構造体の形成と構造体内塩基対間の距離の分析のために、図5に記載されたパラメータを用いたDNA核酸シミュレーションプログラムを用いて、各構造体のH1モチーフがmiR-21と結合した状態のD-DNA、T-DNA及びH-DNAの構造を分析した。具体的に、プログラム上で各構造体を形成するために、各構造体において相補的に結合する配列の末端から2番目の塩基対を“trap”機能によって結んだ。また、構造が比較的複雑なH-DNAの場合にのみ、さらに、末端から三番目の塩基対にもmutual trap機能を適用した(Mutual trap:異なる2塩基の座標上の距離を任意に近づかせる機能で、一般に配列間の円滑な二重結合形成のために用いる機能)。
DNAナノ構造体に集約されたH1、H2モチーフ間の分子内反応時の距離を測定するために、配列ベースのMD(molecular dynamic)シミュレーションを用いて、前記4-1の実際に反応が始まるmiR-21が結合した状態のH1モチーフの3’末端から8番目の塩基とH2モチーフの5’末端から1番目の塩基(H1とH2間の相補結合が始まる塩基対)との間の距離を測定し、D-DNA、T-DNA及びH-DNAはそれぞれ1つ、4つ、9つのH1、H2モチーフ組合せの間の距離を測定した(図6)。
前記4-2で測定したDNAナノ構造体内H1及びH2モチーフ間の相補結合が始まる塩基対間の距離分布のうち、一般に、oxDNAプログラム距離単位1(一般に通用される塩基対間に有効な反応が起こるための十分の距離)に到達する回数と時間を測定し、衝突頻度を計算した(図7)。そのために、図6で測定したモチーフ間の距離に基づき、H1及びH2モチーフ間の距離が1である時の回数を基準に分子内の衝突頻度を計算した。
既存の一本鎖ベースの診断システムに該当する分離状態のH1及びH2のプローブ間衝突頻度は、水溶液内拡散反応に基づくスモルコフスキ方程式によって理論的に計算した。具体的に、スモルコフスキの液相における溶質の凝固モデル(Smoluchowski coagulation model)の一部を用いて分離状態のH1及びH2の衝突頻度を計算し、中心となる一つの粒子に向かってブラウン運動(Brownian motion)によって分散される粒子の個数を考慮し、フィックの法則(Fick’law)により、半径がrである全ての中心粒子を囲んでいる粒子を通過して結局に中心粒子に到達する一つの粒子のフラックス(flux)、すなわち、中心粒子との衝突頻度を、下記式2で示すことができる。
F=4πRDυ0
(F:フラックス(flux);D:拡散係数(diffusivity);R:2粒子の中心間の距離;及びυ0:バルク(bulk)濃度)
D=2KBT/3πηR
(kB:ボルツマン定数;及びη:溶液の粘度)
Claims (20)
- ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を含むプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されてプローブ-構造体鎖をそれぞれ形成し、前記それぞれのプローブ-構造体鎖は、前記構造体核酸間の相補的結合によって互いにハイブリダイズされていることを特徴とする核酸ナノ構造体。
- 前記プローブ対のプローブはそれぞれ、互いに相補的な配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸ナノ構造体。
- 前記構造体核酸の3’末端にプローブが連結されることを特徴とする、請求項1に記載の核酸ナノ構造体。
- 以下の(i)~(iii)からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の核酸ナノ構造体:
(i)1対のプローブを含む核酸ナノ構造体;
(ii)2対のプローブを含む核酸ナノ構造体;及び
(iii)3対のプローブを含む核酸ナノ構造体。 - 前記1対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、直線形の両端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むダイマー型(D型)構造体であって、第1プローブ-第1構造体鎖及び第2プローブ-第2構造体鎖で構成されており、互いに相補的な配列を有する第1構造体鎖と第2構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項4に記載の核酸ナノ構造体。
- 前記1対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、3個の二本鎖腕のうち2個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含むY型構造体であって、
第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖、及び第2プローブ-第3構造体鎖で構成されており、
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖、及び第2プローブ-第3構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項4に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記1対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、十字型の4個の二本鎖腕のうち2個の腕の端にプローブ対の各一本鎖プローブを含む2腕テトラマー(2-Arm Tetramer)構造体であって、
第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖、第3構造体鎖、及び第2プローブ-第4構造体鎖で構成されており、
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、
