KR101726238B1 - 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트 - Google Patents
표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머를 준비하는 단계와, (b) 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계와, (c) 상기 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 준비하는 단계와, (d) 상기 변형 제1 프라이머를 이용하여 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 변형 제2 프라이머를 이용하여 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계와, (e) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열과, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 서로 엇갈리게 상보적이 되도록 어닐링시켜 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드를 서로에 대해 연장시키는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 샘플 내에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 검출하는데 있어서 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시키는데 필요한 염기서열 길이 만큼 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 개선된 전기적 특성 변화를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킨 전기적 검출 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 향상된 검출감도 및/또는 표지물질의 신호 증강을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킨 검출 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에도 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장함으로써 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻을 수 있고, 다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석과 SNP 분석에 있어서 매우 유용하게 활용될 수 있는 검출방법에 관한 것이다.
인간의 게놈(genome) 지도가 완성되어 질병에 대한 위험도의 측정, 질병의 진단 또는 예진, 그리고 약물에 대한 반응의 예측을 보다 광범위하게 할 수 있다는 가능성이 제시되었고, 최근에는 다양한 유전자들에 대한 기능들이 밝혀지고 있다.
이러한 다양한 유전자들에 대한 기능 규명에 따라 예를 들어, 특정인의 특정 유전자에 대한 변이분석을 통하여 질병에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 질병을 사전에 예방하도록 유도할 수 있다. 또한, 생명체에 감염을 일으키는 다른 감염체, 예를 들어, 바이러스 등의 유전자 변이 분석을 통하여 해당 바이러스가 특정 치료 약물에 대해 내성을 갖는지 여부를 분석할 수 있고, 이러한 유전자형 분석을 통하여 감염체의 특정 치료 약물에 대한 반응, 예를 들어 내성반응을 예측함으로써 환자 개인별 맞춤형 치료방법을 개발할 수 있다.
그러나, 인간을 비롯한 생명체의 유전자 변이와 질병과의 관계를 명확하게 규명하기 위해서는 많은 수의 염기서열정보를 분석하여야 할 뿐만 아니라, 다양하고 많은 서열의 변이들을 특이도와 민감도를 모두 만족시키면서 정확하고 효과적으로 분석할 수 있어야 한다.
일반적으로 분자유전학적 분석이나 임상진단을 위하여 찾고자 하는 DNA 염기서열은 DNA 중합효소를 이용한 중합효소연쇄반응방법(이하, "PCR"이라 함)을 이용하여 증폭한 후, 샘플 내에 그 존재여부를 결정하게 된다. 이러한 PCR 증폭기술을 이용하여 샘플 내에 찾고자 하는 DNA 염기서열, 즉 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부를 검출하는 다양한 방법들이 개발되어 있다.
예를 들어, 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드를 PCR 증폭한 후 증폭된 서열을 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 수행하는 PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879) 방법이 있으며, 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 프로브를 사전에 제작하여 유리 슬라이드에 마이크로어레이 장비를 이용하여 집적한 DNA 칩을 준비하고 표적 폴리뉴클레오티드를 형광물질이 표지된 특이적 프라이머를 이용하여 증폭한 후 증폭 산물을 DNA 칩에 혼성화시키고 스캐너로 형광신호를 분석하는 방법 등이 있다.
또한, 최근에는 티올기가 부착된 프라이머나 프로브와 같은 올리고뉴클레오티드를 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 금속 전극 표면에 고정한 후 PCR 증폭 반응이나 혼성화 반응을 마이크로플루이딕스 칩 내에서 수행한 후 전기적 변화를 검출하여 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드 존재여부를 검출하는 다양한 방법들이 개발되었다(대한민국 공개특허공보 제10-2004-0042021호, 대한민국 등록특허 제10-0590546호 등 참조).
따라서, 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 민감하면서도 정확하게 검출하기 위해서는 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 검출감도의 향상이 중요하다고 할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭에 사용되는 프라이머와 이러한 프라이머에 의해 증폭된 PCR 증폭산물이 검출감도 및 재현성에 대해 미치는 영향도 매우 크다고 할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드의 정확한 검출과 검출 재현성 확보를 위해서는 가능한 검출대상이 되는 PCR 증폭산물의 단일 가닥의 길이가 긴 것이 유리하지만, 변이가 많이 존재하는 유전자 영역에서는 프라이머 설계가 쉽지 않고 프라이머의 비특이적 혼성화에 의한 위양성 산물이 생성되는 문제점이 있기 때문에 특이적인 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 조합에 의해 PCR 증폭산물의 길이를 제한할 수 밖에 없다.
예를 들어, MEMS(Micro-Electro-Mechanical-System) 기술을 이용하여 제작된 마이크로플루이딕스 칩에서는 금속 전극 표면에 고정된 프라이머나 프로브를 이용하여 PCR 증폭 반응이나 혼성화 반응이 이루어지고, DNA 농도의 증가 또는 혼성화 여부에 따른 전기적 변화, 즉 임피던스 또는 커패시턴스 변화를 검출하여 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드 존재여부를 판정한다. 그러나, 금속 전극 표면에 고정된 프라이머나 프로브에 결합되는 표적 폴리뉴클레오티드는 증폭과정에서 특이적 프라이머의 설계 한계로 충분한 길이를 갖지 못하여 PCR 증폭 반응이나 혼성화 반응 후 전기적 검출 감도가 낮고 이로 인해 재현성도 낮은 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, CMOS 및 전기적 검출값의 증폭을 위한 증폭회로가 추가된 센서가 제작되었으나, 제작과정이 복잡하고 상용화하기에는 제조단가가 증가하는 문제가 있을 뿐만아니라 양성 증폭산물의 신호값 이외에 노이즈 값도 함께 증폭되는 문제가 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 대한민국 등록특허 제10-0969667호에서는 유전상수가 큰 레퍼런스 용액을 이용하여 PCR 반응 또는 혼성화 반응의 유무 및 특정 DNA 염기서열의 존재 유무의 검출 감도를 향상시키는 방법을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0969671호에서는 센싱 금속 전극 표면에 단백질 등의 비특이적 흡착으로 인한 PCR 증폭 방해 및 검출 감도 저하 문제를 해결하기 위해 센싱 금속 전극 표면에 생물친화적인 유전성 박막을 형성한 고감도 바이오 센서를 개시하고 있다.
그러나, 이들 종래기술은 완충용액에 의한 검출 재현성 문제와, 센싱 금속 전극으로의 비특이적 흡착 문제에 초점을 맞추고 있는 것으로서, 표적 폴리뉴클레오티드를 원하는 길이만큼 비특이적 방식으로 연장시켜 전기적, 광학적 또는 전기화학적 검출 감도 및 재현성을 개선하고자 한 것은 아니었다.
또한, 전술한 DNA 칩 역시 공간적인 문제로 발생하는 POL(Position of label; 표지위치) 효과 때문에 PCR 증폭산물의 염기서열 길이가 짧은 경우 정확한 형광 신호 분석이 어렵게 되는 문제가 있다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 샘플 내에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 검출하는데 있어서 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시키는데 필요한 염기서열 길이 만큼 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 새로운 방법의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 샘플 내에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 검출하는데 있어서 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시키는데 필요한 염기서열 길이 만큼 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 목적은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 개선된 전기적 특성 변화를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킨 전기적 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 향상된 검출감도 및/또는 표지물질의 신호 증강을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킨 검출 방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 목적은 다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에도 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장함으로써 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻을 수 있고, 다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석과 SNP 분석에 있어서 매우 유용하게 활용될 수 있는 검출방법을 제공하는 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열[이하, "제1 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 변형 제1 프라이머를 설계하고, 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 상기 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열[이하, "제2 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 변형 제2 프라이머를 설계하여 이용할 경우 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하여 합성할 수 있는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
한편, 본 발명의 변형 제1 프라이머 및 변형 제2 프라이머를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은 본 발명의 실시예에서 일례로서 설명하고 있는 전기적 신호를 이용한 바이오 센서 및 마이크로플루이딕스 칩에만 적용가능한 기술이 아니고, PCR 증폭산물을 이용하여 샘플 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 유무 및 단일염기다형성(SNP)을 분석하는 다양한 기술, 예를 들어 PCR-SSCP, 마이크로어레이 칩, 멀티플렉스 PCR, 리얼타임 PCR, RFLP, 전기영동 기술과 같은 기술에 적용될 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "표적 폴리뉴클레오티드"란 시료 내에서 검출하고자 하는 단일 사슬 또는 이중 사슬의 DNA 또는 RNA로서, 단일염기다형성(SNP) 또는 유전자형 분석에 사용되는 특이적인 염기서열 부분을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "연장용 폴리뉴클레오티드"란 "표적 폴리뉴클레오티드"와는 상보적으로 혼성화되지 않고 "표적 폴리뉴클레오티드"의 존재 유무의 검출 감도 또는 재현성 향상을 위해 "표적 폴리뉴클레오티드"를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 상업적으로 입수할 수 있는 PCR 증폭용 키트에 포함된 DNA 주형이 "연장용 폴리뉴클레오티드"로서 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "변형 제1 프라이머"는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열[이하, "제1 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 프라이머를 의미한다. "변형 제1 프라이머"는 다운스트림 방향으로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하는 정방향의 변형 제1 프라이머와, 업스트림 방향으로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하는 역방향의 변형 제1 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "변형 제2 프라이머"는 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열[이하, "제2 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 프라이머를 의미한다. "변형 제2 프라이머"는 다운스트림 방향으로 연장용 폴리뉴클레오티드를 연장하는 정방향의 변형 제2 프라이머와, 업스트림 방향으로 연장용 폴리뉴클레오티드를 연장하는 역방향의 변형 제2 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 변형 제1 프라이머와 변형 제2 프라이머를 설계할 경우, 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열은 역방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열과 역방향으로 상보적이고(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임), 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열은 정방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열과 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이게 된다 (도 1 참조).