前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2構造体鎖、第3構造体鎖、及び第2プローブ-第4構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項4に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記2対のプローブを含む核酸ナノ構造体は、4個の二本鎖腕の端に2対のプローブの各一本鎖プローブを含むテトラマー型(T型)構造体であって、
第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖、及び第2プローブ-第4構造体鎖で構成されており、
第1構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖、及び第2プローブ-第4構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項4に記載の核酸ナノ構造体。 - 前記3対のプローブを含む核酸ナノ構造体はプローブ対の各一本鎖プローブを交互に6個の二本鎖腕の端に含むヘキサマー型(H型)構造体であって、
前記3対のプローブを含む核酸ナノ構造体はプローブ対の各一本鎖プローブを交互に6個の二本鎖腕の端に含むヘキサマー型(H型)構造体であって、
第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖、第2プローブ-第4構造体鎖、第1プローブ-第5構造体鎖、及び第2プローブ-第6構造体鎖で構成されており、
第1構造体核酸は、第2構造体核酸と相補的な配列及び第6構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第2構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第3構造体核酸は、第2構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第4構造体核酸は、第3構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第5構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第5構造体核酸は、第4構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第6構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、第6構造体核酸は、第1構造体核酸の一部配列と相補的な配列及び第5構造体核酸の一部配列と相補的な配列を含み、前記第1プローブ-第1構造体鎖、第2プローブ-第2構造体鎖、第1プローブ-第3構造体鎖、第2プローブ-第4構造体鎖、第1プローブ-第5構造体鎖、及び第2プローブ-第6構造体鎖が互いに相補的に結合していることを特徴とする、請求項4に記載の核酸ナノ構造体請求項4に記載の核酸ナノ構造体。 - 核酸は、DNA、RNA、又はDNA及びRNAである、請求項1に記載の核酸ナノ構造体。
- 5’末端又は3’末端に消光剤(quencher)を含み、3’末端又は5’末端に蛍光団(fluorophore)を含む、請求項1に記載の核酸ナノ構造体。
- 請求項1に記載の核酸ナノ構造体を含むターゲット核酸検出用組成物。
- 請求項12に記載の核酸検出用組成物を含む診断キット。
- 次の段階を含む核酸ナノ構造体の製造方法:
(a)ヘアピン構造を有し、ターゲット核酸と特異的に結合する塩基配列を有するプローブ対がそれぞれ互いに相補的な配列を含む構造体核酸と連結されているプローブ-構造体鎖を作製する段階;及び
(b)前記プローブ-構造体鎖を互いにアニールさせ、核酸ナノ構造体を得る段階。 - (a)段階において、プローブ-構造体鎖は、95℃から4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールしてプローブと構造体核酸とを連結することを特徴とする、請求項14に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- (b)段階において、プローブ-構造体鎖の濃度をそれぞれ500~700nMとし、40~45℃で3~10分間維持した後、4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項14に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- (b)段階において、プローブ-構造体鎖の濃度をそれぞれ800~1000nMとし、40~45℃で3~10分間維持した後、4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項14に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- (b)段階において、プローブ-構造体鎖の濃度をそれぞれ1100~1300nMとし、40~45℃で3~10分間維持した後、4℃まで-0.5℃/30秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項14に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- (b)段階において、プローブ-構造体鎖の濃度をそれぞれ1700~1900nMとし、50~60℃で3~10分間維持した後、4℃まで-0.1℃/144秒の速度でアニールすることを特徴とする、請求項14に記載の核酸ナノ構造体の製造方法。
- 請求項1に記載のナノ構造体又は請求項12に記載の核酸検出用組成物を用いたターゲット核酸の検出方法。
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