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은,
(a) 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머를 준비하는 단계와,
(b) 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계와,
(c) 상기 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 준비하는 단계와,
(d) 상기 변형 제1 프라이머를 이용하여 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 변형 제2 프라이머를 이용하여 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계와,
(e) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열과, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 서로 엇갈리게 상보적이 되도록 어닐링시켜 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드를 서로에 대해 연장시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드는 고체상 표면에 고정될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 방법에 따르면, 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드 말단과 연장용 폴리뉴클레오티드의 말단이 서로 엇갈리게 상보적이 되면서 어닐링(Annealing)함으로써 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드 각각의 DNA 골격(DNA backbone)은 서로에 대해 PCR 증폭 반응의 프라이머로서 기능하게 되고, 서로 엇갈리게 결합된 염기서열을 중심으로 양쪽 방향으로 연장되는 이중 연장반응(Dual-Extension)이 수행된다. 그 결과, 연장용 폴리뉴클레오티드에 의해 비특이적인 방식으로 연장 및 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드가 생성된다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 변형 제1 프라이머로는 정방향 프라이머 5' 말단에 하나의 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 변형 제2 프라이머로는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드는 이중 사슬 형태로 보관되거나, 마그네틱 비드 등을 이용한 PCR 증폭반응을 진행시켜 단일 사슬로 분리되어 보관될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합의 선택에 따라 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 한쪽 방향으로만 비특이적으로 연장할 수 있다. 또한, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드를 ss-DNA 형태 또는 ds-DNA 형태로 사용하느냐에 따라 표적 폴리뉴클레오티드의 연장 방향을 결정할 수도 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 추가로 증폭하여 준비한 후 이를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 연장시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은 상기 (e) 단계에서 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 상기 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 추가로 연장하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 경우 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 비특이적인 방식으로 연장할 수 있게 된다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은, 다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에도 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장함으로써 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻을 수 있다. 또한, 다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석 및/또는 SNP 분석에 있어서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은,
(a) 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머를 준비하는 단계와,
(b) 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계와,
(c) 상기 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 준비하는 단계와,
(d) 상기 변형 제1 프라이머를 이용하여 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 변형 제2 프라이머를 이용하여 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계와,
(e) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 상보적인 정방향 뉴클레오티드 올리고머를 입자 부착을 위한 기능기로 개질하고, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열에 상보적인 역방향 뉴클레오티드 올리고머를 입자 부착을 위한 기능기로 개질하는 단계와,
(f) 상기 개질된 정방향 뉴클레오티드 올리고머와 역방향 뉴클레오티드 올리고머를 입자에 부착하는 단계와,
(g) 상기 (f) 단계에서 얻은 입자에 부착된 정방향 뉴클레오티드 올리고머는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열과 상보적으로 어닐링되어 연장되고, 상기 (f) 단계에서 얻은 입자에 부착된 역방향 뉴클레오티드 올리고머는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열과 상보적으로 어닐링되어 연장되는 단계를 포함한다.
이와 같은 본 발명의 방법에 따르면, 표적 폴리뉴클레오티드는 입자를 매개로 하여 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계되고 염기서열을 비특이적인 방식으로 원하는 염기서열 길이만큼 연장하여 검출감도를 향상시키는 효과를 갖게 된다.
본 발명의 다른 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법은 상기 (g) 단계에서 입자에 부착된 역방향 뉴클레오티드 올리고머가 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열과 상보적으로 어닐링되어 연장된 염기서열을 재차 상기 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 추가로 연장하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 경우 표적 폴리뉴클레오티드는 입자를 매개로 하여 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계되고 염기서열을 원하는 염기서열 길이만큼 연장하여 검출감도를 향상시킬 수 있게 된다. 특히, 상기 입자에 부착된 뉴클레오티드 올리고머의 개수에 따라 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 연계되는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드의 수를 조정함으로써 검출감도 또는 재현성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서, 상기 입자에 부착된 역방향 뉴클레오티드 올리고머는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 추가로 증폭하여 준비한 후 이러한 추가의 연장용 폴리뉴클레오티드에도 어닐링되어 연장 및 증폭될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물은,
표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머와,
표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물에 있어서, 상기 변형 제1 프라이머는 정방향 프라이머 5' 말단에 하나의 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물에 있어서, 상기 변형 제2 프라이머는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물은, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물에 있어서, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머는 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하고 5' 말단이 고체상 표면에 고정된 프라이머일 수 있다.
예를 들어, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 역방향의 변형 제1 프라이머는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 정방향의 변형 제2 프라이머는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 역방향의 변형 제2 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트는,
DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액과,
표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머와,
표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머와,
상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드로서, 상기 변형 제2 프라이머에 의해 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 추가되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 있어서, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드는 이중 사슬 형태로 보관되거나, 마그네틱 비드 등을 이용한 PCR 증폭반응을 진행시켜 단일 사슬로 분리되어 보관될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트는 상기 변형 제2 프라이머에 의해 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 추가되는 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 있어서, 상기 변형 제1 프라이머는 정방향 프라이머 5' 말단에 하나의 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 있어서, 상기 변형 제2 프라이머는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트는, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합으로 준비될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트에 있어서, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머는 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하고 5' 말단이 고체상 표면에 고정된 프라이머일 수 있다.
예를 들어, 상기 정방향의 변형 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 역방향의 변형 제1 프라이머는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 정방향의 변형 제2 프라이머는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 역방향의 변형 제2 프라이머는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트는, 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 상보적인 정방향 뉴클레오티드 올리고머와 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열에 상보적인 역방향 뉴클레오티드 올리고머가 부착된 입자를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 정방향 뉴클레오티드 올리고머와 역방향 뉴클레오티드 올리고머는 입자 부착을 위한 기능기로 개질된 후 상기 입자에 부착된다. 그리고, 다수개의 정방향 뉴클레오티드 올리고머와 역방향 뉴클레오티드 올리고머가 상기 입자에 부착되는 것이 더욱 바람직하다.
선택적으로, 상기 입자에는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드와 상보적인 추가의 뉴클레오티드 올리고머가 부착될 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 입자는 골드 파티클, 산화철 나노입자, 초상자성체 나노입자, 실리카 나노입자, 자성 비드 또는 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등일 수 있다.
또한, 후술하는 실시예에서 상술하지 않았으나 형광물질과 같은 표지물질을 상기 입자 또는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드에 표지하면 표지물질에 의해 검출 신호를 증강하고 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있다. 입자나 연장용 폴리뉴클레오티드에 표지물질을 표지하는 것은 본 발명의 기술분야에게 알려진 다양한 표지방법을 이용하여 수행할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다(참고문헌: MANJULA KURELLA et al., DNA Microarray Analysis of Complex Biologic Processes, 2001, Journal of the American Society of Nephrology 12: 1072-1078; Danh V. Nguyen et al., DNA Microarray Experiments: Biological and Technological Aspects, December 2002, BIOMETRICS 58: 701-717).
이 경우, 표지물질은 특정 형광물질에 제한되지 않음은 물론이고, 형광 검출기로서 확인이 가능한 다양한 형광물질이 사용될 수 있으며 효소학적 발색반응 및 동위원소 표지도 가능하다. 예를 들어, 표지물질은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드 등일 수 있으며, 형광물질인 Cy3 또는 Cy5인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 방사성 물질 또는 발광성 물질 등 다양한 표지물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 샘플 내에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 검출하는데 있어서 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시키는데 필요한 염기서열 길이 만큼 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장 및 증폭할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 개선된 전기적 특성 변화를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 목적에 따라 비특이적으로 연장하고, 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 향상된 검출감도 및/또는 표지물질의 신호 증강을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부에 대한 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있다.
추가로, 본 발명에 따르면 다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에도 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장함으로써 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻을 수 있고, 다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석과 SNP 분석에 있어서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예의 방법에 따라 정방향의 변형 제1 프라이머와 역방향의 변형 제2프라이머의 조합 그리고 역방향의 변형 제1 프라이머와 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합을 설계하는 방법을 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 변형 제1 프라이머를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 방법에 따라 증폭되는 표적 폴리뉴클레오티드의 예시로서 제시되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 변형 제2 프라이머를 이용하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 증폭된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 연장하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 고체상에 고정된 정방향 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머를 이용하여 고체상에 고정된 상태로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하여 증폭하고, 미리 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 연장하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 고체상에 고정된 정방향 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머를 이용하여 고체상에 고정된 상태로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하여 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클을 매개로 하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계하고 검출감도의 향상을 위해 비특이적인 방식으로 염기서열을 연장하고 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 9는 도 8의 과정에 따라 증폭된 증폭산물을 도시하는 도면이다.
도 10은 표적 폴리뉴클레오티드인 싸이토크롬 CYP2C9*3 유전자를 역방향의 변형 제1 프라이머, 정방향의 변형 제2 프라이머 및 연장용 폴리뉴클레오티드를 사용하는 이중 연장 방식(dual extension)에 의해 PCR 증폭하여 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 연장하는 과정을 설명하는 도면이다. 도 10의 FP는 정방향 프라이머, RP는 역방향 프라이머, Z2 및 Z3는 집코드 서열로서 서로에 대해 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적)인 서열이다.
도 11은 싸이토크롬 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 대립유전자를 종래 방식의 단일 PCR 방법과 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진(왼쪽)과, 도 10의 이중 연장 방식(dual extension)에 의한 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다(오른쪽).
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 변형 제1 프라이머를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 방법에 따라 증폭되는 표적 폴리뉴클레오티드의 예시로서 제시되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 변형 제2 프라이머를 이용하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 증폭된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 연장하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 고체상에 고정된 정방향 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머를 이용하여 고체상에 고정된 상태로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하여 증폭하고, 미리 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 연장하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 고체상에 고정된 정방향 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머를 이용하여 고체상에 고정된 상태로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장하여 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클을 매개로 하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계하고 검출감도의 향상을 위해 비특이적인 방식으로 염기서열을 연장하고 증폭하는 과정을 설명하는 도면이다.
도 9는 도 8의 과정에 따라 증폭된 증폭산물을 도시하는 도면이다.
도 10은 표적 폴리뉴클레오티드인 싸이토크롬 CYP2C9*3 유전자를 역방향의 변형 제1 프라이머, 정방향의 변형 제2 프라이머 및 연장용 폴리뉴클레오티드를 사용하는 이중 연장 방식(dual extension)에 의해 PCR 증폭하여 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 연장하는 과정을 설명하는 도면이다. 도 10의 FP는 정방향 프라이머, RP는 역방향 프라이머, Z2 및 Z3는 집코드 서열로서 서로에 대해 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적)인 서열이다.
도 11은 싸이토크롬 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 대립유전자를 종래 방식의 단일 PCR 방법과 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진(왼쪽)과, 도 10의 이중 연장 방식(dual extension)에 의한 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다(오른쪽).
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 연장
실시예 1-1 (단계 1): 변형 제1 프라이머를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드의 연장
1) 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 DNA의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 DNA와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열[이하, "제1 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 프라이머인 변형 제1 프라이머를 준비한다.
2) 이를 위해, 우선 도 3에 도시된 바와 같은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드를 제작한다. 그리고 나서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 결정한다. 그리고, 정방향 프라이머(5'-GCAGCTCCAATGAGAACCTC-3')의 5' 말단에 하나의 제1 집코드 서열(5'-CCCCAAACGTACCAAGCCCGCGTCG-3')을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머(서열번호 1)를 제작하거나, 역방향 프라이머(5'-AACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3')의 5' 말단에 또 다른 제1 집코드 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머(서열번호 2)를 제작한다(도 2 참조). 본 실시예에서는 이들 정방향의 변형 제1 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머 모두를 제작하였으나, 선택적으로 연장을 원하는 방향의 프라이머만을 집코드 서열을 추가하여 변형시킬 수 있다.
3) 한편, 집코드 서열은 게놈 DNA의 염기서열에 없는 서열을 갖는 뉴클레오티드 올리고머로서 게놈 DNA와 비특이적으로 혼성화되지 않도록 설계된 서열이다. 후술하는 실시예들에서 사용된 집코드 서열들은 오로지 설명을 위한 예시로서 거론된 것이며 본 발명을 제한하기 위한 것이 아님을 밝혀 둔다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 후술하는 실시예들에서 사용된 집코드 서열들 이외에도 당업계에 알려진 다양한 집코드 서열들을 사용하여 프라이머를 변형시킬 수 있음을 용이하게 이해할 것이다(참고문헌: Slentz-Kesler et al., Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension A Microsphere-Based, Genome Res., 2000, 10: 549-557).
이러한 집코드 서열로 변형시켜 제작된 변형 제1 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다. 아래의 변형 제1 프라이머 쌍의 염기서열 중 밑줄친 부분은 집코드 서열이다.
① 정방향의 변형 제1 프라이머:
5'-CCCCAAACGTACCAAGCCCGCGTCGGCAGCTCCAATGAGAACCTC-3' (서열번호 1)
② 역방향의 변형 제1 프라이머:
5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATGAACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3' (서열번호 2)
4) 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입) 12㎕에 상기 2)과정에서 준비된 증폭대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드(서열번호 3) 1㎕와, 상기 2)과정에서 준비된 변형 제1 프라이머 쌍 (서열번호 1 및 서열번호 2) 2㎕를 넣고, 2차 증류수를 9㎕ 추가하여 총 반응부피를 24㎕로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하고, PCR 반응 후 온도를 4℃로 유지한다.
95℃ 5분
95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초 (30 사이클)
72℃ 5분.
5) 도 2에서는 상기 4)과정에서 수행되는 PCR 증폭과정과 증폭산물을 개략적으로 설명하고 있는데, 표적 폴리뉴클레오티드를 일반 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭하였을 경우에는 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물은 407bp의 염기서열 길이를 가지는 반면에, 본 실시예의 변형 제1 프라이머 쌍을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하였을 경우에는 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물은 5' 말단과 3' 말단에 집코드 서열과 이에 상보적인 서열이 추가로 형성되어(407bp + 25bp + 25bp) 457bp의 염기서열 길이를 갖게 된다. 이때, 본 실시예의 변형 제1 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물의 5'말단 및/또는 3'말단에는 임의의 원하고자 하는 염기서열(본 실시예에서는 제1 집코드 서열 또는 이에 상보적인 서열)이 추가적으로 연장되어 생성된다. 이는 후술하는 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열 또는 이에 상보적인 서열과 결합하게 된다.
실시예 1-2 (단계 2): 변형 제2 프라이머를 이용한 연장용 폴리뉴클레오티드의 연장
1) 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않는 연장용 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하는 제2 프라이머의 말단에 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열[이하, "제2 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 프라이머인 변형 제2 프라이머를 준비한다.
2) 본 실시예에서는 Promega 사의 GoTaq® PCR Core System II(Promega, M7665)의 DNA 주형(323bp)을 증폭하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하며, 이러한 연장용 폴리뉴클레오티드는 대량으로 제작되어 보관 사용될 수 있다. 한편, 연장용 폴리뉴클레오티드는 실시예 1-1의 단계 1에서 얻은 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물의 말단에 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시키는데 필요한 염기서열 길이 만큼을 연장하고자 할 때 사용된다.
3) 변형 제2 프라이머의 제작을 위해 연장용 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열로서 상기 DNA 주형의 제조사가 제공하는 프라이머 염기서열을 사용한다. 그리고, 정방향 프라이머(5'-GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3')의 5' 말단에 하나의 제2 집코드 서열(5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCG-3')을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머(서열번호 4)를 제작하거나, 역방향 프라이머(5'-AGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3')의 5' 말단에 또 다른 제2 집코드 서열(5'-CGACGCGGGCTTGGTACGTTTGGGG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머(서열번호 5)를 제작한다(도 4 참조). 본 실시예에서는 이들 정방향의 변형 제2 프라이머와 역방향의 변형 제2 프라이머 모두를 제작하였으나, 선택적으로 연장을 원하는 방향의 프라이머만을 집코드 서열을 추가하여 변형시킬 수 있다.
4) 즉, 도 1에 도시된 바와 같이, 정방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열은 실시예 1-1에서 제작한 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열과 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이 되도록 설계하고, 이를 정방향 프라이머의 5' 말단에 추가하여 정방향의 변형 제2 프라이머를 제작할 수 있다. 또한, 역방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열은 실시예 1-1에서 제작한 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열과 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이 되도록 설계하고, 이를 역방향 프라이머의 5' 말단에 추가하여 역방향의 변형 제2 프라이머를 제작할 수 있다.
이러한 집코드 서열로 변형시켜 제작된 변형 제2 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다. 아래의 변형 제2 프라이머 쌍의 염기서열 중 밑줄친 부분은 집코드 서열이다.
① 정방향의 변형 제2 프라이머:
5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCGGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3' (서열번호 4)
② 역방향의 변형 제2 프라이머:
5'-CGACGCGGGCTTGGTACGTTTGGGGAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3' (서열번호 5)
5) PCR 반응을 수행하기 위해, 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입) 12㎕에 증폭대상이 되는 연장용 폴리뉴클레오티드(GoTaq® PCR Core System II의 DNA 주형) 1㎕와, 상기 3)과정에서 준비된 변형 제2 프라이머 쌍 (서열번호 4 및 서열번호 5) 2㎕를 넣고, 2차 증류수를 9㎕ 추가하여 총 반응부피를 24㎕로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하고, PCR 반응 후 온도를 4℃로 유지한다.
95℃ 5분
95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 (30 사이클)
72℃ 5분.
6) 도 4에서는 상기 5)과정에서 수행되는 PCR 증폭과정과 증폭산물을 개략적으로 설명하고 있는데, GoTaq® PCR Core System II의 DNA 주형을 일반 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭하였을 경우에는 연장용 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물은 323bp의 염기서열 길이를 가지는 반면에, 본 실시예의 변형 제2 프라이머 쌍을 이용하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 증폭하였을 경우에는 연장용 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물은 5' 말단과 3' 말단에 집코드 서열과 이에 상보적인 서열이 추가로 형성되어(323bp + 25bp + 25bp) 373bp의 염기서열 길이를 갖게 된다. 이때, 본 실시예의 변형 제2 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 연장용 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물의 5'말단 및/또는 3'말단에는 실시예 1-1에서 얻은 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 집코드 서열 또는 이에 상보적인 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열(본 실시예에서는 제2 집코드 서열 또는 이에 상보적인 서열)이 추가적으로 연장되어 생성된다.
7) 전술한 바와 같이 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드는 DNA 정제를 통하여 373bp의 ds-DNA로 보관되거나, 목적에 따라 마그네틱 비드 등을 이용한 PCR을 진행시켜 ss-DNA로 분리되어 보관될 수 있다. 마그네틱 비드 등을 이용한 ss-DNA 분리방법은 후술하는 실시예 2-2에서 상술된다.
실시예 1-3 (단계 3): 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 연장
1) 실시예 1-1의 단계 1에서 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭산물은 정제하여 실시예 1-2의 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용한 연장반응에 사용할 수 있고, 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 용액 자체를 이용하여 연장반응에 사용할 수 있다.
2) PCR 반응을 수행하기 위해, 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입) 25㎕에, 단계 1에서 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물 용액 5㎕와, 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물 용액 5㎕를 넣고, 2차 증류수를 15㎕ 추가하여 총 반응부피를 50㎕로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하고, PCR 반응 후 온도를 4℃로 유지한다.
95℃ 5분
95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 (10 사이클)
95℃ 30초, 68℃ 30초, 72℃ 30초 (20 사이클)
72℃ 5분.
3) 도 5에서는 상기 2)과정에서 수행되는 PCR 증폭과정과 증폭산물을 개략적으로 설명하고 있는데, 단계 1에서 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물에 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 ss-DNA 또는 ds-DNA를 첨가하여 전술한 바와 같은 PCR 조건 하에서 PCR 반응을 진행하면, 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드에 있어서 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열에 상보적인 3'말단 서열과, 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드에 있어서 역방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열에 상보적인 3'말단 서열이 서로 엇갈리게 상보적이 되면서 어닐링하게 된다. 이는 전술한 바와 같이 본 발명에서는 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열은 역방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열과 역방향으로 상보적이 되고(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임), 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열은 정방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열과 역방향으로 상보적이 되도록(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임) 변형 제1 프라이머와 변형 제2 프라이머를 설계했기 때문이다.
4) 도 5에 도시된 바와 같이 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단과 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 3' 말단이 서로 엇갈리게 상보적이 되면서 어닐링(Annealing)함으로써 증폭되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드와 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드 각각의 DNA 골격(DNA backbone)은 서로에 대해 PCR 증폭 반응의 프라이머로서 기능하게 되고, 서로 엇갈리게 결합된 염기서열을 중심으로 양쪽 방향으로 연장되는 이중 연장반응(Dual-Extension)이 수행된다. 그 결과, 연장용 폴리뉴클레오티드에 의해 비특이적인 방식으로 연장 및 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드가 생성된다.
5) 한편, 목적에 따라 단계 1과 단계 2에서 프라이머를 선택적으로 변형시킴으로써 선택적으로 정방향의 변형 제1 프라이머와 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 역방향의 변형 제1 프라이머와 정방향의 변형 제2 프라이머를 제작할 수 있고, 이에 따라 한쪽 방향 (5' 방향 또는 3' 방향)으로만 표적 폴리뉴클레오티드를 연장 증폭할 수 있다. 또한, 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 증폭 산물을 ss-DNA 형태 또는 ds-DNA 형태로 첨가하느냐에 따라 표적 폴리뉴클레오티드의 연장 방향을 결정할 수도 있다.
6) 또한, 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 연장시킬 수 있고, 단계 3에서 수득된 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 이용하여 다시 단계 1 부터 단계 3을 반복하면 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 추가로 연장할 수 있다.
7) 한편, 실시예 1-1의 단계 1, 실시예 1-2의 단계 2 및 실시예 1-3의 단계 3은 각각 별개로 수행될 수도 있지만, 동일한 PCR 조건 하에서 한꺼번에 수행될 수 있고 여러 개의 표적 폴리뉴클레오티드들에 대한 멀티플렉스 PCR로 수행될 수도 있다(후술하는 실시예 4 참조). 이때 검출감도를 향상시키고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 제1 집코드 서열 또는 이에 상보적인 서열이 추가되도록 제1 프라이머를 변형시키면 다른 표적 폴리뉴클레오티드들에 대해 뚜렷하게 구별되는 검출신호를 얻을 수 있다(실시예 4 및 도 11 참조).
8) 따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 필요한 염기서열 길이 만큼 연장할 수 있고, 특히 연장대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 종류에 관계없이 비특이적으로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장할 수 있으므로 다양한 샘플 내에 존재하는 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 적용할 수 있는 장점이 있다.
실시예 2: 고체상에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 연장
일례로서, 본 실시예에서는 대칭 또는 비대칭 SP-PCR (Solid Phase-PCR)을 기반으로 하여 목적하는 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭한 후, 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드를 원하는 길이만큼 비특이적인 방식으로 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 연장한다. 금속표면과 같은 고체상 표면에 표적 폴리뉴클레오티드가 고정되는 점을 제외하고는 실시예 1의 방법과 유사하므로 동일한 내용에 대해서는 상세한 설명을 생략한다.
실시예 2-1 (단계 1): 고체상에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 생성
1) 단계 1에서는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 DNA의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 DNA와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열[이하, "제1 집코드 서열(zip code sequence)"이라고도 함]을 추가한 프라이머인 변형 제1 프라이머를 준비한다.
2) 그리고, 일례로서 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머, 예를 들어 정방향 프라이머의 5' 말단에 PEG(폴리에틸렌글리콜) 또는 탄소사슬(-CH2-)의 스페이서를 결합시키고 다시 그 말단에 티올(thiol)기와 같은 기능기를 결합시킨 후, 티올기를 이용한 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 상기 정방향 프라이머를 바이오 센서 칩 내에 형성된 금속 전극 표면과 같은 고체상 표면에 고정시킨다. 당업계에 널리 알려진 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 700㎛ ×700㎛의 크기와 3,000Å의 두께를 갖는 금 박막을 제작하고, 이 위에 정방향 프라이머의 5' 말단을 고정한다. 이러한 금속전극 형성과 뉴클레오티드 올리고머의 금속전극 고정은 당업자라면 공지된 기술에 따라 용이하게 실시할 수 있으므로 그 상세한 설명을 생략한다(대한민국 등록특허 제10-0969667호 및 제10-0969671호 등 참조).
3) 변형 제1 프라이머의 제작을 위해 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 결정한다. 그리고, 정방향 프라이머(5'-GCAGCTCCAATGAGAACCTC-3')의 5' 말단에 하나의 제1 집코드 서열(5'-CCCCAAACGTACCAAGCCCGCGTCG-3')을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머(서열번호 1)를 제작하거나, 역방향 프라이머(5'-AACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3')의 5' 말단에 또 다른 제1 집코드 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머(서열번호 2)를 제작할 수 있다.
4) 다만, 본 실시예에서는 금속 표면과 같은 고체상 표면에 고정되는 프라이머, 즉 정방향의 제1 프라이머는 5'-CCCCAAACGTACCAAGCCCGCGTCG-3'과 같은 집코드 서열을 5'말단에 선택적으로 추가할 수 있으나, 목적하는 표적 폴리뉴클레오티드의 효율적인 증폭을 위해 상기 집코드 서열로 변형하지 않고 표적 폴리뉴클레오티드를 고체상에서 증폭하는 것이 바람직하다. 따라서, 실시예 1-1과 달리 본 실시예 2-1의 단계 1에서 금속 표면과 같은 고체상 표면에 고정되는 정방향의 제1 프라이머는 다음과 같이 집코드로 변형된 서열 또는 변형되지 않은 서열로서 선택적으로 설계될 수 있다.
① 정방향의 변형 제1 프라이머 (밑줄친 부분이 집코드 서열):
5'-SH-PEG-CCCCAAACGTACCAAGCCCGCGTCGGCAGCTCCAATGAGAACCTC-3'
또는
② 정방향의 변형되지 않은 제1 프라이머:
5'-SH-PEG-GCAGCTCCAATGAGAACCTC-3'
5) 또한, 금속 표면과 같은 고체상 표면에 고정되지 않고 자유롭게 PCR 증폭용 완충 용액에 존재하는 역방향의 변형 제1 프라이머는 스페이서와 기능기가 붙어 있지 않은 올리고뉴클레오티드로서, 5' 말단에 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3'과 같은 집코드 서열이 추가되어 설계된 것이다.
※ 역방향의 변형 제1 프라이머:
5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATGAACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3'
6) 한편, 비대칭 SP-PCR 반응을 수행할 경우에는 고체상 표면에 고정되지 않고 자유롭게 PCR 증폭용 완충 용액에 존재하는 정방향의 변형 제1 프라이머 또는 정방향의 변형되지 않은 제1 프라이머도 요구되는데, 이는 고정화된 정방향의 변형 제1 프라이머 또는 고정화된 정방향의 변형되지 않은 제1 프라이머와는 달리 스페이서와 기능기가 붙어 있지 않아 자유롭게 용액 내에 존재하되 비대칭 PCR 반응을 위해 역방향의 변형 제1 프라이머에 비해 상대적으로 낮은 농도, 예를 들어 1:8 또는 1:16 비율로 용액 내에 존재하게 된다.
7) 본 실시예에서는 PCR 반응 조성, 반응 시간 및 반응 온도 설정 등의 PCR 반응 조건을 실시예 1-1에서의 PCR 반응 조성, 반응 시간 및 반응 온도 설정 등의 PCR 반응 조건과 동일하게 하여 PCR 반응을 수행한다. 도 6의 (a) 내지 (e)에서는 본 실시예에서 수행되는 PCR 증폭과정과 증폭산물을 개략적으로 설명하고 있다. 본 실시예에 따르면, 고체상 표면에 고정된 정방향의 제1 프라이머 또는 정방향의 변형 제1 프라이머와, 자유로운 역방향의 변형 제1 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행함으로써 고체상 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물이 생성되는 동시에 그 3'말단에 임의의 원하고자 하는 염기서열(본 실시예에서는 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3'의 집코드 서열에 상보적인 서열인 3'-GCGCGCGTCGACGTCGAACGAGTAC-5')이 추가적으로 연장하여 생성된다(도 6의 (e) 참조). 이는 후술하는 연장용 폴리뉴클레오티드의 증폭과정에서 연장용 폴리뉴클레오티드에 추가적으로 연장되어 생성되는 집코드 서열에 상보적인 서열과 어닐링하게 된다.
실시예 2-2 (단계 2): 단일 사슬의 연장용 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 보관
1) 본 실시예는 실시예 1-2의 단계 2와 유사한 방식으로 연장용 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 보관한다. 즉, Promega 사의 GoTaq® PCR Core System II의 DNA 주형(323bp)을 증폭하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하며, 이러한 연장용 폴리뉴클레오티드는 대량으로 제작되어 보관 사용될 수 있다. 다만, 실시예 1-2의 단계 2와는 달리 증폭된 DNA를 ss-DNA로 보관하는 것이 추천된다. 이는 후술하는 단계 3에서 ds-DNA 보다는 ss-DNA를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적인 방식으로 연장하면 수율 향상과 반응 시간이 단축되는 장점이 있다. 단계 2에서는 증폭된 연장용 폴리뉴클레오티드를 단일 사슬 형태로 분리정제하기 위해 마그네틱 비드(MB)를 사용한다. 이를 설명하면 다음과 같다.
2) 우선, 실시예 1-2에서와 같은 방법으로 정방향의 변형 제2 프라이머(서열번호 4)와, 역방향의 변형 제2 프라이머(서열번호 5)를 준비하되, 역방향의 변형 제2 프라이머는 5'-CGACGCGGGCTTGGTACGTTTGGGGAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3'의 5'말단에 스페이서와 티올기를 결합시켜 고정화를 위한 기능기가 있는 5'-SH-PEG-CGACGCGGGCTTGGTACGTTTGGGGAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3'로서 준비한 후, 이를 마그네틱 비드에 고정화한다. 또한, 정방향의 변형 제2 프라이머인 5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCGGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3'는 실시예 1-2와 같은 방법으로 준비한다.
3) 본 실시예에서는 PCR 반응 조성, 반응 시간 및 반응 온도 설정 등의 PCR 반응 조건을 실시예 1-2에서의 PCR 반응 조성, 반응 시간 및 반응 온도 설정 등의 PCR 반응 조건과 동일하게 하여 PCR 반응을 수행할 수 있다. 즉, 증폭대상이 되는 연장용 폴리뉴클레오티드(GoTaq® PCR Core System II의 DNA 주형)(323bp), 마그네틱 비드에 고정된 역방향의 변형 제2 프라이머, 자유로운 정방향의 변형 제2 프라이머를 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입)에 넣은 후 실시예 1-2와 같은 PCR 조건 하에서 대칭적 PCR 반응 또는 비대칭적 PCR 반응을 수행한다.
4) 상기 3)번 과정에서 30사이클의 PCR 반응 과정이 끝난 후, 자석을 이용하여 마그네틱 비드를 PCR 튜브 아래쪽으로 당겨 고정시킨 후, 상층액을 조심스럽게 제거한다.
5) 그리고 나서, 다시 1X PBS 버퍼를 PCR 튜브에 채운 후, 상기 4)번 과정을 2회 더 실행하고, 마지막으로 3차 증류수를 PCR 튜브에 채운다.
6) 총 3회에 걸쳐 버퍼 교환 작업과 최종적인 3차 증류수로의 교체작업이 끝난 후, PCR 튜브로부터 자석을 제거함으로써 PCR 튜브 내의 3차 증류수에는 마크네틱 비드에 고정된 PCR 증폭산물이 자유롭게 떠 있는 상태로 존재하게 된다. 이러한 PCR 튜브를 약 95℃로 가열하고, 약 95℃에서 온도를 유지하면서 고주파처리(sonication)를 10초 동안 실시한다.
7) 계속 약 95℃의 항온을 유지하면서 다시 자석을 이용하여 마그네틱 비드를 PCR 튜브 바닥으로 끌어 당겨서 고정시킨 후, PCR 튜브의 상층액을 조심스럽게 분리한다. 이와 같이 분리된 연장용 폴리뉴클레오티드는 증폭된 ss-DNA로서 후술하는 단계 3에서의 반응에 필요한 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3' 서열을 추가적으로 갖는다(도 6의 (f) 참조). 이러한 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3' 서열은 전술한 정방향의 변형 제2 프라이머의 집코드 서열인 5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCG-3'에 대해 엇갈리는 방식으로 상보적인 서열이다.
8) 상기 3)번 과정 부터 7)번 과정까지를 반복하여 연장용 폴리뉴클레오티드의 ss-DNA를 대량으로 생산하고 최대한 미량의 물기가 존재할 때까지 진공건조를 수행한 후, UV-vis 스펙트로미터(UV-vis Spectrometer)를 이용하여 ss-DNA 농도를 측정하고, 단계 3에서의 사용을 위해 보관한다.
실시예 2-3 (단계 3): 고체상에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 연장
1) 전술한 바와 같이 실시예 2-1의 단계 1에서 대칭 또는 비대칭 SP-PCR (Solid Phase-PCR)을 기반으로 하여 목적하는 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭한 후, 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드를 실시예 2-2의 단계 2에서 제작하여 보관한 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 원하는 염기서열 길이만큼 연장한다. 바이오 센서 칩 내에 형성된 금속표면과 같은 고체상 표면에 표적 폴리뉴클레오티드가 고정되는 점을 제외하고는 실시예 1-3의 방법과 유사하므로 동일한 내용에 대해서는 상세한 설명을 생략한다.
2) 실시예 2-1의 단계 1에서 SP-PCR로 증폭되어 칩 내의 금속 표면과 같은 고체상 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 사슬을 단일 사슬로 변성시킨다. 이때 칩 내의 용액을 약 95℃로 가열하여 단일사슬로 변성시키면 도 6의 (e) 상태에서 도 6의 (f) 상태로 전환된다.
3) 그리고, 금속 표면에 고정되어 있는 단일 사슬의 표적 폴리뉴클레오티드만을 남기고 변성 과정에 의해 금속 표면으로부터 이탈된 ss-DNA는 약 90℃ 이상에서 세척용 버퍼로 세척하여 완전히 제거한다.
4) 그리고 나서, 질소 가스로 바이오 센서 칩 내에 존재하는 모든 용액을 배출시켜 제거한 후, 실시예 2-2의 단계 2를 통해 사전에 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥을 최종 농도가 2μM가 되도록 PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)에 첨가한 후, 이 혼합용액을 실시예 2-1의 단계 1의 과정이 완료된 바이오 센서 칩 내로 주입한 후 실시예 1-3의 단계 3과 동일한 PCR 조건으로 PCR 반응을 수행한다. 3'-GCGCGCGTCGACGTCGAACGAGTAC-5' 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3'의 집코드 서열에 상보적인 서열)이 3' 말단에 추가된 표적 폴리뉴클레오티드는 이러한 추가 서열에 의해 연장용 폴리뉴클레오티드의 단일 사슬의 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3' 서열과 5'→3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적이 되면서 어닐링하게 된다.
5) 즉, 전술한 바와 같은 PCR 조건 하에서 PCR 반응을 진행하면, 도 6 (e) 및 (f)에 도시된 바와 같이 금속 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드 단일사슬의 3' 말단과, 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 단일 사슬의 3'말단이 서로 엇갈리게 상보적이 되면서 어닐링(Annealing)함으로써 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드 각각의 DNA 골격(DNA backbone)은 서로에 대해 PCR 증폭 반응의 프라이머로서 기능하게 되고, 서로 엇갈리게 결합된 염기서열을 중심으로 양쪽 방향으로 연장되는 이중 연장반응(Dual-Extension)이 수행된다. 그 결과, 연장용 폴리뉴클레오티드에 의해 비특이적인 방식으로 연장된 표적 폴리뉴클레오티드가 생성된다.
6) 또한, 실시예 1의 경우와 같이 단계 2에서 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 연장시킬 수 있고, 단계 3에서 수득된 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 이용하여 다시 단계 1 부터 단계 3을 반복하면 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 원하는 길이만큼 추가로 연장할 수 있다.
7) 따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면 바이오 센서 칩 내의 금속 표면에 고정되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 필요한 염기서열 길이 만큼 연장할 수 있고, 특히 연장대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 종류에 관계없이 비특이적으로 표적 폴리뉴클레오티드를 연장할 수 있으므로 다양한 샘플 내에 존재하는 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 적용할 수 있는 장점이 있다. 특히, 본 발명의 일실시예에 따르면, 바이오 센서 칩 내에서 PCR 증폭을 수행하는 경우에도 PCR 증폭 대상과 무관하게 비특이적으로 표적 증폭 산물의 길이를 충분히 길게 할 수 있어 증폭 전후의 전하의 차이가 커지고 이에 따라 전기적 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있다.
실시예 3: 나노입자를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 검출감도를 향상시키는 방법
일례로서, 본 실시예에서는 대칭 또는 비대칭 SP-PCR (Solid Phase-PCR)을 기반으로 하여 목적하는 표적 폴리뉴클레오티드를 확보하고, 골드 파티클과 같은 나노입자를 매개로 연장용 폴리뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드와 연계시킨 후 염기서열을 원하는 염기서열 길이만큼 비특이적인 방식으로 연장하여 검출감도를 향상시킨다. 골드 파티클과 같은 나노입자를 매개로 연장용 폴리뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드와 연계하는 점을 제외하고는 실시예 2의 방법과 유사하므로 동일한 내용에 대해서는 상세한 설명을 생략한다. 한편, 본 실시예에서는 표적 폴리뉴클레오티드가 금속 표면에 고정된 프라이머에 의해 증폭되는 PCR 반응 칩의 예를 설명하였으나, 본 발명의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드가 금속 표면에 고정된 프로브와 혼성화 반응을 하는 혼성화 반응 칩에도 적용가능하다.
실시예 3-1: 단계 1 및 단계 2의 수행
고체상 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드를 수득하는 과정은 실시예 2-1과 실질적으로 동일한 과정을 거쳐 수행되고(도 7 참조), 단일 사슬의 연장용 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 보관 과정 역시 실시예 2-2와 실질적으로 동일한 과정을 거쳐 수행된다. 따라서, 단계 1 및 단계 2에 대한 상세한 설명은 생략한다.
실시예 3-2: 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머를 골드 파티클에 부착하는 과정
본 실시예에서는 금속표면 상에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 단일 사슬의 3' 말단과, 증폭되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드의 단일사슬의 3'말단이 서로 엇갈리게 상보적이 되도록 어닐링시키지 않고, 골드 파티클과 같은 나노입자를 매개로 하여 연장용 폴리뉴클레오티드를 금속표면 상에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드와 연계시킨다. 이러한 기능을 하는 골드 파티클은 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머를 아래와 같이 부착시켜 준비한다.
1) 우선, 골드 파티클에 부착되는 뉴클레오티드 올리고머를 티올로 개질한다. 이를 위해 실시예 2-1의 단계 1에서 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가적으로 연장된 서열인 3'-GCGCGCGTCGACGTCGAACGAGTAC-5'(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3'의 집코드 서열에 상보적인 서열)에 상보적인 정방향 뉴클레오티드 올리고머 염기서열을 결정하고, 실시예 2-2의 단계 2에서 대량으로 증폭된 단일 사슬의 연장용 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가적으로 연장된 서열인 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3'에 상보적인 역방향 뉴클레오티드 올리고머 염기서열을 결정한 후 각각의 뉴클레오티드 올리고머를 제작한다. 그런 다음, 티올기를 5'말단에 부착하여 개질된 각각의 뉴클레오티드 올리고머로 제작한다. 그런 다음, 이들 뉴클레오티드 올리고머를 DTT(Dithiothreitol)로 환원 처리하여 이들 뉴클레오티드 올리고머 사이에 존재하는 이황화결합(disulfide bond)을 -SH기("-S-S-"→"-SH")로 전환시킴으로써 티올기의 기능기가 부착된 뉴클레오티드 올리고머를 수득한다. 한편, 뉴클레오티드 올리고머는 티올기 이외에도 다양한 나노입자 부착을 위한 기능기, 예를 들어 전도성 폴리머와 같은 기능기로 개질될 수 있다.
2) 상업적으로 입수가능한 직경 20nmm의 골드 파티클 콜로이드(골드 클로라이드 농도 0.01%, 용량 100ml; 영국에 소재하는 BBInternational로 부터 구입) 450㎕를 상기 1)번 과정에서 티올로 개질되고 최종 농도가 1μM로 조정된 뉴클레오티드 올리고머 50㎕와 혼합하여 전체 부피가 500㎕가 되도록 한다. 그리고, 혼합용액을 25℃에서 24시간 동안 인큐베이션하면서 100rpm으로 지속적으로 교반하여 골드 파티클 콜로이드에 뉴클레오티드 올리고머를 고정화시킨다.
3) 그리고 나서, 상기 혼합용액에 에이징 버퍼(Aging Buffer)(0.1M Nacl + 0.01M 소듐 포스페이트) 500㎕를 첨가하고 실온에서 40시간 동안 인큐베이션한다. 또한, 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate)와 1M NaCl로 이루어진 SPSC 버퍼(pH 6.5)로 씻어내어 골드 파티클에 비-공유적으로 결합된 뉴클레오티드 올리고머들을 제거한다.
4) 상기 3)번 과정을 통해 얻은 혼합용액을 30분 동안 13,200rpm으로 원심분리한 후 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클들을 침전시킨 다음 상층액을 제거하고, 재차 에이징 버퍼 500㎕를 첨가하여 혼합한다.
5) 상기 4)번 과정을 2회 반복하여 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클들을 수득한다.
6) 테스트를 위해 전체 용량을 반분한 250㎕를 취하고 UV-vis 스펙트로미터로 골드 파티클의 흡광파장을 측정한다. 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머가 골드 파티클에 부착되기 전과 후의 흡광파장을 비교하면 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머가 골드 파티클에 부착됨으로써 흡광파장이 장파장 쪽으로 이동하게 된다(대한민국 등록특허 제10-0590546호 참조). 따라서, 혼합용액의 색상의 차이로 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머가 골드 파티클에 부착된 정도를 확인할 수 있으며, 부착이 잘 된 경우 적색으로 보이게 된다. 다만, 색상은 pH나 염에 따라 바뀔 수 있다. 한편, UV-vis 스펙트로미터에 의해 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 골드 파티클에 부착된 정도를 확인할 때, 골드 파티클들이 서로 뭉치게 되는 현상을 방지하기 위해 에이징 버퍼를 조금씩 넣고 섞으면서 천천히 첨가하도록 한다.
7) 본 실시예를 통해 수득된 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클들의 혼합용액은 후술하는 단계 3에서의 사용 전에 버퍼를 1X PBS 버퍼로 교체한 후 30분 동안 13,200rpm으로 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음 1X PBS 버퍼 250㎕를 첨가한다. 그리고 이 과정을 1회 더 반복한 후 1X PBS 버퍼를 첨가하여 전체 용량을 250㎕로 맞춘다.
8) 한편, 본 실시예에서는 입자의 일례로서 골드 파티클을 사용하였지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 예를 들어 산화철 나노입자, 초상자성체 나노입자, 실리카 나노입자, 자성 비드, 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등과 같이 당업계에 알려진 다양한 크기와 재질의 입자를 사용할 수 있다. 즉, 치료목적 또는 연구목적으로 당업계에서 널리 사용되고 있는 입자라면 어느 것이라도 사용이 가능하다.
실시예 3-3 (단계 3): 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 비특이적인 염기서열 연장 및 이를 통한 검출감도의 향상
1) 전술한 바와 같이 실시예 3-1의 단계 1에서 대칭 또는 비대칭 SP-PCR (Solid Phase-PCR)을 기반으로 하여 확보된 표적 폴리뉴클레오티드는 실시예 3-2에서 준비된 바와 같은 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클을 매개로 하여 미리 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계된다(도 8 참조).
2) 이를 위해 SP-PCR 과정을 통해 칩 내의 금속 표면과 같은 고체상 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 사슬을 단일 사슬로 변성시킨다. 이때 칩 내의 용액을 약 95℃로 가열하여 단일사슬로 변성시키면 도 7의 (e) 상태에서 도 8의 (f) 상태로 전환된다.
3) 그리고, 실시예 2-3과 같은 방식과 조건으로 PCR 반응을 수행하는데, 실시예 3-2에서 준비된 티올로 개질된 뉴클레오티드 올리고머들이 부착된 골드 파티클을 PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)에 첨가한 후, 이 혼합용액을 상기 2)번 과정이 완료된 바이오 센서 칩 내로 주입한 후 실시예 2-3의 단계 3과 동일한 PCR 조건으로 PCR 반응을 수행한다. 이때, 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머들 중 정방향 뉴클레오티드 올리고머는 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가된 3'-GCGCGCGTCGACGTCGAACGAGTAC-5' 서열과 상보적으로 결합하여 어닐링되고 연장된다(도 8의 (f) 및 (g) 참조).
4) 또한, 실시예 2-2와 같이 사전에 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥을 PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)에 첨가한 후, 이 혼합용액을 상기 3)번 과정이 완료된 바이오 센서 칩 내로 주입한 후 실시예 2-3의 단계 3과 동일한 PCR 조건으로 PCR 반응을 수행한다. 이때, 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머들 중 역방향 뉴클레오티드 올리고머는 연장용 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가된 5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3' 서열과 상보적으로 결합하여 어닐링되고 연장된다(도 8의 (h) 및 도 9 참조).
5) 즉, 전술한 바와 같은 PCR 조건 하에서 PCR 반응을 진행하면, 도 8의 (f)에 도시된 바와 같이 금속 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에, 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머들 중 정방향 뉴클레오티드 올리고머가 어닐링되어 연장됨으로써 금속 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드와 골드 파티클이 1차적으로 결합하게 된다. 그리고 나서, 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머들 중 역방향 뉴클레오티드 올리고머는 사전에 준비된 단일 사슬의 연장용 폴리뉴클레오티드의 3'말단에 어닐링되고 연장됨으로써 골드 파티클과 연장용 폴리뉴클레오티드가 2차적으로 결합된다. 그 결과, 금속 표면에 고정된 표적 폴리뉴클레오티드는 골드 파티클을 매개로 하여 연장용 폴리뉴클레오티드에 의해 비특이적인 방식으로 염기서열이 연장되는 효과를 갖게 된다.
6) 또한, 골드 파티클에 부착된 역방향 뉴클레오티드 올리고머에 어닐링되어 연장된 염기서열은 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 추가로 연장될 수 있다. 이러한 경우 표적 폴리뉴클레오티드는 골드 파티클을 매개로 하여 연장용 폴리뉴클레오티드와 연계되고 비특이적인 방식으로 염기서열을 원하는 염기서열 길이만큼 연장하여 검출감도를 향상시킬 수 있다. 특히, 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머의 개수에 따라 표적 폴리뉴클레오티드와 연계되는 연장용 폴리뉴클레오티드의 수를 조정함으로써 검출감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있다. 뿐만아니라, 골드 파티클에는 단계 2에서 미리 준비된 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드와 상보적인 추가의 역방향 뉴클레오티드 올리고머가 부착될 수 있다.
7) 따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면 골드 파티클에 부착된 뉴클레오티드 올리고머들을 매개로 하여 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드를 연계시킬 수 있고, 이를 통해 표적 폴리뉴클레오티드의 종류에 관계없이 비특이적으로 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 연장하여 검출감도를 향상시킬 수 있을 뿐만아니라 표적 폴리뉴클레오티드와 연계되는 연장용 폴리뉴클레오티드의 수와 길이를 조정할 수 있으므로 다양한 샘플 내에 존재하는 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 적용할 수 있는 장점이 있다. 특히, 본 발명의 일실시예에 따르면, 입자에 부착되는 다수개의 올리고머를 이용하여 염기서열을 비특이적으로 연장하고 이를 통해 검출 감도 또는 검출 재현성을 향상시킬 수 있으며, 실리카 입자와 같은 나노입자나 연장용 폴리뉴클레오티드에 형광물질과 같은 표지물질을 부착하면 광학적 신호와 같은 검출 신호의 증강도 도모할 수 있다.
실시예 4: 표적 폴리뉴클레오티드인 싸이토크롬 유전자의 대립유전자형 분석과 SNP 분석방법
본 실시예에서는 중요 약물대사에 관여하는 것으로 알려진 싸이토크롬 계열의 CYP2C9 및 CYP2C19 유전자의 대립유전자형 분석 및 단일염기다형성(이하, SNP라고 함) 분석에 본 발명이 유용하게 사용될 수 있음을 검증하고자 한다.
실시예 4-1: 표적 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 프라이머 서열결정 및 준비
(1) CYP2C9*3 대립유전자형 증폭을 위한 프라이머 서열결정 및 준비
CYP2C9*3은 291bp의 염기서열 길이를 갖고 싸이토크롬 전체 유전자 지도를 기준으로 1075번째 위치에서 A>C의 SNP를 갖는 대립유전자형이다. 당업계에 널리 알려진 CYP2C9*3 대립유전자형의 염기서열을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드와 프라이머를 준비한다(대한민국 등록번호 제10-1024031호 및 제10-0921793호 참조).
그리고, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 다음과 같이 결정한다.
① CYP2C9*3 정방향 프라이머:
5'-GAGCCACATGCCCTACAC-3' (서열번호 6)
② CYP2C9*3 역방향 프라이머:
5'-ACAAACCTTTATAGCCCCAAAC-3' (서열번호 7)
또한, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 상기 CYP2C9*3 역방향 프라이머(5'-AACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3')의 5' 말단에 제1 집코드 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATGACAAACCTTTATAGCCCCAAAC-3')(서열번호 8)를 제작한다.
(2) CYP2C19*2 대립유전자형 증폭을 위한 프라이머 서열결정 및 준비
CYP2C19*2는 293bp의 염기서열 길이를 갖고(전술한 CYP2C9*3과 크기 유사), 싸이토크롬 전체 유전자 지도를 기준으로 681번째 위치에서 G>A의 SNP를 갖는 대립유전자형이다. 당업계에 널리 알려진 CYP2C19*2 대립유전자형의 염기서열을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드와 프라이머를 준비한다(대한민국 등록번호 제10-1024031호 및 제10-0921793호 참조).
그리고, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 다음과 같이 결정한다.
① CYP2C19*2 정방향 프라이머:
5'-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3' (서열번호 9)
② CYP2C19*2 역방향 프라이머:
5'-AATACGCAAGCAGTCACATAAC-3' (서열번호 10)
또한, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 상기 CYP2C19*2 역방향 프라이머(5'-AATACGCAAGCAGTCACATAAC-3')의 5' 말단에 제1 집코드 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATGAATACGCAAGCAGTCACATAAC-3')(서열번호 11)를 제작한다.
(3) CYP2C19*3 대립유전자형 증폭을 위한 프라이머 서열결정 및 준비
CYP2C19*3은 317bp의 염기서열 길이를 갖고 싸이토크롬 전체 유전자 지도를 기준으로 636번째 위치에서 G>A의 SNP를 갖는 대립유전자형이다. 당업계에 널리 알려진 CYP2C19*3 대립유전자형의 염기서열을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드와 프라이머를 준비한다(대한민국 등록번호 제10-1024031호 및 제10-0921793호 참조).
그리고, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 다음과 같이 결정한다.
① CYP2C19*3 정방향 프라이머:
5'-CACCCTGTGATCCCACTTTC-3' (서열번호 12)
② CYP2C19*3 역방향 프라이머:
5'-AGAACTTTGCCATCTTTTCCAG-3' (서열번호 13)
또한, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 상기 CYP2C19*3 역방향 프라이머(5'-AGAACTTTGCCATCTTTTCCAG-3')의 5' 말단에 제1 집코드 서열(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATG-3')을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머(5'-CGCGCGCAGCTGCAGCTTGCTCATGAGAACTTTGCCATCTTTTCCAG-3')(서열번호 14)를 제작한다.
한편, 본 실시예 4-1에서는 정방향의 변형 제1 프라이머와 역방향의 변형 제1 프라이머 모두를 제작할 수 있으나, 여러 개의 표적 폴리뉴클레오티드들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행할 목적으로, 선택적으로 연장을 원하는 방향, 즉 역방향의 프라이머만을 제1 집코드 서열을 추가하여 변형시켰다. 이러한 역방향의 변형 제1 프라이머는 후술하는 연장용 폴리뉴클레오티드의 정방향의 변형 제2 프라이머와 대응되며, 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열은 후술하는 정방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열에 대해 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이 되도록 설계된다(도 10 참조).
실시예 4-2: 연장용 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 프라이머 서열 결정 및 준비
본 실시예에서는 연장용 폴리뉴클레오티드로서 Promega 사의 GoTaq® PCR Core System II(Promega, M7665)의 DNA 주형(323bp)을 사용한다. 이러한 연장용 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 보관에 대해서는 실시예 1-2 및 실시예 2-2에 상세히 설명되어 있으므로 이에 대한 설명은 생략한다.
그리고, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에 각각 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열을 다음과 같이 결정한다.
① 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 정방향 프라이머:
5'-GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3' (서열번호 15)
② 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 역방향 프라이머:
5'-AGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3' (서열번호 16)
또한, 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드(ES)의 정방향 프라이머(5'-GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3')의 5' 말단에 제2 집코드 서열(5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCG-3')을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머(5'-CATGAGCAAGCTGCAGCTGCGCGCGGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3')(서열번호 4)를 제작한다.
한편, 본 실시예 4-2에서는 정방향의 변형 제2 프라이머와 역방향의 변형 제2 프라이머 모두를 제작할 수 있으나, 여러 개의 표적 폴리뉴클레오티드들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행할 목적으로, 선택적으로 연장을 원하는 방향, 즉 정방향의 프라이머만을 제2 집코드 서열을 추가하여 변형시켰다. 이러한 정방향의 변형 제2 프라이머는 앞서 설명한 표적 폴리뉴클레오티드의 역방향의 변형 제1 프라이머와 대응되며, 정방향의 변형 제2 프라이머의 제2 집코드 서열은 앞서 설명한 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 집코드 서열에 대해 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이 된다(도 10 참조).
실시예 4-3: 싸이토크롬 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 대립유전자형을 종래의 단일 PCR 방법과 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 증폭
1) 본 실시예에서는 실시예 4-1 및 실시예 4-2에서 준비된 CYP2C9*3 게놈 유전자, CYP2C19*2 게놈 유전자, CYP2C19*3 게놈 유전자, 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 그리고 이들을 증폭하기 위한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 단일 PCR(single PCR)과 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 수행하였다.
2) 이를 위해 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입)에 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및/또는 CYP2C19*3 게놈 유전자(gDNA), 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 그리고 이들을 증폭하기 위한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 등을 아래의 표 1과 같은 단일 PCR 조성비 및 멀티플렉스 PCR 조성비로 추가하여 총 반응부피를 20㎕로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하고, PCR 반응 후 온도를 4℃로 유지한다.
95℃ 5분
95℃ 30초, 57℃ 90초, 72℃ 60초 (35 사이클)
72℃ 7분.
| PCR 혼합물 | 부피 (㎕) |
최종
농도 |
||||
| 단일 PCR | 멀티플렉스 PCR | |||||
| 2C9*3 | 2C19*3 | ES |
2C9*3,
2C19*3 |
2C9*3,
2C19*2, 2C19**3, ES |
||
| 2x PCR 마스터 믹스 | 10 | |||||
|
10 μM
정방향 프라이머 |
0.5 | 1 | 2 | 0.25 μM /0.5㎕ | ||
|
10 μM
역방향 프라이머 |
0.5 | 1 | 2 | 0.25 μM /0.5㎕ | ||
| gDNA (100 ng/㎕) | 1 | - | 1 | 1 | 100 ng | |
| 연장용 폴리뉴클레오티드(ES)(1ng/㎕) | - | 1 | - | 1 | 1 ng | |
| D.W. | 8 | 7 | 4 | |||
| 전체 부피 | 20 | |||||
3) 상기 2)번 과정의 단일 PCR과 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 젤 전기영동(1.5% 아가로오즈 겔, 2, 5 및 10㎕의 시료와 3㎕의 마커(100bp) 로딩)을 수행하였다. 그 결과는 도 11의 왼쪽의 전기영동 사진에 도시된 바와 같다. 본 실시예와 같이 종래 방식의 멀티플렉스 PCR을 사용할 경우 싸이토크롬 CYP2C9*3 유전자의 크기(291bp)와 CYP2C19*2 유전자의 크기(293bp)가 거의 같기 때문에 젤 전기영동에서 이들 유전자 증폭산물의 밴드가 겹쳐서 구별할 수 없었다.
실시예 4-4: 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 방법에 의한 싸이토크롬 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 대립유전자형 증폭 및 증폭산물의 밴드 구별
1) 우선, 본 실시예에서는 실시예 4-1 및 실시예 4-2에서 준비된 CYP2C9*3 게놈 유전자, CYP2C19*3 게놈 유전자, 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 그리고 이들을 증폭하기 위한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 실시예 4-3과 동일한 조건으로 단일 PCR을 수행하였다. 단일 PCR 조성비는 아래의 표 2와 같다. 본 과정의 단일 PCR을 수행한 후 젤 전기영동(1.5% 아가로오즈 겔, 2, 5 및 10㎕의 시료와 3㎕의 마커(100bp) 로딩)을 수행하였다. 그 결과는 도 11의 오른쪽의 전기영동 사진에 도시된 바와 같다.
| PCR 혼합물 | 부피 (㎕) |
최종
농도 |
||
| 단일 PCR | ||||
| 2C9*3 | 2C19*3 | ES | ||
| 2x PCR 마스터 믹스 | 10 | |||
|
10 μM
정방향 프라이머 |
0.5 | 0.25 μM | ||
|
10 μM
역방향 프라이머 |
0.5 | 0.25 μM | ||
| gDNA (100 ng/㎕) | 1 | - | 100 ng | |
| 연장용 폴리뉴클레오티드(ES)(1ng/㎕) | - | 0.4 | 0.4 ng | |
| D.W. | 8 | 8.6 | ||
| 전체 부피 | 20 | |||
2) 또한, 2X PCR 마스터 믹스 용액(Master mix solution)(i-StarMAX II)(대한민국 경기도 성남시 소재의 주식회사 인트론 바이오테크놀로지로부터 구입)에 CYP2C9*3, CYP2C19*2 및/또는 CYP2C19*3 게놈 유전자(gDNA), 연장용 폴리뉴클레오티드(ES) 그리고 이들을 증폭하기 위한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 등을 추가하여 총 반응부피를 20㎕로 맞춘 후 실시예 4-3과 동일한 조건으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 단, 실시예 4-3과 다른 점은 아래의 표 3에 도시된 바와 같이 CYP2C9*3 게놈 유전자의 역방향 프라이머와 연장용 폴리뉴클레오티드(ES)의 정방향 프라이머로서 집코드 서열이 추가되어 변형된 변형 프라이머(각각 서열번호 8과 서열번호 4)가 사용된다는 점이다.
| PCR 혼합물 | 부피 (㎕) |
최종
농도 |
||
| 2x PCR 마스터 믹스 | 10 | 1x | ||
| CYP2C9*3 |
10 μM
정방향 프라이머 |
0.6 | 0.3 μM | |
|
1 μM
변형 제1역방향 프라이머 |
0.4 | 0.02 μM | ||
| ES |
5 μM
역방향 프라이머 |
0.4 | 0.1 μM | |
| ES |
0.1 μM
변형 제2정방향 프라이머 |
1 | 0.005 μM | |
|
연장용 폴리뉴클레오티드(ES)
(186 ug/ml) |
1 | 100 ng | ||
| D.W. | 6.6 | |||
| 전체 부피 | 20 | - | ||
3) 즉, 상기 2)번의 멀티플렉스 PCR에서 싸이토크롬 CYP2C9*3 게놈 유전자는 역방향 프라이머로서 서열번호 8의 역방향의 변형 제1 프라이머를 사용하였고, 연장용 폴리뉴클레오티드(ES)는 정방향 프라이머로서 서열번호 4의 정방향의 변형 제2 프라이머를 사용하였다. 따라서, 상기 2)번 과정의 멀티플렉스 PCR에서는 싸이토크롬 CYP2C9*3 게놈 유전자가 도 10에 설명된 바와 같은 이중 연장 방식(dual extension)에 의해 연장되어 증폭하게 된다. 즉, 싸이토크롬 CYP2C9*3 게놈 유전자를 종래 방식으로 증폭할 경우 316bp의 증폭산물이 생성되지만, 도 10의 이중 연장 방식(dual extension)에 의해 증폭할 경우에는 639bp의 증폭산물이 생성된다.
4) 이러한 상기 3)번의 증폭결과를 확인하기 위해 상기 2)번 과정의 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 젤 전기영동(1.5% 아가로오즈 겔, 2, 5 및 10㎕의 시료와 3㎕의 마커(100bp) 로딩)을 수행하였다. 그 결과는 도 11의 오른쪽의 전기영동 사진에 도시된 바와 같다. 종래 방식의 멀티플렉스 PCR을 사용할 경우 싸이토크롬 CYP2C9*3 유전자의 크기(291bp)와 CYP2C19*2 유전자의 크기(293bp)가 거의 같기 때문에 젤 전기영동에서 이들 유전자 증폭산물의 밴드가 겹쳐서 구별할 수 없는 반면에, 도 10의 이중 연장 방식(dual extension)을 활용한 멀티플렉스 PCR로 증폭한 경우에는 싸이토크롬 CYP2C9*3 유전자가 비특이적으로 연장되었기 때문에 CYP2C9*3 유전자 밴드가 CYP2C19*2 유전자 밴드로부터 쉽게 분리되어 분석이 가능함을 알 수 있었다(오른쪽).
5) 따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면 다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에도 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 염기서열의 비특이적 연장이 가능하며 이에 따라 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻을 수 있으며, 이러한 이중 연장 방식(dual extension)을 활용한 멀티플렉스 PCR은 다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석과 SNP 분석에 있어서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> KIM, Sung Jin
<120> Method for non-specifically extending base sequences of target
polynucleotide, primer composition for performing the method and
kit for improving sensitivity of detecting target polynucleotide
<130> P10-0214KR
<150> KR 10-2010-0101064
<151> 2010-10-15
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified first forward primer
<400> 1
ccccaaacgt accaagcccg cgtcggcagc tccaatgaga acctc 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified first reverse primer
<400> 2
cgcgcgcagc tgcagcttgc tcatgaacga aaaggttggg gtcat 45
<210> 3
<211> 407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> target nucleotide for PCR amplification
<400> 3
gcaggtccaa tgagaacctc acctccagcg aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc 60
gcgtgtcccc aagccccacc acctaccgca tgttccggga caaaagccgc tctccctcgc 120
agaactcgca acagtccttc gacagcagca gtccccccac gccgcagtgc cataagcggc 180
accggcactg cccggttgtc gtgtccgagg ccaccatcgt gggcgtccgc aagaccgggc 240
agatctggcc caacgatggc gagggcgcct tccatggaga cgcagaagcc cttcagcggc 300
cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg 360
aaaaccttct cgctggaccc agtgaaaatg accccaacct tttcgtt 407
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified second forward primer
<400> 4
catgagcaag ctgcagctgc gcgcggccat tctcaccgga ttcagtcgtc 50
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified second reverse primer
<400> 5
cgacgcgggc ttggtacgtt tggggagccg ccgtcccgtc aagtcag 47
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C9*3 Forward primer
<400> 6
gagccacatg ccctacac 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C9*3 Reverse primer
<400> 7
acaaaccttt atagccccaa ac 22
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C9*3 modified first reverse primer
<400> 8
cgcgcgcagc tgcagcttgc tcatgacaaa cctttatagc cccaaac 47
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*2 Forward primer
<400> 9
ccagagcttg gcatattgta tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*2 Reverse primer
<400> 10
aatacgcaag cagtcacata ac 22
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*2 modified first reverse primer
<400> 11
cgcgcgcagc tgcagcttgc tcatgaatac gcaagcagtc acataac 47
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*3 Forward primer
<400> 12
caccctgtga tcccactttc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*3 Reverse primer
<400> 13
agaactttgc catcttttcc ag 22
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP2C19*3 modified first reverse primer
<400> 14
cgcgcgcagc tgcagcttgc tcatgagaac tttgccatct tttccag 47
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ES Forward primer
<400> 15
gccattctca ccggattcag tcgtc 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ES Reverse primer
<400> 16
agccgccgtc ccgtcaagtc ag 22
Claims (27)
- 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법에 있어서,
(a) 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머를 준비하는 단계와,
(b) 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계와,
(c) 상기 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 준비하는 단계와,
(d) 상기 변형 제1 프라이머를 이용하여 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 변형 제2 프라이머를 이용하여 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열이 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가되어 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계와,
(e) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열과, 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 말단에 추가된 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 서로 엇갈리게 상보적이 되도록 어닐링시켜 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드와 연장용 폴리뉴클레오티드를 서로에 대해 연장시키는 단계를 포함하고,
상기 변형 제1 프라이머로는 정방향 프라이머 5' 말단에 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 사용하며,
상기 변형 제2 프라이머로는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드는 고체상 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합의 선택에 따라 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 한쪽 방향으로만 비특이적으로 연장하는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드는 이중 사슬 형태로 사용되거나, 마그네틱 비드를 이용한 PCR 증폭반응을 진행시켜 단일 사슬로 분리되어 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 연장된 연장용 폴리뉴클레오티드를 이중 사슬 형태 또는 단일 사슬 형태로 사용하는지 여부에 따라 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 연장 방향을 결정하는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 연장되어 수득된 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드를 추가로 증폭하여 준비한 후 이를 이용하여 상기 (d) 단계에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 연장시키는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 연장된 표적 폴리뉴클레오티드를 상기 연장용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 추가로 연장하는 단계를 더 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머와,
표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머를 포함하고,
상기 변형 제1 프라이머는 정방향 프라이머 5' 말단에 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 포함하며,
상기 변형 제2 프라이머는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제14항에 있어서,
상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합으로 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하기 위한 프라이머 조성물. - DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액과,
표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않는 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제1 프라이머와,
표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 제2 프라이머의 말단에, 게놈 유전자의 염기서열과 상동성을 갖지 않는 염기서열로서 게놈 유전자와 상보적으로 혼성화되지 않고 상기 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 추가한 변형 제2 프라이머와,
상기 표적 폴리뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되지 않으며 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 비특이적으로 연장하는데 사용되는 연장용 폴리뉴클레오티드로서, 상기 변형 제2 프라이머에 의해 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열이 추가되는 연장용 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
상기 변형 제1 프라이머는 정방향 프라이머 5' 말단에 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제1 프라이머, 또는 역방향 프라이머의 5' 말단에 또 다른 제1 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제1 프라이머, 또는 이들 모두를 포함하며,
상기 변형 제2 프라이머는 역방향 프라이머 5' 말단에 상기 정방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 역방향의 변형 제2 프라이머, 또는 정방향 프라이머 5' 말단에 상기 역방향의 변형 제1 프라이머의 제1 비상동성 염기서열과 역방향으로 상보적인 제2 비상동성 염기서열을 추가하여 변형시킨 정방향의 변형 제2 프라이머, 또는 이들 모두를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 제18항에 있어서,
상기 연장용 폴리뉴클레오티드는 이중 사슬 형태로 사용되거나, 마그네틱 비드를 이용한 PCR 증폭반응을 진행시켜 단일 사슬로 분리되어 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 삭제
- 삭제
- 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 정방향의 변형 제1 프라이머와 상기 역방향의 변형 제2 프라이머의 조합, 또는 상기 역방향의 변형 제1 프라이머와 상기 정방향의 변형 제2 프라이머의 조합으로 준비되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 제1 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 상보적인 정방향 뉴클레오티드 올리고머와 상기 제2 비상동성 염기서열 또는 이에 상보적인 서열에 상보적인 역방향 뉴클레오티드 올리고머가 부착된 입자를 추가로 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 제23항에 있어서,
상기 입자에는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드 외에 다른 서열을 갖는 연장용 폴리뉴클레오티드와 상보적인 추가의 뉴클레오티드 올리고머가 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 제23항에 있어서,
상기 입자 또는 상기 연장용 폴리뉴클레오티드는 신호증강을 위한 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트. - 제1항에 있어서,
다수 개의 유전자 주형들에 대한 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우, 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장함으로써 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 향상된 검출감도를 얻는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법. - 제1항 또는 제26항에 있어서,
다수 개의 대립유전자형을 가진 특정 유전자의 유전자형 분석 또는 SNP 분석에 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법.
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